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Este documento detalla la tinción de Gram en procariotas, clave para diferenciar bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. Analiza diferencias estructurales en paredes celulares, composición del peptidoglicano y función de la membrana externa. Discute aplicaciones clínicas en identificación bacteriana y selección de antibióticos, resaltando su importancia en microbiología y medicina. Aborda paredes celulares de arqueas y bacterias ácido alcohol resistentes, ofreciendo una perspectiva comparativa. Incluye recomendaciones para una tinción precisa y bibliografía para ampliar el conocimiento. Valioso para estudiantes y profesionales interesados en microbiología e identificación bacteriana.
Tipo: Resúmenes
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Fosfolípidos (FL) Lipopolisacárido (LPS) La lipoproteína (LPP, lipoproteína de Braun) Proteínas de la membrana externa 2.5.1.2 PAPELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA EXTERNA 2.5.2 EL ESPACIO PERIPLÁSMICO 3 PAREDES DE LAS ARQUEAS RESUMEN RECOMENDACIONES BIBLIOGRAFÍA
La mayor parte de los procariotas posee una pared celular (P.C.) rígida rodeando al protoplasto. Las excepciones son las micoplasmas (dentro del dominio Bacteria) y algunas arqueas, como Thermoplasma. Al microscopio electrónico se puede observar como una capa en íntimo contacto con la membrana citoplásmica, con un espesor que oscila entre 10 y 80 nm (según especies) - frente a los 8 nm de la membrana celular- , y con una estructura más o menos compleja, según los tipos bacterianos.
que, como veremos comparten un componente común: paredes de tipo Gram-positivo o de tipo Gram-negativo.
proteínas.
diversos tipos. El grueso de este capítulo está dedicado al estudio de las paredes Gram-positivas y Gram- negativas, con sus principales variantes, pero finalizaremos con una alusión a los principales modelos de paredes arqueas. Aunque el alumno realizará en prácticas de laboratorio la tinción de Gram, vamos a explicarla aquí brevemente. La tinción de Gram es la más importante entre las tinciones llamadas diferenciales (aquellas que no tiñen de la misma manera a todos los tipos de bacterias). Resumiendo, esta tinción consta de varios pasos:
Consisten en un esqueleto macromolecular rígido, llamado peptidoglucano (= mucopéptido o mureína), que ➢ En Gram-positivas se encuentra inmerso en una matriz aniónica de polímeros azucarados; ➢ En Gram-negativas está rodeada por una membrana externa, e inmersa en un espacio periplásmico. Comenzaremos abordando esa macromolécula tan peculiar llamada peptidoglucano, para después estudiar globalmente y por separado la pared de Gram-positivas y Gram-negativas, con algunas variantes que se pueden presentar. 2.1 EL PEPTIDOGLUCANO: COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA En las bacterias Gram-positivas el peptidoglucano representa el componente mayoritario de la pared celular (50-80% en peso), mientras que en Gram-negativas supone sólo del 1 al 10%. 2.1.1 COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ESTRUCTURA BÁSICAS DEL P EPTIDOGLUCANO Está formado por repeticiones de una unidad disacarída fundamental unida a su vez a un tetrapéptido. Distintas cadenas (formadas por el esqueleto de azúcares) se unen entre sí por determinados enlaces peptídicos entre tetrapétidos de cadenas diferentes. Veamos todo ello en su concreción química: La unidad disacarída repetitiva : consiste en N-acetil glucosamina (NAG) unida por enlace ß(1à4) a N-acetil murámico (NAM). Obsérvese que el NAM es el 3-O- D-lactil-éter de la NAG (o sea, se deriva de unir el ácido D-láctico con el OH del C-3 de la NAG). Las distintas unidades disacarída se van uniendo entre sí por enlaces ß(1à4) entre el NAM de una unidad y la NAG de la siguiente. Este enlace es susceptible a la rotura catalizada por el enzima lisozima. El número de repeticiones (n) puede oscilar entre 10 y 100.
