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Tema 17.Tema 17. Relación entre la ingeniería genética y lamicrobiología.
Índice 1.
Conceptos generales y definiciones:1.^
Biotecnología
Ingeniería genética (=tecnología del ADNrecombinante)
Objetivos de la ingeniería genética (=aplicaciones generales)generales)
Etapas de un experimento de ingeniería genética
Índice 4.
Herramientas de la ingeniería genética.1.^
Bacterias y enzimas bacterianos comoherramienta bioquímica
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Vectores de clonación: definición
- Plásmidos2. Bacteriófagos
Aislamiento y purificación del ADN clonado
Técnicas de selección y rastreo de los clonesrecombinantes.
Objetivo •^
Describir la importancia de losmicroorganismos como herramienta de laingeniería genética.
1. Conceptos generales y definiciones
Biotecnología: Uso de seres vivos o de componentes osistemas biológicos para la obtención de bienesy servicios. La biotecnología se sirve de
organismos
La biotecnología se sirve de
organismos
genéticamente modificados
(GMOs)
1. Conceptos generales y definiciones
Ingeniería Genética-Tecnología del ADNrecombinante: Conjunto de métodos que permiten
cambiar de forma
predeterminada
las características hereditarias de un
organismo, mediante la manipulación de su material genético
construcción
de
GMOs
genético
construcción
de
GMOs
Para la construcción de los organismos genéticamentemodificados,
se
requieren
técnicas
in
vitro
para
el
aislamiento
,^ manipulación
,^
recombinación
y
expresión
del ADN.
2. Objetivos de la ingeniería genética 1. Crear microorganismos
(bacterias, virus, hongos) capaces
de sintetizar grandes cantidades de proteínas de interésmédico o biotecnológico; por ejemplo:^ •^
Hormonas
(proteínas de mamíferos): insulina, hormona
del crecimiento, factores de la coagulación, etc.
-^
Factores antigénicos
: Vacunas (hepatitis B). Se
produce la proteína que produce la respuestaproduce la proteína que produce la respuesta antigénica, en lugar de emplear la proteína viral.
- Obtener microorganismos con un alto numero de copias
de
genes de interés; por ejemplo:^ •^
Bacterias recombinantes con aplicacionesbiotecnológicas.
-^
Plantas transgénicas
-^
Terapia génica.
Aislamiento y fragmentación del ADN.
Rastreo del fragmento de ADN de interés.
Incorporación del fragmento deseado en un^ vector (
clonación
3. Etapas de un experimento de ingenieríagenética:
vector (
clonación
Introducción y mantenimiento en un hospedador.
Detección y aislamiento del clon deseado.
Producción de un gran número de células queposean el gen clonado.
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 1.
Enzimas que modifican el ADN ADN polimerasas Enzimas que sintetizan ADN bicatenario, regenerando una de lasdos hebras del ADN tomando la otra como molde. Participan en los procesos normales de replicación del ADN en lascélulas bacterianas. Retrotranscriptasa viral Enzima de origen viral, que sintetiza ADN partiendo de ARNmcomo molde.Es muy útil en la ingeniería genética de genes eucarióticos.
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 2.
Rastreo de fragmentos de ADN Electroforesis La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utilizauna
corriente
eléctrica controlada,
con
la
finalidad
de
separar
biomoléculas
según
su
tamaño
y
carga
eléctrica,
a
través
de
una
biomoléculas
según
su
tamaño
y
carga
eléctrica,
a
través
de
una
matriz gelatinosa.Cuando una mezcla de moléculas ionizadas se coloca en uncampo eléctrico, experimentan una fuerza de atracción hacia elpolo que posee carga opuesta y migran hacia él. Así, al cabo deltiempo, las moléculas cargadas negativamente se acercarán alpolo positivo, y viceversa.
El ADN a pH alcalino está cargado negativamente
Pocillos con muestras de ADN
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 2.
Rastreo de fragmentos de ADN: Electroforesis
Las moléculas migran a mayor velocidad
cuanto menor es su tamaño
muestras de ADN
campo eléctrico
Tanque de electroforesisTampón de pH alcalino
Gel de agarosa
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 2.
Rastreo de fragmentos de ADN: Electroforesis
La detección de las bandas puedellevarse a cabo mediante un agenteintercalante: el
bromuro de etidio
.
Produce una fluorescencia en la bandaProduce una fluorescencia en la banda ultravioleta que permite seguirfácilmente el proceso de separaciónmediante el empleo de lámparasadecuadas.La identificación de las bandas puedeefectuarse mediante calibrado conmarcadores de DNA de tamañoconocido.
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 2.
