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RESUMEN DE PRIONES
El término “prión”, se usa para describir el agente infeccioso responsable de varias enfermedades neurodegenerativas. La palabra deriva de “proteinaccous infectious particle”, que significa “partícula proteica infecciosa”, definición propuesta por Stanley B. Prusiner en 1982.
Es una proteína hidrosoluble que se localiza normalmente en la membrana celular, carente de ADN, pudiendo por tanto replicarse sin genes. Los priones son variantes patogénicos de ciertas proteínas naturales que son producidas por la célula nerviosa o algún otro tipo de célula.
Las proteínas normales se denominan PrPc (proteína prion celular) para diferenciarla de las variantes patogénicas que también reciben el nombre de PrPSc (de scrapie; término que describe la encefalopatía de la oveja).
Las PrPc son producidas de la manera siguiente: El ARN que codifica las PrPc sale del núcleo a través de los poros de la membrana nuclear pasando a los ribosomas existentes en el retículo endoplasmático rugoso donde tiene lugar la síntesis de la proteína.
El prion anormal (PrPSc), tiene exactamente la misma secuencia de aminoácidos que el prion normal (PrPc). Ese es el motivo por el que nuestro organismo no reconoce al prion infeccioso como agente patógeno, la única diferencia, viene dada por su estructura tridimensional.
Se estima que esta proteína es más pequeña que la mayoría de los virus, y muy resistente al calor, a los rayos ultravioleta, a la radiación ionizante y a los desinfectantes comunes que habitualmente inactivan a los virus. También no causa reacciones inflamatorias o inmunitarias como cualquier agente infeccioso.
Se ha observado esta proteína en las membranas neuronales de los mamíferos sin causar enfermedad alguna, pero se sabe que un cambio conformacional de su estructura terciaria puede provocar la aparición de la enfermedad. Estas proteínas en su forma patógena se multiplican exponencialmente al ponerse en contacto con otras proteínas normales ya que les induce al cambio conformacional que las vuelve infecciosas.
La proteína PrP está constituida por cuatro regiones de estructura secundaria llamadas H1, H2, H3 y H4; en estas regiones se han identificado tres zonas de hélice α, llamadas A, B y C; y dos hoja plegada β, llamadas S1 y S2.
Las enfermedades de este grupo que incluye la enfermedad de creutzfeldt-Jacob (ECJ), el síndrome de Gerstmann-Straussler-Scheinker(GSS), El Insomnio Familiar Fatal y el Kuru en el ser humano; el “Scarpie” en ovejas y cabras; la encefalopatía transmisible del visón, y la encefalopatía espongiforme bovina (Enfermedad de las vacas locas), comparten una base etiológica que las diferencian de otras enfermedades neurodegenerativas e infecciosas.
Como su nombre implica se caracteriza predominantemente por la “alteración espongiforme” debida a la presencia de vacuolas intracelulares en las células neuronales. Clínicamente, la mayor parte de estos pacientes presenta una demencia progresiva.
El tipo más frecuente es la enfermedad ECJ, que aparece de manera esporádica y familiar aunque existen diferencias entre estos trastornos, todos ellos están asociados a la aparición de formas anómalas de una proteína especifica denominada proteína priónica (PrP), que son infecciosas y transmisibles. Por su descubrimiento de los priones Prusiner gano el premio Nóbel de Fisiología y Medicina en 1997.
PRIONES
II. LA ESTRUCTURA DEL PRION
La proteína PrP está constituida por cuatro regiones de estructura secundaria llamadas H1, H2, H3 y H4, en estas regiones se identifican tres zonas de hélice- F 06 1 llamadas A, B y C, y dos de hoja- F 06 2, llamadas S1 y S2.
Estudios mediante los métodos FTIR y CD han mostrado que la proteína PrPc contiene un 40% de hélice- F 06 1y muy poca proporción de hoja- F 06 2, mientras que la PrPSc se compone de un 30% de hélice- F 06 1y un 45% de hoja- F 06 2. Esta dualidad hélice- F 02 0F 06 1hoja- F 06 2parece localizarse principalmente en la región 106-126, que en forma de péptido sintético es un neurotóxico potente (Gasset et al. 1992; Forloni et al. 1993).
