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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN
MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Fisiología Veterinaria
Protocolo Utilidad regenerativa del Dimetilsulfóxido en Mus musculus con lesión medular: Evaluación electromiográfica
Equipo No. 3
Grupo: 1353
Alumnos: ● César Hernández Sandra ___________________ ● Espinosa Gochez Marco Antonio ___________________ ● Flores Olguin Jonathan Antonio ___________________ ● Jaimes Pérez Victoria ___________________ ● Marmolejo Batres Valeria ___________________ ● Pereyda Hernández Itzel Guadalupe ___________________ ● Rojas Ruiz Brenda Itzel ___________________ ● Vargas Alanis Josué ___________________
Asesores:
MVZ. Luis Rodolfo Vázquez Huante MVZ. Patrocinio Cruz Arellano MVZ. Victor David González Fernández
Fecha de entrega: 6 de septiembre de 2018
Índice
- Introducción _________________________________________________
- 1.1 Ratón ___________________________________________________
- 1.2 Sistema Nervioso __________________________________________
- 1.2.1 Sistema nervioso central ______________________________
- 1.3 Trauma medular ___________________________________________ 1.2.2 Sistema nervioso periférico ____________________________
- 1.3.1 Manejo inicial de la lesión medular _____________________
- 1.4 Electromiografía ___________________________________________
- 1.4.1 Musculo Estriado Esqueletico __________________________
- 1.4.2 Elementos del electromiograma _______________________
- 1.4.3 Análisis del electromiograma _________________________
- 1.5 Dimetil Sulfóxido _________________________________________
- Objetivos ___________________________________________________
- 2.1 Objetivo general ___________________________________________
- Hipótesis experimental _________________________________________
- Materiales y métodos __________________________________________
- Análisis estadístico ___________________________________________
- Cronograma de actividades _____________________________________
- Bibliografía __________________________________________________
nervioso se divide en dos grandes subsistemas: el sistema nervioso central; y sistema nervioso periférico (Ganong, 2016).
1.2.1 Sistema nervioso central
El sistema nervioso central (SNC) está formado por el cerebro y médula espinal y se encuentra rodeado por una serie de huesos. El cerebro está cubierto por el cráneo y la médula espinal por las vértebras cervicales, torácicas y lumbares, además de ligamentos. El SNC puede dividirse en seis regiones: la médula espinal y cinco regiones cerebrales principales que son. el bulbo raquídeo, la protuberancia, el mesencéfalo, el diencéfalo y el telencéfalo. El bulbo raquídeo, la protuberancia y el mesencéfalo forman el tronco del encéfalo y el diencéfalo y el telencéfalo forman el prosencéfalo. La médula espinal es la porción caudal del SNC que presenta un aspecto cilíndrico de superficie irregular de color amarillo pálido, inicia desde la primera vértebra cervical (Atlas) hasta la altura de las Lumbares 1-2 (cono medular) y está alojada en el canal espinal o vertebral a nivel de la columna (Imagen 1.4).
Imagen 1.3 Columna vertebral. La médula espinal presenta incurvaciones que siguen los cambios de la columna ósea y se encuentra rodeada por las meninges que la aíslan del resto del contenido intrarraquídeo. (Tomado de Meza, 2011).
De la anatomía interna medular (Imagen 1.5) nacen nervios espinales y nervios tronculares o de los plexos que son constituyentes del sistema nervioso periférico. Una vez que termina la médula el canal espinal está ocupado por las raíces y
nervios que nacen de ella y buscan sus agujeros de emergencia, esta estructura se conoce como cauda equina, está acompañada por las meninges espinales y por un ligamento derivado de la duramadre denominado filum terminale que fija la médula al hueso sacro (Meza, 2011).
Imagen 1.4 Anatomía interna de la médula espinal. Presenta una característica de una porción central de color más intenso denominada sustancia gris medular que contiene los cuerpos neuronales y otra más pálida de localización periférica llamada sustancia blanca que contiene los axones o fibras que posteriormente caracterizan las vías o fascículos de la médula. (Tomado de López, s.f).