➢ En bacterias Gram-negativas este sáculo está formado por una sola capa (o unas pocas) de cadenas de PG. ➢ En Gram-positivas existen varias capas (hay varios niveles de PG). A continuación, describiremos por separado el PG (Péptido glucano) de Gram-positivas y Gram-negativas, dando indicaciones de sus principales variantes. 2.1.2 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-NEGATIVAS En la mayor parte de Gram-negativas el peptidoglucano corresponde a la composición y estructura que acabamos de describir. Sin embargo, en las espiroquetas, el di aminoácido en posición 3, en vez de ser meso-DAP, está sustituido por la L-ornitina (que también es un di aminoácido). El enlace entre cadenas polisacáridos se realiza normalmente mediante unión peptídica directa entre el grupo carboxilo de la D-ala terminal y el grupo e-amino del meso-DAP. Ahora bien, en este enlace participan solamente el 50% de los tetrapéptidos. Los demás péptidos no participan en enlaces, y entre estos últimos se encuentran incluso dipéptidos y tripéptidos. El resultado es una capa simple de PG (de 1 nm de espesor), a modo de malla floja, y con grandes poros (los “huecos” dejados por las zonas donde no hay enlaces peptídicos). Ello explica el comportamiento de las bacterias Gram- negativas en la tinción de Gram: al añadir el alcohol, se produce una deshidratación que tiende a contraer la estructura del PG, pero los poros son grandes y por ellos sale el primer colorante (el violeta de genciana). El ulterior tratamiento de la preparación con el colorante de contraste (fuchsina o safranina) tiñe a estas bacterias de rojo. 2.1.3 EL PEPTIDOGLUCANO DE BACTERIAS GRAM-POSITIVAS Es más variado que el de Gram-negativas, sobre todo en función de ciertas variantes en la composición del tetrapéptido y del tipo de enlaces entre los tetrapéptidos. ➢ Variantes en composición del tetrapéptido: o En bacterias Corineformes:
(o en su lugar) los ácidos teicurónicos y los lipoteicoicos. Estos componentes llegan a sobresalir de la superficie celular y suministran especificidad antigénica. Ácidos teicoicos: Están presentes en muchas bacterias Gram-positivas, pero no en todas. Son polímeros de hasta 30 unidades de glicerol-fosfato o ribitol-fosfato, unidas entre sí por enlaces fosfodiéster, en los que la mayoría de los grupos - OH están sustituidos por - H, azúcares, aminoazúcares o D-alanina. Los ácidos teicoicos están unidos covalentemente al peptidoglucano, concretamente al - OH en posición 6 del NAM, a través de una unidad de enlace, variable según las especies. (Por ejemplo, en una especie de Micrococcus, el elemento de enlace consiste en {glicerol- P}3 --NAG-P). Ácidos teicurónicos: Ciertas bacterias Gram-positivas, cuando se someten a un régimen de limitación de fosfato son incapaces de sintetizar ácidos teicoicos, pero en su lugar producen ácidos teicurónicos. Los teicurónicos consisten en polímeros aniónicos formados por la alternancia de ácidos urónicos (que tienen grupos - COOH libres) y aminozúcares como la N-acetil-galactosamina. Ácidos lipoteicoicos: Están presentes en todas las bacterias Gram-positivas, aun en condiciones de carencia de fosfato. Se trata simplemente de ácidos glicerol-teicoicos que se encuentran unidos a la membrana citoplásmica, concretamente se unen por enlace fosfodiéster con glucolípidos de membrana, mientras que el otro extremo de la cadena queda expuesto al exterior. En Streptococcus pyogenes las cadenas de lipoteicoicos se encuentran asociadas con la llamada proteína M, originando unas microfibrillas que sobresalen notablemente hacia el exterior celular (observables a microscopio electrónico), y que facilitan la unión a las células de animales en que parasitan estas bacterias. Funciones de los polímeros de la matriz:
Determinadas bacterias Gram-positivas (corineformes, Nocardia y, en especial Mycobacterium) presentan una pared celular muy compleja, con abundancia de lípidos (algo excepcional entre las Gram-positivas). Estas bacterias no se tiñen con los colorantes normales, pero una vez que se han teñido con fucsina (forzando mediante calentamiento de la preparación), tienen resistencia a decolorarse por una mezcla de ácido clorhídrico al 3% en etanol de 96o. Por ello se denominan bacterias ácido-alcohol resistentes. Esta propiedad depende esencialmente de la presencia, en su pared celular de unos lípidos llamados ácidos micólicos. Químicamente, esta pared celular consiste en un esqueleto formado por dos tipos de polímeros, unidos covalentemente entre sí:
El conjunto es un mosaico fluido que permite el desplazamiento lateral de los fosfolípidos, del LPS, y de las proteínas, pero no de las lipoproteínas unidas covalentemente al peptidoglucano. Sin embargo, esta fluidez es menor que la de la membrana citoplásmica.