- Llamaremos a las tres hélices: HA, HB y HC. HA tiene una longitud de unos
- Alto contenido en hélices- F 06 2.
- Es insoluble en detergentes, formando agregados amorfos..
- Sufre una proteolisis limitada que genera una forma truncada agragante y que retiene la infectividad (Prusiner, 1991).
- No es susceptible a la acción enzimática con PIPLC para su liberación de la membrana, requiriendo un tratamiento desnaturalizante previo para la eliminación del GPI.
- Localización extracelular.
Se sabe que ambas isoformas PrP poseen anclas GPI (glycoinositol phospolipid), gracias a la cual, la PrPc se encuentra anclada en la superficie de la célula. Su transformación a PrPSc solo tiene lugar cuando la PrPc alcanza dicho lugar de forma que el GPI es determinante para la conversión ya que esta ocurra en dominios de la membrana donde estas proteìnas se encuentran ancladas (Taraboulos et al. 1995).
La PrPSc se encuentra dentro de la célula en estructuras del sistema endocítico y fuera de la célula en placas amiloides como PrPSc 27-30 KDa (Pan 1993). La adquisición de la resistencia a las proteasas de la PrPSc, es un proceso post- translacional, es decir, se adquiere tras el plegamiento. En el estudio de los modelos de PrPSc se halló un péptido menor derivado de este último, que constituía el núcleo proteasa-resistente de la PrPSc. Este péptido tenía una masa molecular de 27-30 kDa y se le llamo PrP27-30. Se ha encontrado este péptido en todos los casos de enfermedad prion, salvo en las enfermedades del Alzheimer, Parkinson y esclerosis miotrópica lateral.
Los residuos 113-128 , dentro de la región H1, son los más conservados en todas las especies estudiadas, y corresponden a una zona transmembranal de la PrPc que se organiza en hélice- F 06 1.
Los residuos 90-141 de PrP han demostrado ser suficientes para iniciar o bloquear la transformación de PrPc, probablemente porque constituyen el principal sitio de
unión de PrPSc a PrPc durante el proceso de conversión. Posteriormente, se identificó un segundo dominio entre los residuos 180-205 que parecen modular la interacción entre PrPc y PrPSc.
PRP 106-
Es una parte que se mantiene constante en todas las isoformas PrP acumuladas en los cerebros de pacientes afectados por enfermedades prion y, por tanto, constituye la partícula infecciosa. Además, el péptido PrP 106-126 es más soluble y fácil de manipular para el estudio de cultivos celulares que la partícula entera PrPSc.
Se ha demostrado que el péptido 106-126 cataliza la agregación de la proteína prion celular a una forma proteinasa K-resistente e induce la síntesis de una proteína prion transmembrana ( Ctm^ PrP), que se ha propuesto como mediadora de la neurotoxicidad en ciertos desórdenes, en lugar de los depósitos de agregados y la PrP proteinasa K- resistente únicamente. (14).
Se ha demostrado que PrP 106-126 induce muerte celular por apoptosis en una determinada línea celular neuronal humana, y lo hace a través de dos moléculas (caspasas y calpainas). Esto implica la mitocondria como un sitio primario de acción de la PrP106-126 (15). Además, aumenta la secreción de catecolaminas induciendo una via de entrada de Cd2+ resistente al Ca2+, y altera el acoplamiento de los canales de nativos de Ca2+ con la exocitosis
Según otro estudio, el péptido artificial PrP106-126 es neurotóxico in vitro debido a la adopción de la estructura fibrilar amiloidogénica agregante. Y parece que reduciendo los niveles de Cu^2 + y Zn^2 + aproximadamente tres veces respecto del nivel fisiológico, se inhibe la agregación del PrP106-126. Del mismo modo, eliminando por mutagénesis la His-111, Met-109 o Met-112, que se han
Nada más transcribirse el mRNA que codifica laPrP se obtiene una cadena peptídica de 254 aminoácidos. Esta cadena sufrirá posteriores modificaciones.