Todo el sistema nervioso central está rodeado por tres membranas protectoras denominadas meninges: la piamadre, la aracnoides y la duramadre. La membrana más interna es la piamadre; establece contacto directo con el sistema nervioso central, y consta de un estrato simple de fibroblastos situados sobre la superficie externa del cerebro y de la médula espinal. La membrana media, la aracnoides, denominada así porque se parece a la tela de una araña, formada por varios fibroblastos, que constituyen una capa fina, separada de la piamadre por líquido cefalorraquídeo, que ocupa el espacio subaracnoideo. La meninge más externa es la duramadre, una capa mucho más gruesa constituida por fibroblastos, que protege el sistema nervioso central. En la cavidad craneal, la duramadre duele unirse con la superficie interna del hueso. El líquido cefalorraquídeo (LCR) es un líquido claro e incoloro, que se encuentra en el espacio subaracnoideo, el canal central de la médula espinal y el sistema ventricular del cerebro. Se produce sobre todo en los ventrículos cerebrales, fluye según un gradiente de presión desde estos al espacio subaracnoideo y desde aquí al sistema venoso. Es un líquido dinámico que se renueva varias veces al día. Es un determinante importante del microentorno neuronal, ya que transporta al exterior productos del metabolismo celular y proporciona ciertos micronutrientes. Es un importante instrumento para el diagnóstico de infecciones, procesos inflamatorios o tumorales, además amortigua los impactos físicos del movimiento corporal sobre el SNC (Snell, 2014).
Imagen 1.2 Anatomía de la Neurona. Casi todas las neuronas tienen una zona de la membrana celular para recibir información, conocida habitualmente como dendritas ; un cuerpo celular, o soma , que contiene los orgánulos para casi toda la actividad metabólica de la célula; una extensión de la membrana celular que transporta información denominada axón , y una terminal presináptica que se encuentra al final del axón para transmitir información a otras células. (Tomado de Neira, 2016).
El otro tipo celular del sistema nervioso es la célula glial. Las células gliales tienen un papel importante en la producción de las vainas mielínicas de los axones en la modulación del crecimiento de neuronas en formación o dañadas, en la amortiguación de concentraciones de potasio y neurotransmisores, en la formación de contactos entre las neuronas, y también participan en determinadas respuestas inmunitarias del sistema nervioso. Estas células no producen potenciales de acción, aunque cada vez parece más evidente que pueden detectar indirectamente la actividad eléctrica de las neuronas y utilizar esta información para modificar la eficacia de las neuronas y utilizar esta información para modular la eficacia de la comunicación neuronal. Sin embargo, no todas las acciones de las células de la glía son beneficiosas para el sistema nervioso, puesto que a ellas se atribuyen ciertas respuestas neuroinflamatorias características de algunas enfermedades neurodegenerativas y la aparición de algunos trastornos de dolor crónico (Cunningham, 2014). Las vías efectoras de los sistemas simpático y parasimpático constan típicamente, de una cadena de dos neuronas. Una neurona preganglionar, cuyo soma se localiza en el SNC y envía su axón para sinaptar con una neurona posganglionar, cuyo soma está en un ganglio autonómico y que a su vez inerva los órganos diana. Los ganglios simpáticos se sitúan cerca de la médula espinal, para o prevertebrales, con lo que las fibras posganglionares tienen un trayecto relativamente largo. Por el contrario, los ganglios parasimpáticos yacen cerca o dentro de las estructuras viscerales, lo que resulta en fibras posganglionares cortas. Las fibras preganglionares son mielínicas delgadas de tipo B o amielínicas C, mientras que las posganglionares son mayoritariamente amielínicas (Navarro, 2002)
.
1.2.4 Láminas de Rexed. Los axones aferentes primarias forman sinapsis con neuronas secundarias de la sustancia gris de la médula o de los núcleos troncoencefálicos equivalente en el caso de los nervios craneales. (Pedrajas, 2008). La sustancia gris de la médula espinal se divide en 10 láminas denominadas láminas de Rexed , de la I a X. La mayoría de la información nociceptiva converge en la lámina I (zona marginal) , lámina II (sustancia gelatinosa) y la lámina V (rango dinámico amplio); esta zona resulta particularmente interesante, debido a que dichas células responden a un rango de estímulos que van de los inocuos a los
nocivos , es decir , pueden integrar información proveniente de fibras A beta, que conducen sólo información no nociceptiva , así como también de fibras A delta y C. Sus campos de recepción son grandes y la convergencia de estímulos que ocurre en ellas es crítica para la codificación de la intensidad de los estímulos. (Gutiérrez, 2002).
Imagen 1.5 : Láminas de Rexed distribuídas en la sustancia gris. Las fibras aferentes muy mielinizadas (1) penetran mediales en el cordón posterior, mientras que las de diámetro pequeño (2) lo hacen lateral. Zona marginal (lámina I), sustancia gelatinosa (lámina II), núcleo de Clarke (lámina VII entre los segmentos T1-L2). (Tomado de Pedrajas, 2008).
● Lámina I: Son neuronas que se relacionan con el dolor y frío. ● Lámina II: on neuronas pequeñas que reciben aferencias en relación al dolor y sensación térmica. ● Lámina III y IV: Una categoría de las neuronas de esta región se relaciona con el tacto. ● Lámina V: Capa gruesa que incluye el cuello de la columna dorsal, y puede dividirse en un tercio lateral y dos tercios mediales. Ambas subdivisiones están formadas por una población mixta, pero la primera contiene somas prominentes entremezclados con numerosos haces de fibras. Recibe el nombre de formación reticular y es particularmente prominente a nivel cervical. ● Lámina VI: Muy prominente en los engrosamientos cervical y lumbar. Presenta un tercio medial de neuronas d densamente agrupadas y dos tercios laterales con somas de forma triangular de sensibilidad propioceptiva de mayor tamaño y agrupados de forma más laxa. Corresponde a la base del asta dorsal. ● Región posteromedial de la lámina VII o Núcleo Dorsal (Clarcke): Este núcleo está presente entre los segmentos C8 y L3, contiene neuronas de segundo
Diagrama 1.1 Mecanismos de lesión medular primaria. (Tomada de Ballesteros, et. al., 2012).
El primer cambio detectable es la inflamación generalizada del cordón espinal frecuentemente acompañada de hemorragia de la sustancia gris central en cuyas células se presenta necrosis debida a la disrupción mecánica de las membranas y/o a la isquemia resultante de la disrupción vascular. Al paso del tiempo se ocasiona úlceras por presión como toda pérdida tisular, producida por isquemia. Se caracteriza por una herida abierta en la que se ha producido necrosis tisular en respuesta a una presión ejercida y mantenida sobre una prominencia ósea (Pérez, 2007). La pérdida de la homeostasis iónica es una característica fundamental de la muerte celular por apoptosis y por necrosis; específicamente la alteración de la concentración de calcio,que inicia una serie de procesos nocivos como la activación de calpaínas, disfunción mitocondrial y producción de radicales libres. La excito-toxicidad es el resultado de la activación excesiva de los receptores de glutamato porque su concentración se eleva súbitamente al liberarse en la lisis celular. Esto genera una falla del mecanismo de transporte intra y extracelular dependiente de energía, lo que perpetúa la alteración en la concentración iónica tisular (Diagrama 1.2). Altas concentraciones de radicales libres activan la peroxidación de ácidos grasos lo que produce lesión de las membranas celulares que implica muerte celular asociada a disfunción de los organelos y contribuye con la alteración de la homeostasis del calcio. (Ballesteros, et. al., 2012).
Diagrama 1.2 Mecanismos de lesión medular secundaria. ( Tomado de Ballesteros, et. al., 2012).
Es decir, forman un círculo vicioso de procesos que aumentan su producción. El proceso inflamatorio que sobreviene al trauma medular es altamente complejo y compromete numerosas poblaciones celulares que incluyen astrocitos, microglía, linfocitos T, neutrófilos y monocitos. De manera adicional, una multitud de mediadores intracelulares, como el factor de necrosis tumoral alfa, los interferones y las interleucinas, también juegan un papel importante (Pérez, 2007).
1.3.1 Manejo inicial de la lesión medular
El manejo de la lesión medular comienza en el mismo sitio donde sucede y debe cumplir estrictamente los protocolos del Programa avanzado de apoyo vital en trauma para médicos (ATLS®). Existen tres objetivos fundamentales en la escena del trauma:
- Prevenir lesiones adicionales.
- Mantener oxigenación y perfusión adecuadas, a través de las maniobras de resucitación.
- Realizar un traslado oportuno y adecuado a un centro de referencia que esté provisto de un equipo multidisciplinario de profesionales y de la tecnología necesaria para responder a los requerimientos terapéuticos de este tipo de pacientes. (Ballesteros, et. al., 2012).