i) El lípido A: esta región es prácticamente idéntica en todas las bacterias Gram-negativas. Consiste en un disacárido formado por dos unidades de glucosamina unidas por enlace ß(1à6), pero donde todos los grupos - OH (menos uno) y - NH2 están sustituidos (unidos a otras moléculas): Obsérvese que
La lipoproteína (LPP, lipoproteína de Braun) Su porción polipeptídica es una pequeña proteína (7.2 kDa) muy abundante en la membrana externa, y es la responsable de la unión covalente entre ésta y el peptidoglucano. La proteína tiene una configuración mayoritaria en a-hélice, que atraviesa el espacio periplásmico, y parece que se agrega formando trímeros. Una de las LPP del trímero (por término medio) se une covalentemente con el peptidoglucano. El aminoácido N-terminal es una cisteína cuyo grupo sulfhidrilo está unido por enlace tioéter a un diglicérido, y cuyo grupo amino se une por enlace amido con un ácido graso (p. ej., palmítico). De este modo, la porción N- terminal de la LPP está embebida en la lámina interna de la membrana externa. El aminoácido C-terminal es una lisina. Una de cada tres moléculas de LPP usa esta Lys para establecer un enlace peptídico entre su propio grupo - NH2 libre y el - COOH libre del meso-DAP del PG. Por término medio, por cada diez unidades disacarídicas del PG, existe un enlace covalente con la LPP. La principal (y probablemente única) función de la lipopproteína es meramente estructural: estabilizar el complejo entre peptidoglucano y membrana externa. Esta unión es tan fuerte que permite aislar la membrana externa y el peptidoglucano como una unidad. Proteínas de la membrana externa Están intercaladas en esta membrana, participando en la estabilización de la arquitectura tridimensional, interaccionando unas con otras y con los lípidos. Entre ellas, las más importantes son las porinas. Las porinas son proteínas de unos 35 kDa, que se agregan formando trímeros con canales interiores, y que atraviesan la membrana de parte a parte. Su función es permitir el paso de sustancias a través de dichos canales interiores, siempre que su peso molecular sea compatible con el tamaño de los canales (suelen ser moléculas entre 500 y 700 dalton). En las enterobacterias, las porinas colaboran en la protección contra las sales biliares que existen en el ecosistema intestinal donde pasan parte de su vida. Existen otras proteínas minoritarias parecidas a porinas, que actúan como canales específicos que permiten el paso de ciertas moléculas: vitamina B12, quelatos de Fe, nucleósidos, maltodextrinas, etc. Algunas de ellas sirven simultáneamente como receptores de fagos. 2.5.1.2 APELES Y FUNCIONES DE LA MEMBRANA EXTERNA
a muchos agentes antibacterianos: colorantes, ácidos biliares, antibióticos, enzimas (p. ej., la lisozima, que podría alcanzar y atacar al PG). Recuérdese que las porinas sólo permiten el paso de sustancias hidrofílicas por debajo del tamaño especificado por el diámetro de los canales.
La tinción de Gram es una técnica microscópica que diferencia bacterias basadas en las características de su pared celular, clasificándolas como Gram-positivas o Gram-negativas. Las bacterias Gram-positivas retienen el tinte violeta cristal y aparecen moradas, mientras que las Gram-negativas pierden el tinte y se tiñen de rosa o rojo con un tinte de contraste. Esta distinción es crucial para identificar el tipo de bacteria causante de una infección y guiar el tratamiento antibiótico. El proceso de tinción de Gram:
1. Fijación: Las células bacterianas se fijan a un portaobjetos mediante calor. 2. Tinte primario (violeta cristal): Se aplica un colorante básico (violeta cristal) para teñir todas las células. 3. Mordiente (solución de Lugol): Se aplica una solución de yodo que forma un complejo con el violeta cristal, fijándolo a la pared celular. 4. Decoloración (alcohol o acetona): Las células Gram-negativas pierden el complejo violeta-yodo, mientras que las Gram- positivas lo retienen debido a su pared celular más gruesa. 5. Tinte de contraste (safranina o fucsina): Las células Gram-negativas se tiñen de rosa o rojo con este tinte, mientras que las Gram-positivas permanecen moradas. 6. Observación microscópica: Las células se observan al microscopio para determinar si son Gram-positivas (moradas) o Gram-negativas (rosas o rojas). ¿Por qué es importante la tinción de Gram?
Para una tinción de Gram precisa en células procariotas, es crucial seguir un orden y tiempos específicos, así como utilizar reactivos de calidad. En resumen, se recomienda: aplicar cristal violeta, Lugol (fijador), decolorante (mezcla alcohol-acetona) y safranina, en ese orden, con tiempos de exposición y lavados adecuados. Pasos detallados y recomendaciones:
