Espectrofotometría UV-VIS: Determinación de la Absorbancia de Soluciones - Prof. Bonilla, Guías, Proyectos, Investigaciones de Bioquímica

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DETERMINACIÓN DEL

ESPECTRO DE ABSORCIÓN EN

LA REGIÓN VISIBLE DE UN

COLORANTE

SAMARA JIMENEZ LOPEZ 214703721 PROFESOR SANDRA FABIOLA VELASCO RAMIREZ

OBJETIVO GENERAL

En esta práctica se tiene como objetivo el conocer cómo usar el espectrofotómetro y como utilizar los datos que este arroja. Además, aplicar la espectrofotometría como una técnica cualitativa y cuantitativa de análisis. OBJETIVOS ESPECIFICOS  El estudiante adquiera habilidades en el manejo del espectrofotómetro  Dominar los criterios para la selección de la longitud de onda adecuada en la cuantificación de Realizar los cálculos teóricos mediante la aplicación de fórmulas o factores de conversión para en la práctica preparar soluciones liquidas aplicando normas de bioseguridad, utilizando correctamente materiales y equipos en el laboratorio.  Analizar conceptos relacionados con la espectrofotometría para entender su importancia como técnica de análisis bioquímico. FUNDAMENTOS TEORICOS Los métodos espectroscópicos de análisis están basados en la medida de la radiación electromagnética que es absorbida o emitida por una sustancia. En función de ello se clasifican fundamentalmente en:

este color (observado) es complementario del que se percibiría si la luz absorbida se pudiera detectar. Dado que en la parte experimental de esta práctica las medidas van a realizarse con espectrofotometría visible, es conveniente conocer para qué longitud de onda tiene cada color su máxima absorción, lo que se muestra en la tabla siguiente: Componentes del espectrofotómetro: Para medir los valores de absorbancia y transmitancia de una disolución se utilizan espectrofotómetros UV-Vis, que, como puede verse en la Figura 2, se componen de cinco elementos principales: ● Una fuente de radiación que suele ser una lámpara de filamento de wolframio ● Un monocromador que permite seleccionar una longitud de onda determinada originando un haz monocromático. ●Un recipiente para contener la muestra denominado cubeta fabricado con un material que permite el paso de la radiación en la región del espectro de interés. Suelen ser de vidrio, plástico o cuarzo. El espesor de la cubeta más habitual es 1 cm. ● Un detector que convierte la energía radiante en una señal eléctrica. ● Una pantalla de visualizació MATERIAL Y REACTIVOS MATERIALES REACTIVOS 10 tubos de ensayo con capacidad de 12ml. Azul de bromofenol 300mg/L 1 gradilla Anaranjado de metilo 300mg/L 1 Perilla 1 pipeta graduada de 10ml 1 pipeta graduada de 1ml PROCEDIMIENTO

a) Prepare una dilución de las siguientes diluciones: 1/10, a partir de las diluciones madres y agua destilada. Mezclar bien y proceda a leer en el espectrofotómetro como se indica a continuación:

1. Encender el aparato y dejarlo calentar de 5 a 10 minutos. 2. Seleccionar la longitud de onda adecuada 3. Calibrar el aparato de 0% de absorbancia b) La dilución se somete a lecturas contra el blanco de agua destilada, variando cada vez la longitud de onda de 20 unidades, iniciando la lectura en 400 nm y finalizando en 700nm (espectro visible). Se anotan las lecturas correspondientes a cada longitud de onda y se grafican los valores de la longitud de onda de las abscisas y la absorbancia o el % de transmitancia en la ordenada, en papel milimétrico. RESULTADOS AZUL DE BROMOFENOL

• Se anotan las lecturas correspondientes a cada longitud de onda y se grafican

• La dilución se somete a lecturas contra el blanco de agua destilada, variando cada vez la longitud de onda de 20 unidades, iniciando la lectura en 400 nm y finalizando en 700nm

• Encender el aparato y dejarlo calentar de 5 a 10 minutos.
• Seleccionar la longitud de onda adecuada
• Calibrar el aparato de 0% de absorbancia

• Se preparo una dilución de las siguientes diluciones: 1/10, a partir de las diluciones madres y agua destilada
• Mezclar bien y proceda a leer en el espectrofotómetro

