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E s p i n o z a , L e a n d r o S.
TECNICAS HISTOLOGICAS
TECNICA HISTOLOGICA. DEF.
ES EL CONJUNTO DE PROCEDIMIENTOS APLICADOS PARA PRESERVAR LA
ESTRUCTURA Y ORGANIZACIÓN DE LAS CELULAS/TEJIDOS, PARA OBTENER UNA
PREPARACION MICROSCOPICA QUE PERMITA SU EXAMEN CON MICROSCOPIO
OPTICO (MO)
ETAPAS DE LA TECNICA
- TOMA DE BIOPSIA. (Tipo de toma de muestra).
- INCISION. (Se toma un pedacito de la muestra).
- ESCISION (Se toma totalmente la muestra o lesión)
- PUNCION (Se utiliza una aguja para tomar la muestra)
- ENDOSCOPIA (Aparato de fibra óptica que toma biopsia por forma endoscópica. También se puede definir como, examen en el cual se introduce un fino tubo llamado endoscopio a través de la boca hasta el estómago, para observar las paredes de los órganos como el esófago, el estómago y el inicio del intestino, de los cuales se puede extraer una muestra con ayuda de unas pinzas)
- LEGRADO, RASPADO O CURETAJE (Se raspa con paletas la superficie de la muestra a examinar para su posterior estudio, aunque también se utiliza para eliminar sustancias adheridas a los tejidos. Un ejemplo de legrado es el Papanicolau).
- CONGELACION INTRAHOPERATORIA. (Consta de la extracción de muestra de un tejido de forma intraoperatoria para realizar una estrategia de cirugía o tratamiento específico. Dentro de las ventajas de la biopsia por congelación está la obtención de resultados rápidos con la finalidad de modificar intraoperatoria mente una conducta, ya que los cortes por congelación permiten un diagnóstico en un tiempo de 15 a 20 minutos, mientras que los preparados convencionales permiten diagnósticos en 24 a 48 horas. Otra ventaja es que se logra una preservación de mayor cantidad del tejido libre de la lesión con mejores resultados estéticos.
- DATO IMPORTANTE. Una autopsia , también llamada examen post mortem , obducción o necropsia (en medicina veterinaria), es un procedimiento médico que emplea la disección, con el fin de obtener información privada anatómica sobre la causa, naturaleza, extensión y complicaciones de la enfermedad que sufrió en vida el sujeto y que permite formular un diagnóstico médico final o definitivo para dar una explicación de las observaciones clínicas dudosas y evaluar un tratamiento dado. Usualmente es llevada a cabo por un médico especialista denominado patólogo. Debe resaltarse que la palabra necropsia difiere de autopsia, la autopsia es realizada por un individuo en su misma especie mientras que la necropsia se realiza en un cadáver indiferente a la especie del individuo que la realice.
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2. FIJACION.
Todos los tejidos, bien cuando se extraen de un organismo o bien cuando el organismo en el que están muere, sufren dos tipos de procesos degradativos: autolisis por acción de enzimas intracelulares, es decir, autodigestión, y putrefacción por acción bacteriana. Además, el procesamiento histológico posterior del tejido para poner de manifiesto y observar determinadas estructuras supone una metodología que puede degradar las estructuras tisulares. Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que poseía en su estado vivo. Es como hacer una fotografía del tejido vivo y poder observarla, tras algún tratamiento, con el microscopio. Así, los fijadores deben evitar la autolisis, proteger frente a ataques bacterianos, insolubilizar elementos solubles que se quieren estudiar, evitar distorsiones y retracciones tisulares, penetrar y preparar el tejido para poder llevar a cabo tinciones específicas posteriores, si es necesario, etcétera. Fijar un tejido es preservar sus características morfológicas y moleculares lo más parecidas posibles a las que poseía en estado vivo.
E s p i n o z a , L e a n d r o S. Existen diferentes formas de fijar los tejidos dependiendo del tipo de fijador, de la estructura a fijar y de lo queramos observar. Los métodos de fijación se pueden clasificar en dos tipos: físicos y químicos.
- Físicos. Los fijadores físicos se basan bien en una congelación muy rápida del tejido o bien en la aplicación de calor elevado. Se utilizan cuando los fijadores químicos alteran la estructura que queremos observar, cuando necesitamos una fijación muy rápida, o cuando el tipo de tejido y la técnica que usaremos lo requieran. SE PUEDEN CLASIFICAR LOS SIGUIENTES METODOS FISICOS.
- La congelación rápida es un buen método de preservación de las características moleculares, puesto que no se verán alteradas por ninguna sustancia química. La congelación es conveniente que sea rápida puesto que así se impide la formación de grandes cristales de hielo que nos destrozarían la estructura del tejido.
- La fijación por calor no es frecuente en histología, puesto que produce deterioros de los tejidos. Su efecto es la coagulación de proteínas y disolución de lípidos. Sin embargo, se emplea para la observación de microorganismos, ya que preserva la forma de éstos y sirve para su identificación. Hoy en día, sin embargo, se suele emplear el calor como un complemento a la fijación química. Así, las muestras inmersas en un fijador se introducen en un microondas y se llevan hasta temperaturas de unos 55 ºC. Esta temperatura no produce artefactos y tiene dos ventajas: incrementa la velocidad de fijación y reduce el tiempo fijación desde varias horas o días a decenas de minuto
- Químicos. Los métodos químicos utilizan soluciones acuosas compuestas por moléculas fijadoras que establecen puentes entre las moléculas del tejido, manteniéndolas en sus lugares originales e impidiendo su degradación. Hay que considerar que los fijadores químicos afectan al tejido tanto física como químicamente. Los efectos físicos suelen ser retracciones o distensiones, y la mayoría endurecen el tejido. Hay dos métodos básicos de fijación con fijadores líquidos: inmersión y perfusión. En cualquier caso, el fijador debe llegar a todas las partes el tejido lo más rápidamente posible. SE PUEDEN CLASIFICAR LOS SIGUIENTES METODOS QUIMICOS.
- Inmersion. Se sumergen pequeños trozos del tejido a estudiar en forma aldehido 3 al 10 %.
- Las piezas de tejido no deberían superar los 0.5 cm de espesor para que el fijador alcance el interior de la pieza antes de que ésta comience a deteriorarse. La velocidad de penetración del fijador depende de cada fijador y de las características del tejido. Esta velocidad nos condicionará el tamaño de la muestra. Para fijadores lentos se recomiendan piezas de 0.2 cm de tamaño. Esto también se ve afectado por el tipo de tejido. Por ejemplo, si es poroso o con grandes espacios la difusión del fijador será más rápida.
E s p i n o z a , L e a n d r o S. Fijación por inmersión.
- El volumen recomendado de fijador es de 10 a 20 veces superior al volumen de la pieza.
- La osmolaridad del tejido y de la solución fijadora deben estar equilibradas.
- El pH del fijador debe ser próximo al fisiológico.
- El tiempo de fijación, para un mismo tipo de muestra, depende de cada tipo de fijador: velocidad de difusión y velocidad de fijación (la rapidez e intensidad con la que establece puentes o coagula proteínas). Debe ser suficiente para que la muestra quede bien fijada pero no excesivo para evitar deterioros o alteraciones del tejido. Una agitación suave durante la fijación ayuda a la penetración del fijador y disminuye el tiempo. En general no se recomiendan fijaciones mayores de 24 horas, excepto en algunos casos como el formaldehído, para el que se puede emplear una semana de fijación.
- Perfusión. La Perfusión es el método de mayor utilización en animales de experimentación, ya que el líquido fijador es inoculado en el sistema circulatorio del espécimen, por lo tanto, fija en principio desde adentro hacia fuera de los órganos a estudiar, lo que da excelentes resultados cuando la técnica es realizada con éxito. Hay dos tipos de fijación por perfusión: de gran circuito y de pequeño circuito. El primero, se realiza inoculando el fijador a partir del corazón (ventrículo izquierdo) por lo que la fijación ocurre en todos los órganos del espécimen. En la perfusión de pequeño circuito, el fijador se inyecta solo en una porción del animal, fijando solo la parte de interés para el investigador.
E s p i n o z a , L e a n d r o S. Fijación por perfusión de un organismo completo. Mediante este tipo de perfusión se introduce la solución fijadora en el sistema sanguíneo. La bomba peristáltica aporta la presión suficiente para permitir al fijador entrar a través del ventrículo izquierdo (Vi) y pasar a la aorta, desde la cual se distribuye por todo el cuerpo (excepto por el circuito pulmonar). Tras pasar por la red capilar la solución fijadora pasa a los vasos venosos que terminan por verter su contenido en la aurícula derecha (Ad). A esta cavidad hay que hacerle una abertura para que la solución fijadora, una vez realizada su función, salga del circuito. Ai: aurícula izquierda; Vd: ventrículo derecho.
- Este método de fijación por perfusión requiere conocer la presión a la que se va a introducir la solución fijadora en el animal o estructura, la cual debe ser similar a la que posee la presión sanguínea normal en estado vivo. La presión que ejercerá la solución fijadora se puede regular mediante bombas peristálticas (ver figura) o por gravedad, es decir, variando la altura a la cual se coloca la solución fijadora respecto a la del animal. Esto es importante porque una presión muy baja podría impedir que la solución fijadora alcanzara todas las partes de la estructura y una presión muy alta podría provocar roturas de los vasos sanguíneos y de la propia estructura tisular. No existe un fijador universal, ni un método de fijación único. La elección depende de las características fijadoras que necesitemos y de las posteriores técnicas que se van a aplicar al tejido. Para una buena fijación influyen factores como la velocidad de la penetración y perfusión, la cual depende del tamaño y edad del animal, además de las propiedades químicas del fijador. A su vez se deben evitar los cambios post-mortem e impedir la formación de artefactos.
- CON ESTE PASO SE EVITA LA DESTRUCCION O LISIS CELULAR
- ES UN PROCESO FISICO/QUIMICO COMPLEJO POR EL CUAL SE MANTIENE A LAS ESTRUCTURAS ORGANICAS EN EL ESTA MAS PARECIDO AL QUE POSEIAN EN VIDA.
- LA FIJACION DEBE REALIZARSE LO MAS RAPIDO POSIBLE LUEGO DE TOMADA LA MUESTRA PARA EVITAR LOS PROCESOS DE AUTOLISIS O DEGRADACION/RUPTURA CELULAR.
- SE DEBE ESCOGER EL METODO MAS ADECUADO AL OBJETIVO DEL ESTUDIO A REALIZAR.
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3. DESHIDRATACION
SE REALIZA UTILIZANDO UN GRADIENTE DE CONCENTRACIONES DE ETANOL
(ALCOHOL), EL CUAL ELIMINA EL AGUA (H20) DE LA CELULA. DEBIDO A QUE
LA MISMA SALE DE MANERA RAPIDA, SE DEBE REALIZAR UN GRADIENTE DE
MENOR A MAYOR CONCENTRACION DE ALCOHOL PARA EVITAR QUE SE
MODIFIQUE LA ARQUITECTURA O LA DEFORMACION MORFOLOGICA DE LA
CELULA O LOS TEJIDOS POR LA SALIDA DEL AGUA, ESTO MANTENDRIA LA
FORMA DEL CORTE A OBSERVAR.
4. ACLARACION
E s p i n o z a , L e a n d r o S. MEDIO HIDROFOBO – PARAFINA O PARAPLAST(altamente purificada, la cual se le han agregado cantidades de varios polímeros especiales los cuales le darán distintas plasticidad al taco)
6. PREPARACION DEL TACO ➢ Se corta un trozo de parafina que contiene parte del preparado, en forma de pirámide truncada, de manera tal que la misma quede sobre la base menor. ➢ Se pega la base mayor a un taquito de madera que servirá para sostenerlo en el microtomo. 7. CORTE CON MICROTOMO Las características tisulares y celulares finas se observan con los microscopios. Sin embargo, con estos aparatos sólo se pueden observar muestras de tejido que tengan un grosor muy pequeño, ya que de no ser así hay problemas de difusión y penetración de la luz en el caso de los microscopios ópticos y de penetración de los electrones en el caso del microscopio electrónico de transmisión. Por tanto tenemos que hacer secciones de los tejidos que queremos estudiar, las cuales pueden ir desde un grosor de unos cuantos nanometros hasta centenares de micras. Algunos tejidos como los de las plantas, por sus características celulares, permiten su observación en secciones de cientos de micras de grosor. Otros tipos de muestras, como la sangre o los cultivos celulares, pueden observarse directamente puesto que las células se extienden en una capa de una o unas pocas células de grosor.
E s p i n o z a , L e a n d r o S. Como hemos mencionado en las páginas anteriores, podemos decir que cuanto más delgada queramos hacer una sección de tejido más endurecido ha de estar dicho tejido antes de seccionarlo. La dureza de los tejidos depende de sus características (por ejemplo, las paredes celulares hacen que las plantas tengan tejidos duros), de la fijación que hayamos realizado y sobre todo del material en el que hayamos incluido dicho tejido. Una manera más directa de endurecer el tejido es mediante congelación. Los aparatos mecánicos para hacer secciones de un grosor de micrómetros se denominan microtomos y existen diferentes tipos según el grosor que queramos conseguir en nuestras secciones, según el medio de inclusión en el que se encuentre el tejido y según el proceso de endurecimiento de la muestra: por congelación o por inclusión. Los microtomos más usados son: Microtomo para parafina. Se utiliza principalmente para material incluido en parafina y se obtienen secciones de 5 a 20 μm de grosor. Estas secciones se observan con el microscopio óptico.
E s p i n o z a , L e a n d r o S. laminilla, entonces se pasa a la desparafinarían sobre una platina o estufa a más de 60°C-70°C para pasar luego a la tinción. (1) Los cortes se extienden al depositarlos sobre la superficie del líquido extendedor contenido en un recipiente Esto impide que se formen facetas desiguales en el filo de la denominado “baño de flotación” (éste mantiene la navaja produciéndose, con ello, un afilado deficiente. temperatura entre 40o a 45o C). Las secciones se depositan en el líquido procurando que la superficie brillante (aquella correspondiente al filo de la navaja) se ponga en contacto con el líquido caliente. En caso de que ciertas arrugas persistan, se emplean unas pinzas finas o un pincel de pelo de camello, para ejercer una ligera tracción entre los extremos de los cortes y así desarrugarlos totalmente. Las secciones se extienden aisladas o formando cintas, estas se recogen y adhieren al portaobjetos de la misma forma: en el caso que se requiere recoger los cortes aislados, extendido previamente como una cinta, deben separarse utilizando las mismas pinzas finas o agujas de disección. (2) Para garantizar una mejor adhesión de los cortes a los portaobjetos se recomienda incorporar sustancias adherentes al líquido extendedor en ciertos casos al portaobjetos. Estas sustancias suelen emplearse de las manetas: ➢ a) Extensión previa de la sustancia adherente a una de las superficies de la lámina portaobjetos, por ejemplo, la albúmina de Mayer, constituida por partes iguales de glicerina y clara de huevo, a la mezcla se le añaden algunos cristales de timol como ingrediente conservante. La mezcla se filtra y se guarda en refrigeración. Se le utiliza extendiendo una gota de la mezcla en el portaobjetos y se deja secar. Los cortes se recogen cuidadosamente sumergiendo, por debajo de ellos, el portaobjetos en forma oblicua. Otra sustancia adherente que se emplea de la misma manera es la poli- L-lysina (solución de 25 miligramos de la sustancia en 25 ml de agua destilada). Una gota de la solución se extiende en el portaobjetos y éstos se secan a 50 o - 55o C. durante toda la noche y está lista para su uso ➢ b) Al líquido de flotación se le añaden sustancias. Uno de los procedimientos más sencillos es coloración el que consiste en disolver, en el agua ya caliente del baño de flotación (dos litros) 0.5 g de gelatina. En otros casos se emplea una solución que posee los ingredientes siguientes:
- agua destilada --------------------------------- 1,000 ml
- bicromato de potasio--------------------------0.2 gramos
- gelatina -----------------------------------------0.2 gramos El agua destilada se calienta a 60 o C para disolver en la gelatina y el bicromato de potasio, sucesivamente. Se filtra y está lista para su uso. Este líquido previamente filtrado se puede utilizar varias veces. (se recomienda guardarlo en el refrigerador) CONCLUSIONES ➢ En conclusión el baño de flotación es importante debido a que este ayuda a que el corte del tejido se pueda estirar completamente para posteriormente pescarlo y de esta forma el tejido se mantenga intacto. ➢ En conclusión, se pudo determinar que el agua es una de las sustancias más adecuadas para usar en el baño de flotación debido a que en esta podemos ver las impurezas con mayor facilidad, además de su limpieza se hace de manera óptima.
E s p i n o z a , L e a n d r o S. ➢ Como conclusión el equipo de baño de flotación es un equipo de forma circular o rectangular dependiendo del modelo, el cual consta de una cubeta, de los controles, botón de encendido y apagado… ➢ En conclusión uno de los principales problemas del baño de flotación es que los tejidos si los ubicamos al borde de la cubeta estos por acción del calor se pueden quedar pegados al mismo dañando el teflón del mismo. RECOMENDACIONES
- Se recomienda pescar el tejido introduciendo totalmente el portaobjetos. · Se recomienda usar agua para el baño de flotación · Se recomienda tener a lado del micrótomo el baño de flotación 9. DESPARAFINACION Se extrae la parafina del tejido y se aclara nuevamente con XILOL.
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11. COLORACION (TINCION)
- Es un complejo fisicoquímico que les confiere color a los tejidos durante tiempos prologados
- Las moléculas de colorantes tienen un grupo que es el que le confiere el color cromóforo y otro que lo fija auxocromo Los colorantes son sales, pero se los clasifica en: BASICOS : en donde la molécula de sal que colorea es básica pero el compuesto que tiñe es ACIDO (BASOFILA) , como, por ejemplo; azul de toluidina, azul de metileno, hematoxina. ACIDOS : donde la molécula de sal que colorea es acida y tiñe compuestos BASICOS (ACIDOFILOS) , como por ejemplo; la eosina. NEUTROS : donde las dos partes de solución salina proporcionan color, es un ejemplo, es el eosinato de azul de metileno. Los tejidos animales son en su gran mayoría incoloros, excepto aquellos que poseen algún tipo de pigmento como la hemoglobina de la sangre o la melanina de la epidermis. En las plantas, sin
E s p i n o z a , L e a n d r o S. embargo, existe una mayor variedad de pigmentos naturales que permiten su observación directa con el microscopio óptico, a lo que también ayuda la presencia de las paredes celulares, las cuales facilitan la delimitación celular y la discriminación entre diferentes tejidos. Cuando se inventaron los primeros microscopios hubo que descubrir cómo teñir los tejidos para poder desentrañar sus características morfológicas. Se observó que algunos pigmentos como el carmín o la eosina, disueltos en agua, se unían a determinados componentes de los tejidos. La expansión de la industria textil en el siglo XIX y su necesidad de colorear las telas provocó un rápido desarrollo de los tintes o pigmentos. Muchas de estas sustancias fueron usadas como colorantes en la histología de los animales y de las plantas desde mediados del siglo XIX hasta la actualidad, alcanzándose un enorme desarrollo y perfeccionamiento de nuevas técnicas y moléculas sintéticas que se usan según las necesidades del investigador. Con la llegada de la biología molecular se han puesto en marcha otras técnicas mucho más sofisticadas para observar elementos celulares, entre las que se pueden destacar aquellas que usan anticuerpos, inmunocitoquímicas, las que usan sondas de ADN o ARN, hibridaciones "in situ", o más sofisticadas aún como las que mediante el diseño de animales transgénicos permiten identificar y observar a las células que expresan un determinado gen, incluso en el organismos vivo, gracias a la fluorescencia de la proteína verde fluorescente (GFP). No vamos a describir con detalle las técnicas más complejas, al menos no en estas páginas básicas, sino las más comunes, las que se suelen emplear en un laboratorio para el estudio general de los tejidos. Dividiremos el conjunto de técnicas histológicas en cinco categorías. a) Tinciones generales. Aquellas que usan sustancias coloreadas que se unen a componentes tisulares por afinidad electro-química. b) Histoquímica. Son aquellas técnicas de tinción que implican la modificación química de algunas moléculas tisulares para posteriormente ponerlas de manifiesto con colorantes. En este