La primera modificación consiste en la separación de la secuencia líder N-terminal. Este segmento constituye la señal que indica a la proteína que ha de ir al retículo endoplásmico (Es la SRP). Una vez haya penetrado en el retículo endoplásmico (ER) se separa esta SRP del resto de la proteína. Esta SRP está constituida por los 22 primeros residuos.
Una vez introducida la molécula dentro del ER la proteina comenzará a plegarse, en este proceso se formará el puentedisulfuro que une Cys179 con Cys214. Otra modificación que se produce, y que es específica del RE, es la glicosilación de los residuos Asn181 y Asn197.
La siguiente modificación que se produce consiste en un ataque a Ser231 con GPI (Glicosilfosfatidilinositol), el resultado final es que PrP se corta tras Ser231, donde se le une una molécula de GPI que constituye el punto de anclaje a la membrana celular. Esa cola C-terminal que se ha eliminado constituye precisamente la señal que indica que se ha de producir esta modificación.
Tras todas estas modificaciones lo que tenemos es PrPc ( c ellular prion protein), que es la forma de PrP que nos podemos encontrar normalmente en las células. PrPc será pues una glicoproteina anclada a la membrana, orientada hacia el exterior, que se expresa en células del sistema nervioso.
Se sabe que en las enfermedades mediadas por priones, se produce un cambio conformacional en PrPc. Al nuevo isomorfo de la proteina se le llama PrPsc (llamada así por la enfermedad del scrapie). Este isomorfo parece ser que es capaz de inducir a PrPc para que se pliegue de esta nueva forma patológica. En este cambio conformacional de PrPc a PrPsc se ha observado que se incrementa de manera significativa la cantidad de láminas- F 06 2 , dandose una pequeña reducción en la cantidad de hélices- F 06 1. Más concretamente, según estudios con
FTIR(Fourrier-transform infrared) y con CD(dicroismo circular), PrPc contiene un 40% de hélices- F 06 1, y una pequeña cantidad de láminas- F 06 2, mientras que PrPsc está compuesta por un 30% de hélices- F 06 1, y un 45% de láminas- F 06 2.
También se ha encontrado una PrPsc a la que le falta una parte de la cola N- terminal. Concretamente se ha cortado entorno al resíduo 90. A este isomorfo se le conoce como PrP 27-30, y parece ser la fracción mínima que provoca la infección, de hecho es el principal componente de las placas que se producen en algunas enfermedades de priones.
LA BARRERA DE LAS ESPECIES.
La barrera fue descubierta por Pattison en los años 60 ( Pattison, 1966 ). La causa de la barrera de las especies es la existencia de genes PRNP diferentes según las especies. Estos genes se traducirán en proteínas PrP con secuencias particulares, que constituirán una estructura terciaria de prion característica para cada especie.
Así, el gen PrP del ratón difiere del de hámster en 16 codones de los 254 totales; y el de ratón del de humano en 28 codones, lo que da lugar a proteínas PrP con configuraciones distintas entre las especies.
LA PROTEÍNA X.
Es un pequeño ligando detectado mediante estudios genéticos y moleculares, que se une al PrPc y facilita su transformación a PrPSc. Su descubrimiento se basó en la teoría según la cual, moléculas del huésped podían influir en el comportamiento del PrPSc. Para ratificar esta teoría se inocularon ratones transgénicos con genes PrP humanos (HuPrP) y con genes PrP híbridos entre ratón y humano (MHu2M).
Los ratones con el gen híbrido infectados, desarrollaron la enfermedad más rápida y frecuentemente que los que poseían el gen totalmente humano. Este hecho llevó a afirmar la existencia de un factor procedente del ratón que reconocía las "regiones ratón" de la proteína PrP híbrida, facilitando el plegamiento de la PrPc híbrida; mientras que este factor no reconocía ninguna "región ratón" en la proteína PrPc totalmente humana (HuPrP) y, por tanto, no favorecía el proceso.
La proteína X está involucrada en el plegamiento de las proteínas naturales a su forma anómala, y para ello debe reconocer ciertos fragmentos de la proteína PrP sobre la que actúa. De esta forma, priones PrPSc procedentes de especies muy alejadas evolutivamente de la del huésped al que infectan no producirán la enfermedad fácilmente, necesitarán un largo periodo de incubación porque la proteína X no las reconocerá. Por la función que ejercía esta proteína se pensó que podía tratarse de una chaperona, pero hasta el momento no se ha identificado ninguna chaperona molecular en mamíferos que intervenga en el proceso de plegamiento de priones. La proteína X podría ser la PrPSc si éste hiciera las veces de ligando bidentado (Telling et al. 1995).
DIVERSIDAD DE LOS PRIONES.
Se observa una relación entre los patrones de deposición de PrPSc y los perfiles de vacuolación, y estos rasgos son usados para caracterizar las razas de priones.
Así, en la enfermedad prion FFI (fatal familiar insomnia) la deposición está confinada en gran parte al tálamo; en la enfermedad fCJD (familiar Creutzfeldt- Jakob Disease), los PrPSc se depositan en el manto cortical y en muchas de las estructuras profundas del SNC.
En la tabla siguiente se enumeran las enfermedades prion conocidas hasta ahora y alguna información nomenclatural referente a ellas:
Enfermedad Huésped natural Prion Forma PrP anormal
Forma celular Scrapie Ovejas y cabras Scrapie ShePrPScç ShePrP Prionencefalopatía transmisible del visón (TME)
Visón prion TME MkPrPSc MkPrPT Chronic wasting disease (CWD)
Mulos, ciervos y Alces
prion CWD MdePrPSc MDePr Encefalopatía espongiforme de los bovinos (BSE)
Vacas prion BSE BovPrPSc BovPrP Encefalopatía espongiforme de los felinos (FSE)
Gatos prion FSE FePrPSc FePrPF
Encefalopatía de los ungulados Exóticos (EUE)
Nyala y el gran Kudu
prion EUE NyaPrPSc NyaPrP Kuru Humanos prion kuru HuPrPSc HuPrPK Creutzfeldt-Jakob disease (CJD)
Humanos prion CJD HuPrPSc HuPrPC Síndrome de Gerstmann- Straussler-Scheinker (GSS)
Humanos prion GSS HuPrPSc HuPrPG Fatal familiar insomnia (FFI) Humanos prion FFI HuPrPSc HuPrPF Inicialmente, se pensaba que una mutación PrP específica estaba asociada con unos síntomas clínicos/neuropatológicos particulares. Pero ahora, con el reconocimiento de las enfermedades CJC, GSS y FFI familiares (es decir, heredadas) como autosómicas y dominantes, cada vez más, se han encontrado mutaciones PrP particulares en una familia que manifestaban síntomas clínicos diferentes a los acostumbrados.
Por ejemplo, muchos pacientes con la mutación PrP en el codón 102, presentaban ataxia y tenían placas amiloides PrP; estos pacientes eran diagnosticados como GSS, pero algunos de ellos desarrollaban la demencia propia del CJD.
infecciosos convencionales, observó que eran rápidamente inactivados al sobrepasar los 85ºC.
C. Weissmann por su parte, propone que el agente está formado por dos componentes:
- El PrPSc (apoprion), que puede causar enfermedades transmisibles incluso libre de ácidos nucleicos.
- Un ácido nucleico (coprion), del cual pueden existir muchas variantes. Es el que determina las propiedades fenotípicas que definen el linaje del agente infeccioso
Ambas partes constituyen lo que él denominó holoprion.
Laura Manuelidis , de la Universidad de Yale (EEUU) afirma que existen virus que disponen de un sistema de reparación del material genético que les permite resistir radiaciones similares a las que resiste el PrPSc; así como virus lentos convencionales, que escapan al sistema inmunitario instalándose en el interior de las células.
L. Manuelidis hace especial hincapie en varias características de los agentes infecciosos, a saber:
- La existencia de distintas cepas o razas de priones que causan diferentes patrones de enfermedad. Solo pueden aparecer representados en diferentes linajes o razas, aquellos patógenos que poseen ácidos nucleicos.