-Una o más células musculares (la célula diana) Esta unión funcional es posible debido a que el músculo es un tejido eléctricamente excitable. El neurotransmisor más frecuente en este tipo de sinapsis es la acetilcolina que tiene sus receptores en la membrana postsináptica. (Ross y Pawlina, 2003).
El electrocardiograma: Es el registro de la actividad eléctrica de las fibras musculares acompañada de su contracción (Natalio, 2010). ● En las neuropatías: Con el músculo en reposo, en las neuropatías con una afectación de motoneurona o una lesión en el axón, aparecen en el músculo 1-3 semanas más tarde unos potenciales en reposo que se denominan potenciales de fibrilación y ondas positivas. Son potenciales originados por la despolarización de fibras musculares aisladas correspondientes a axones o neuronas dañadas. Su duración es de 1- milisegundos y se pueden mantener durante años en lesiones de asta anterior y radiculopatías. Disminuye su aparición con el frío y con la isquemia (Pérez, 2005). Los potenciales de fibrilación y las ondas positivas no son exclusivas de las neuropatías, sino que con frecuencia aparecen en miopatías con necrosis muscular (miositis y distrofias musculares). Para considerar el electromiograma patológico tienen que aparecer en dos o más puntos. En los procesos de asta anterior y en algunas radiculopatías aparecen fasciculaciones, que son producidas por la contracción espontánea de un grupo de fibras musculares de una Unidad Motora (UM), que llegan a ser visibles a través de la piel. Su origen es desconocido, ya que también aparecen ante situaciones de tensión, fatiga o ansiedad (Ibarra, 2005). En neuropatías y miopatías crónicas es frecuente la presencia de descargas complejas de alta frecuencia o pseudomiotónicas que reflejan la actividad espontánea de fibras musculares denervadas o en proceso de reinervación. Ante una lesión periférica localizada en el asta anterior, raíz, tronco o terminaciones nerviosas, el número de UM disminuye y en el músculo a máximo esfuerzo aparecen trazados simples o mixtos dependiendo de la intensidad de la pérdida de UM. La amplitud del trazado es normal (Pérez, 2005). La duración de los potenciales de UM, que normalmente es de 3-15 milisegundos según edad, músculo y temperatura, se incrementa en las neuropatías en relación con la reinervación que se produce en el músculo y está especialmente aumentada en procesos de asta anterior y neuropatías crónicas, en las que unidades motoras sanas reinervan a las fibras musculares denervadas aumentando la densidad de las fibras. El aumento de la duración con frecuencia se acompaña de aumento de amplitud y de potenciales de forma polifásica (Fuglsang, 1976).
1.4.2 Elementos del Electromiograma Electrodos: permite obtener la señal para el estudio del movimiento, estudia la actividad de todo músculo. Pre amplificación: Está destinada a contrarrestar las señales que provienen de ruidos del medio ambiente que podrían afectar los resultados de la Electromiografía. Filtrado: Tiene el propósito de eliminar el ruido de línea y limitar en banda la señal de entrada. Usamos filtros de banda plana, el uno como filtro pasa bajo que limita las señales de entrada y el pasa alta como filtro de valores de continua. Amplificación : Se realiza una nueva amplificación con la señal ya filtrada (Arévalo, s.f).
1.4.3 Análisis de Electromiograma La contracción de cada fibra muscular individual genera un potencial de acción. La suma de los potenciales de todas las fibras que componen una unidad motora constituye el potencial de unidad motora (Gaspar, et. al. , 2011). Los potenciales de unidad motora registrados con agujas fueron descritos cualitativamente, teniendo en cuenta para ello ciertas características como son: la amplitud, la duración y el número de fases. Con la ayuda de la computación es posible medir éstos y otros parámetros que son de utilidad para la evaluación del estado funcional del aparato neuromuscular. Entre ellas se pueden incluir el área bajo la curva rectificada, el número de turns y la frecuencia de descarga (Hernández, 1995).
1.5 Dimetil sulfóxido
El dimetil sulfóxido (DMSO) es conocido desde 1953 por sus propiedades como un “súper disolvente” y por su capacidad de penetrar fácilmente en los tejidos animales y vegetales. Debido a sus propiedades antiinflamatorias y analgésicas se ha empleado en medicina y veterinaria. El dimetil sulfóxido, o sulfóxido de dimetilo, es un líquido orgánico soluble en agua cuya molécula tiene forma piramidal, con átomos de azufre, oxígeno, carbono e hidrógeno. En su extremo superior posee un par de electrones que le permite disolver sustancias polares, cuyas moléculas tienen cargas eléctricas, ya que las partículas con carga negativa son separadas de las positivas por el disolvente (Álvarez, 2004).