E s p i n o z a , L e a n d r o S. Esta técnica generalmente utiliza como colorante el violeta de cresilo, este colorante es una anilina básica (cargada en forma positiva) que se une a las regiones basófilas de las células del tejido nervioso. También se utiliza el azul de tionina el cual da un color azul-violáceo. Tiene mayor contraste que la técnica con rojo neutro por lo que es la contracoloración elegida para el estudio de detalles citológicos y citoarquitectónicos. HEMATOXILINA EOSINA Es una coloración topográfica de rutina ya que permiten distinguir detalles morfológicos de células y tejidos. Existen múltiples variantes, según se emplee un tipo u otro de eosina y de hematoxilina (generalmente se emplea la hematoxilina de Harris). Por lo común, este método siempre consta de una etapa inicial, en la que se colorean los núcleos celulares con la hematoxilina (violeta), y en una fase ulterior de contraste citoplasmático y de los componentes extracelulares con la eosina (rojo- rosado). El método supone la aplicación de la tinción de hematoxilina, que por ser catiónica o básica, tiñe estructuras ácidas (basófilas) en tonos azul y púrpura, como por ejemplo los núcleos celulares; y el uso de eosina que tiñe componentes básicos (acidófilos) en tonos de color rosa, gracias a su naturaleza aniónica o ácida, como el citoplasma.
- La hemotixilina es un colorante nuclear que se comporta como un colorante básico al teñir los componentes ácidos de los tejidos (ej. Nucleo celular); se observa de color azul-violáceo
- La eosina es un colorante citoplasmático, acido, que tiñe los componentes básicos de los tejidos (ej. Citoplasma); se observa de color rosado Inmunohistoquímica
E s p i n o z a , L e a n d r o S. La inmunohistoquímica es una técnica utilizada para la localización de moléculas específicas en los tejidos mediante el empleo de anticuerpos (proteínas del tipo inmunoglobulina G). Es una técnica que gracias a la oferta comercial de anticuerpos y a la estandarización de su protocolo se ha convertido en un método sencillo, rápido y muy potente. Se basa en la gran especificidad y alta afinidad que tienen los anticuerpos para reconocer a moléculas y unirse a ellas. Además, la conjugación o combinación de los anticuerpos con enzimas o con sustancias fluorescentes permite detectar moléculas presentes en el tejido. IMPREGNACION ARGENTICA (sales de plata)
- Coloración con sales de plata que muestra gran afinidad por los componentes fibrilares de las células y sustancias intercelulares, principalmente por las fibras reticulares.
- Además, presenta gran afinidad por los elementos del sistema nervioso y por el aparato de Golgi ACIDO PERYODICO DE SCHIFF PAS
- El ácido peryodico oxida a los grupos oxidrilos (OH) de dos carbonos cercanos, formando de esta manera grupos aldehídos compuestos por carbono, oxigeno e hidrogeno, así la leucofucsina puede reaccionar con estos y dejar una tinción rojiza.
- Permite la tinción de componentes celulares que contienen hidratos de carbono, por ejemplo, algunas membranas celulares, células calciformes, en la mucosa del intestino, fibras reticulares que están rodeados por hidratos de carbono, etc. AZUL DE TOLOUDINA
- Colorante básico de color azul, que tiene la particularidad de cambiar de color (a rojo) en presencia de radicales ácidos, dando así METACROMASIA.
- Se denomina METACROMASIA a la tinción de algunos componentes de los tejidos de un color distinto que el colorante utilizado.
- Además, por ser un colorante básico, tiñe sustancias acidas, de color azul, dando así ORTOCROMASIA.
- Se denomina ORTOCROMASIA cuando se tiñen del mismo color que el colorante utilizado.
- Ciertos colorantes básicos (catiónicos) tienen propiedades metacromáticas; a este colorante se unen los grupos sulfatos, carboxilos y fosfatos, que están presentes en muchos proteoglunacos, ácidos nucleicos y algunos lipidos