ABSORBANCIA

longitud de onda (λ) TUBO 400 420 440 460 480 500 520 540 A 0. 3

longitud de onda (λ) 560 580 600 620 640 660 680 700 B 0. 0

CONCLUSION

A través de la técnica de espectrofotometría de UV-VIS se determino la absorvancia de dos sustancias, azul de bromofenol y anaranjado de metilo. Para el tubo A=0.405 a 540 nm y B=0.957 a 580 nm, para el Tubo A= 0.766 a 460nm y B=0.021 a 560 nm respectivamente. CUESTIONARIO 1.- En que se basa la espectrofotometría. El principio de funcionamiento de la espectrofotometría se basa en el empleo de las interacciones entre la radiación electromagnética y la materia. 2.- Enuncie el fundamento de la ley de Lambert-Beer. “La intensidad de un haz de luz monocromática, que incide perpendicular sobre una muestra, decrece exponencialmente con la concentración de la muestra”, según esta ley : A = K.C. usada, de la sustancia que se analiza y del espesor de la celda usada. 3.- ¿Cuáles son las características de la luz? Se propaga en línea recta. Se refleja cuando llega a una superficie reflectante. Cambia de dirección cuando pasa de un medio a otro (se refracta 4.- Mencione cuatro componentes del espectrofotómetro y explique su función. Un espectrometro tipico posee cuatro componentes basicos: una fuente de radiacion que tiene intensidad constante en el rango de longitud de onda que cubre ( usualmente es lampara de tungsteno para luz visible,y deuterio para ultravioleta), un compartimiento para la muestra, un monocromador que separa la banda de longitud de onda deseada del resto del espectro y la dispersa al compartimiento de la muestra, y un fotodetector, que mide cuantitativamente la radiacion que pasa por la muestra. 5.- ¿Qué es una curva de calibración? Se trata de una curva de referencia construida con cantidades conocidas de una sustancia (por ejemplo la albúmina sérica bovina que vimos antes) que se utiliza para determinar la cantidad de esta sustancia (proteínas) presente en una muestra incógnita. 6.- Mencione los pasos para el manejo del espectrofotómetro.

1. Seleccionar el modo (A = absorbancia, %T = %transmitancia, C = concentración) y la longitud de onda ( ).
2. Medir el blanco.
3. Introducir el valor del estándar o el factor (modo concentración únicamente).
4. Medir las muestras.

7.-Defina los siguientes términos: ruido y desplazamiento. RUIDO: Es aquella emisión de energía originada por un fenómeno vibratorio, generalmente no deseada que en estudios físicos se trata de una variable que perturba el medio del mismo. DESPLAZAMIENTO: Define la posición de un punto o partícula en relación a un origen A con respecto a una posición B. El vector se extiende desde el punto de referencia hasta la posición final. 8.- Defina transmitancia y absorbancia. TRANSMITANCIA: La transmitancia o transmitencia es una magnitud que expresa la cantidad de energía que atraviesa un cuerpo en la unidad de tiempo (potencia). ABSORBANCIA: Medida de la atenuación de una radiación al atravesar una sustancia, que se expresa como el logaritmo de la relación entre la intensidad saliente y la entrante. 9.- Mencione la clasificación de espectroscopia y sus características.  EAA: constituye una de las técnicas más empleadas para la determinación de más de 60 elementos, principalmente en el rango de μg/ml-ng/ml en una gran variedad de muestras. Entre algunas de sus múltiples aplicaciones tenemos el análisis de: aguas, muestras geológicas, muestras orgánicas, metales y aleaciones, petróleo y sus subproductos; y de amplia gama de muestras de industrias químicas y farmacéuticas.  ESPECTROSCOPÍA DE ABSORCIÓN ATÓMICA CON LLAMA Y ELECTROTÉRMICA: es un método de análisis químico que utiliza la intensidad de la luz emitida por una llama, un plasma, un arco o chispa eléctricos en una longitud de onda particular para determinar la cantidad de un elemento en una muestra. La longitud de onda es característica de la línea espectral atómica y determina la identidad del elemento, mientras que la intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de átomos del elemento.  ESPECTROSCOPIA DOPPLER: Método espectroscópico para encontrar planetas extrasolares. Involucra la observación de desplazamientos Doppler en el espectro de la estrella alrededor de la cual la estrella orbita.  ESPECTROSCOPIA ELECTRONICA POR PERDIDAS DE ENERGIA: Técnica de caracterización de materiales que estudia el movimiento vibracional de átomos y moléculas en y cerca de la superficie, mediante el análisis del espectro de energía de electrones de baja energía que inciden en y luego son esparcidos desde dicha superficie.  ESPECTROSCOPIA DIELECTRICA: Mide las propiedades dieléctricas de un medio como función de la frecuencia. El método se basa en la interacción de un campo externo con un momento dipolar eléctrico de la muestra, a menudo expresado como permisividad.  ESPECTROSCOPIA DE EMISION ATOMICA: Método de análisis químico que utiliza la intensidad de la luz emitida por una llama, un plasma, un arco o chispa eléctricos en una longitud de onda particular para determinar la cantidad de un elemento en una muestra. La longitud de onda es característica de la línea espectral atómica y determina la identidad del elemento, mientras que la intensidad de la luz emitida es proporcional a la cantidad de átomos del elemento.