Posee una amplia actividad farmacológica que incluye desde efectos antiinflamatorios, a vasodilatación o disolución del colágeno y captación de radicales libres. El principal uso del dimetil sulfóxido es como vehículo para administrar fármacos como la idoxuridina. Puede administrarse por vía oral, intravenosa o tópica para trastornos osteomusculares, enfermedades cutáneas, y en reproducción
se puede preparar diluyendo 32 mililitros de una solución al 90% en 250 mL de solución estéril para ser inyectado (Monarrez, 2011).
2. Objetivo
2.1 Objetivo General
Determinar utilidad regenerativa progresiva de la médula espinal tras una lesión lumbar posterior a la administración de dimetilsulfóxido mediante evaluaciones electromiográficas.
3. Hipótesis experimental Si aplicamos Dimetilsulfóxido en ratones con lesiones medulares entonces habrá una respuesta neuromuscular indicativa de una regeneración de la médula espinal. 4. Materiales y métodos Materiales biológicos: ● 6 ratones adultos ( Mus musculus ) con un peso que no exceda los 50g Materiales físicos: ● Jeringas insulínicas ● Biopac MP- ● Unidad estimuladora ● Gasas ● Agujas de acupuntura ● Rasuradora ● Jaulas contenedoras ● Placas radiográficas (Collares isabelinos) ● Cinta adhesiva ● Hilo cañamo ● Báscula Materiales químicos: ● Yodo desinfectante ● Ketamina ● Xilacina ● Dimetilsulfóxido (DMSO) ● Lidocaína
Metodología
1.Se utilizarán de 6 modelos experimentales Mus musculus seleccionados al azar con un peso no superior a 50 gramos. Dichos modelos permanecerán en jaulas en donde se les administrará alimento y agua ad libitum.
- Los modelos biológicos se anestesiarán a través de la aplicación de ketamina (dosis de 44 mg/kg) con xilacina (dosis de 5-16 mg/kg) la cantidad administrada será de acuerdo al peso del modelo biológico tratado.
- Procedimiento de evaluación electromiográfica del estado basal sin lesión medular.
● Los modelos de estudio a evaluar serán pesados en una báscula. ● Se llevará a cabo el procedimiento de anestesia con ketamina y xilacina vía intramuscular. ● Se identificará la región muscular a evaluar (músculo gastrocnemio) y se procederá a rasurar la misma. ● Se introducirán agujas de acupuntura de calibre #36 y de 7mm de largo en el músculo gastrocnemio, en las cabezas medial y lateral ● Se estimulará al modelo para que este realice un reflejo de flexión de la pierna mientras la respuesta es registrada con el electromiograma. ● Se obtendrán 3 registros haciendo uso del electromiograma de cada modelo evaluado, los cuales serán promediados.
- Procedimiento de punción lumbar
● Se llevará a cabo el proceso de anestesia aplicando vía intramuscular ketamina y xilacina. ● Se realizará la tricotomía en el sitio donde se llevará a cabo la punción rasurando la zona lumbar del lomo de los modelos biológicos. ● Se llevará a cabo la desinfección con yodo de la zona lumbar entre la L2 y L3. ● Será ubicado el espacio intervertebral de L2 y L3, posterior a lo cual se realizará la punción lumbar con una aguja insulínica estéril, la cual atravesará la piel, la fascia superficial, el ligamento interespinoso, el espacio epidural, la duramadre y la aracnoides.
- Posterior a la puncion lumbar se llevarán a cabo las siguientes evaluaciones electromiográficas:
● Procedimiento de evaluación electromiográfica de los miembros posteriores tras lesión medular (1 semana).
04/Octubre/2018 Toma de registro electromiográfico. Se continua administración de DMSO. 11/Octubre/2018 Toma de registro electromiográfico. Se continua administración de DMSO.
18/Octubre/2018 Toma de registro electromiográfico. Se continua administración de DMSO. Recopilación de datos obtenidos.
25/Octubre/2018 Se inicia trabajo final. Se lleva a cabo el análisis estadístico de los datos obtenidos de los electromiogramas. 08/Noviembre/2018 Trabajo final completado.
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