- Su multiplicación exponencial.
- Su tiempo de latencia prolongado.
- Infección del sistema retículo-endotelial ( bazo, glóbulos blancos ).
La evidencia de que la enfermedad nvCJD procedía de la epidemia de las vacas locas (BSE) constituyó otro argumento a favor, ya que la transmisión por vía oral
pone muy difícil la resistencia de un agente puramente proteico a la acidez y las enzimas del aparato digestivo. En cambio, muchos virus sí son capaces de sobrevivir a estas condiciones.
Mutaciones y polimorfismos del gen PRNP podrían inducir mayor susceptibilidad del huésped frente a ciertas cepas del agente infeccioso.
PRUEBAS.
H. Diringer halló en 1994 lo que parecía ser la primera evidencia física de la existencia de los virus. Su tamaño era inesperadamente pequeño: 10 a 20 nm. Un año después, el equipo de Manuelidis obtuvo un gel de electroforesis con bandas que revelaban la existencia de RNA en extractos cerebrales de hamsters con CJD. Las bandas no pudieron localizarse en cerebros no infectados ni en las librerias genómicas.
El tamaño de la partícula infecciosa fue evaluado en unos 27 nm, tamaño similar al de varios virus conocidos. El genoma se estimó en 1.000-3.000 pares de bases. Los investigadores concluyen que un ácido nucleico y una o varias proteínas constituyen los componentes intrínsecos del virus CJD (1). Los dos componentes no son infecciosos, a menos que se asocien en partículas nucleasa-resistentes
MINIPRIONES.
Se realizaron diversas pruebas para investigar la naturaleza patógena del prion, y se crearon priones mutantes para facilitar esto. Así, la destrucción de cualquiera de las cuatro regiones en hélice- F 02 0F 06 1de la proteína PrPc, previene de la formación del PrPSc. Mientras que suprimir la región del extremo N-terminal con los residuos 23-89, así como otros 36 residuos entre las posiciones 141-176 (ambas regiones en verde en la imágen: hélice A y hoja S2) no afectan a la aparición de PrPSc.
EDTA
Proteasas ( Tripsina, pepsina ), aunque reducen la infectividad Nucleasas ( ribonucleasas A y III, desoxiribonucleasa I ) Radiación ultravioleta ( 2540 Å ) Radiación ionizante
- Fatal en todos los casos.
- Carecen de cuerpos de inclusión.
- Presencia de ácido nucleico no demostrada.
- El único componente conocido es la proteína PrP.
- Pueden existir en múltiples formas moleculares
- Periodo de adaptación a nuevos hospedadores.
- Control genético de la susceptibilidad de algunas especies.
- Existencia de distintas cepas.
MÉTODOS DE INACTIVACIÓN:
- Autoclave >134 °C, 18 minutos
- Hipoclorito sódico (20ºC, 1hora)
- Hidroxido sódico 2N
- Fenol 90%
- Eter
- Acetona
- Permanganato potásico 0.002 M
- Urea 6 M
- 2 – Cloroetanol
- Cloroformo
Los procedimientos rutinarios de desinfección y esterilización son inadecuados para la eliminación de priones causantes del CJD. A saber: alcohol, óxido de etileno, formaldehído, glutaraldehído, peróxido de hidrógeno, yodo, radiación ionizante, fenoles, amonios cuaternarios o esterilización convencional por vapor de agua a 121ºC.
A pesar de los grandes esfuerzos realizados para encontrar el material genético de este agente infeccioso, solo pequeños fragmentos de menos de 100 nucleótidos han permanecido después de los procesos de purificación ( Meyer 1991 ), sospechándose que pueda ser únicamente material contaminante.
Tras descartar la presencia de ácidos nucleicos en los priones, también se desestimaron los carbohidratos y lípidos como elementos infecciosos. Prusiner resume que solo los procedimientos que hidrolizan o afectan a proteínas logran modificar la intensidad de la infección.
Se ha asumido la presencia de un pequeño ligando unido al prion, como componente esencial de la partícula infecciosa, ya que no se ha podido eliminar.
NOMENCLATURA.
