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TEORÍA MICROSCOPIO.
El microscopio del laboratorio es el compuesto, que tiene dos lentes, la primera amplifica la imagen real y la segunda amplifica la amplificación de la anterior.
Potenciómetro : rueda que sirve para variar la intensidad de la luz.
Micrómetro : ajustar el enfoque.
Aumentos: 4x veces, o 10x, 40x, 100x el tamaño de la muestra. Serían 40, 100, 400 y 1000 aumentos respectivamente.
Condensador : concentra la luz en la muestra y se regula con una rueda que mueve el diafragma para cerrar o abrir el paso de luz. Al elevar el condensador, ↑[luz] en un campo más pequeño.
En las lentes convergentes , si el objeto se sitúa dentro de la distancia focal, la imagen de C es una C’ virtual. Sino, son imágenes reales invertidas como la A’ y B’.
Aberraciones asociadas a las lentes convergentes:
- Esférica. Los rayos más alejados del eje principal se refractan más cerca de un punto céntrico.
- Cromática. La luz azul, de menor longitud de onda, es enfocada más cerca del objetivo.
Las distancias al objetivo y un juego de lentes intentan corregir las aberraciones anteriores. El “Plan” o plano que sale escrito en los objetivos significa que corrigen la curvatura del campo. El “Apo” o apocromáticos corrigen la aberración esférica.
En una lente no solo importa la amplificación, sino también la resolución (distancia mínima necesaria entre dos puntos para verlos desde una lente como dos puntos separados y no uno único).
La potencia de campo (grosor de muestra observada) va ↓ con el ↑ de la potencia del objetivo.
AN: apertura numérica que toma valores en el objetivo de 0’1, 0’25, 0’65 o 1’25.
Los objetos biológicos son objetos de fase , por lo que desfasan la luz con respecto a la no modificada (la onda va más lenta), pero no varía la amplitud como en los objetos de amplitud, por lo que nuestro ojo no percibe el cambio.
PREPARACIÓN DE UNA MUESTRA.
- Fijación: detiene el proceso de autolisis y descomposición de la muestra. Debe actuar rápido y provocar la insolubilidad y endurecimiento de la muestra.
■ En la química se usa formaldehído (formol), glutaraldehído, líquido de Flemming (para citología) o Líquido de Bouin (muy penetrante), manteniendo la estructura de la muestra intacta.
■ Por congelación con monóxido de C o N líquido, que preserva el material liposoluble y la actividad enzimática, es decir, no desnaturaliza las proteínas.
■ Por calor provocando la coagulación de proteínas, aunque también la destrucción de tejidos.
- Inclusión: deshidratar la muestra sometiéndola a soluciones de [OH] creciente y por último en xilol (buen disolvente e parafina). Luego se sustituye el H2O por parafina (MO) o resinas sintéticas (ME) para dar consistencia y rigidez.
- Microtomía: el micrótomo se usa para la fijación química y el criostato para congelación. Se relizan cortes más finos de la muestra gracias a unas cuchillas, que en el ultramicrotomo son de vidrio o diamante para mayor delgadez. Hidrofóbico.
- Tinción: consiste en hacer lo contrario que en la inclusión, hidratando la muestra porque los colorantes son hidrofílicos. Los colorantes ácidos (hematoxilina y eosina) tienen afinidad por las est.básicas y a la inversa.
- Montaje: se añade una gota de medio de montaje, que es transparente (no modifica el color) para que sea = al índice de refracción del vidrio, como la resina sintética DPX. Es necesario volver a deshidratar la muestra. Hidrofóbico.
CUESTIONARIO.
- ¿Cómo explicas el hecho de que al mover la platina del microscopio hacia la derecha, lo que observas se desplaza hacia la izquierda?
Como se utilizan lentes convergentes, la imagen que se ve es invertida.
- Dibuja un objetivo (40x) e indica a qué hacen referencia cada una de las anotaciones que contiene.
- ¿Cómo regulas condensador y diafragma cuando realizas el enfoque de una preparación con un objetivo de 10X, luego con uno de 40X y luego con uno de 100X?
Dependiendo de la densidad de la muestra. Cuanto mayor sea el aumento del objetivo más luz se necesitará, por lo que el diafragma estará más abierto y el condensador agrupará más la luz, es decir, ascenderá.
- Observa una preparación con los diferentes objetivos y aprecia el movimiento que puedes hacer con el micrométrico, en cada caso, manteniendo el enfoque. ¿Con que objetivo se desenfoca antes la muestra? ¿A que es debido?
En el objetivo más potente se desenfoca antes la imagen de la muestra, debido a la cercanía de ésta y a la potencia del objetivo.
- Como varían la distancia frontal y la profundidad de campo con los diferentes objetivos.
Se denomina así porque las muestras se tiñen con fluorocromos que se excitan con la luz UV ↑E y emiten visible ↓E. La fuente de luz se encuentra detrás del microscopio, que emite luz blanca y UV, y llega a un filtro que solo deja pasar la luz azul hasta el espejo dicroico que la refleja hacia la muestra. De la muestra, vuelve luz verde (debido a los fluorocromos) que sí atraviesa el espejo y llega al ojo.
Naturaleza química de fluorocromos: tienen una est. de anillos y pueden contener malcimida para marcar proteínas, ya que son reactivos con éstos. Ej: flouresceína (se apagan pronto) o flúor Alexa 488 (más duraderos), DAPI con afinidad por DNA que emite luz azul, GFP de medusas fluorescentes cuyo gen se ha clonado y se fusiona con el gen de interés para localizar la proteína que transcribe.
Problema: algunos fluorocromos se apagan pronto, pero se soluciona con medios de montaje (se coloca una gota antes de mirar la muestra) de P-fenilenadiamina para fluoresceína y n-propil galeato para rodamina.
Ventaja: permite marcar ≠est. de una =preparación. Es múltiple.
Microscopio de fluorescencia confocal: se combina fluorescencia y de contraste de fases en un mismo microscopio. El de contraste de fases permite observar una muestra viva sin teñirla, ya que no necesita fijación. Sin embargo, se ve una imagen difusa con un fondo gris y un borde refringente (blanco) alrededor de la molécula observada. Este microscopio intenta eliminar esa borrosidad excitando con un láser distintas zonas con fluorocromos. La imagen llega a una pantalla, o al ojo, lo que permite recomponer distintos cortes de imágenes de una misma muestra y solaparlas.
Gracias a la técnica FRAP y FLIP se confirmó que la MP es una est.fluida porque la zona de fluorocromos a la que apuntaba el láser se apagaba y se recobraba tras un tiempo si dejabas de incidir con el láser.
CUESTIONES
¿Qué es la faloidina, cuál es su origen y cómo afecta al citoesqueleto de actina? Es un tóxico procedente de un hongo que provoca la estabilización de los filamentos de actina y, por tanto, evita que polimericen.
¿Qué dimensiones tiene un filamento de actina? Tiene un diámetro de 7nm de grosor.
¿Qué resolución tiene el objetivo con el que has hecho la observación?