Rastreo de fragmentos de ADN: Electroforesis
1 / movilidad
La movilidad esinversamenteproporcional al
tamaño
tamaño (P.M. o longitud)
Southern (1979) Anal. Biochem. 100, 319.
Bromuro de Etidio
La fluorescencia emitidapor el bromuro de etidiobajo luz UV permite laidentificación de las
bandas durante la
separación
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 2.
Rastreo de fragmentos de ADN: Electroforesis^ Aspecto de un gel teñido con bromuro de etidio a la luz UV
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 3.
Hibridación de ácidos nucleicos
Fundamento Permite la
detección
de moléculas diana inmovilizadas sobre
un
soporte
físico,
mediante
el^
empleo
de
una
sonda
específica
.
específica
.
La sonda es una molécula de ADN
complementaria
(total o
parcialmente) a la de la molécula diana (
ADN
ó
ARN
). La
complementariedad
posibilita
la
formación
de
un
híbrido
entre la molécula diana y la sonda.Si
la sonda es marcada
de modo visible (
fluorocromo
), tras
la hibridación se produce la
detección
de la molécula diana,
gracias a su unión con la sonda marcada.
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 3.
Hibridación de ácidos nucleicos
Moléculadiana
Adición desondamarcada
Lavado desonda nounida
Fundamento Mezcla demoléculas
Separación einmovilización
soporte
detección
Repaso: reacción en cadena de la polimerasa (PCR) 1º Desnaturalización^ 5’^ 3’
95°C
Annealing 5’^
P
P
50-60° C
P
3º Extensión
P
72°C
Taq
Taq
Duplicación ADN original
Taq
Taq
Repaso: reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
5’
er 1 ciclo
2º ciclo
N
= NF
I^
C 2
c= nº de ciclos
Termociclador
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 3.
Reacción en cadena de la polimesara (PCR)
Termociclador Aparato que automáticamenteestablece los ciclos detemperatura para la PCR
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 4.
Clonación molecular^ Aislamiento e incorporación de un fragmento de ADNdentro de un
vector
, en el cual puede replicarse en
una célula. Vectores de clonación Moléculas de ADN con capacidad de replicarse por símismos o de insertarse en un replicón, una vez que seintroducen en el organismo adecuado.
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 4.
Clonación molecular^ Características ideales de un vector de clonación•
Capacidad de
replicación autónoma
(plásmidos), o
de
integración
en el genoma del huésped
(bacteriófagos).(bacteriófagos).
-^
Marcadores seleccionables
:^ genes que confieren
algún rasgo que se pueda seleccionar fácilmente en ellaboratorio (ej. genes de resistencia a antibióticos).
-^
Dianas únicas
para al menos una enzima de
restricción.
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 4.
Clonación molecular
Plásmidos como vectores de clonación
Ventajas: • Pequeño tamaño.
pBR322:
con dos genes de resistencia a antibióticos (Ap
R, Tc
R) y con
dianas únicas para algunas enzimas de restricción. La inserción de un ADNforáneo se evalúa viendo la sensibilidad a uno de los antibióticos
- Estabilidad química.• Alto número de copias.• Marcadores (Ap
R, Tc
R).
- Dianas únicas para enzimasde restricción. 4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 4.
Clonación molecular
Bacteriófagos como vectores de clonación Vectores derivados de fagos lambda (
λ):
Pueden albergar insertos de 20 kb. La región central no esencial
se sustituye parcialmente
por fragmentos
de ADN de hasta 20 Kb que vehiculizados por el fago se integran en elcromosoma de la célula.
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 5.
Mecanismos para la transferencia del ADNrecombinante
El ADN recombinante, generado en el tubo de ensayo, esinerte. Hay que introducirlo en células vivas (hospedadoras) queHay que introducirlo en células vivas (hospedadoras) que sean capaces de
multiplicarlo
y
expresar
su información
genética.
Selección de los clones correctos Genes marcadores: 2. Gen
lacZ
Porta un gen Ap
R. Dispone de un
polylinker
(secuencia con múltiples dianas
únicas de enzimas de restricción) situado en el gen
lacZ
(β
-galactosidasa),
que convierte el sustrato X-gal a una sustancia azul, por lo que las coloniasaparecen
de
este
color.
Si
se
produce
una
inserción,
las
colonias
serán
blancas.
Plásmido pUC
Reconocimiento de los clones correctos: •^
Digestión con restrictasas y electroforesis:^ •
Chequeo de tamaños.
4. Herramientas en la tecnología del ADNrecombinante 5.
Mecanismos para la transferencia del ADNrecombinante
•^
Chequeo de tamaños.
-^
Mapa de restricción de los fragmentos clonados
-^
Secuenciación de ADN
