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Siornédica 2001. 21 3 6 0 ~ 8
ARTICULO ORIGINAL
Ensayo cuantitativo para la determinación de
la actividad hidrolítica de la enzima biotinidasa
Ernesto C. González '. Libertad Diaz 2. Amarilys Frómeta '.
Darlenis Herrera '.Adonis Montenegro
.aoorniorio ac I P 7aje~ k ~ o n a l a. i e o i i o le irill.. I( e~.sü/(>. a r I Z < ~. < ~ O ; I .:.."a
nsi ii.10 ni. t.; en-i-is YIISICJS : Pre? I ~.. c ~ s / C I O ~ ~ J(it C. i ~ C t ~ i f i a r n e o ~ ~ ~ i ae inm..no og a a Habana,Cuba.
El presente trabajo describe la estandarización de un ensayo diseñado para cuantificar la actividad hidrolitica de la enzima biotinidasa en muestras de suero humano, el cual se basa en el método de Wolf y colaboradores, que emplea el N-biotinil-p-aminobenzoico (BPABA) como sustrato. Con la adición de detergentes a la solución de nitrito de sodio, se eliminan las burbujas de nitrógeno formadas durante la reacción de diazotación y se mejora la precisión del ensayo. Se observó que la congelación-descongelación de las muestras de suero no afecta la actividad hidrolitica de la enzima biotinidasa. La evaluación de la interferencia de fármacos en el ensayo mostró que con el sulfametoxasolltrimetoprim y la procainal benzilpenicilina hay desarrollo de color en ausencia del sustrato BPABA. Los valores promedio de actividad hidrolitica de la biotinidasa, obtenidos en un grupo de 205 niños sanos, fue de 7,04 i- 2,2 nmol/min/ml. No se encontraron diferencias estadisticamente significativas al evaluar la actividad de la enzima por sexo, raza y grupos de edad. Este ensayo se puede emplear en la determinación de la actividad hidrolitica de la enzima biotinidasa en muestras de suero humano y, específicamente, en la confirmación de los casos detectados por los programas de tamizaje neonatal para la deficiencia de biotinidasa. Palabras clave: deficiencia de biotinidasa, ensayo colorimétrico, tamizaje neonatal. Quantitative assay to determine the hydrolytic activity of biotinidase A quantitative assay was standardized to determine the hydrolytic activity of biotinidase in hu- man serum samples. The current Wolf et al. assay uses N-biotinyl-p-aminobenzoic acid as substrate. The assay's precision was improved by the addition of detergents to the sodium nitrite solution. This eliminated the formation of nitrogen bubbles during the diazotation reac- tion. Freezing and thawing of the serum samples did not affect the hydrolytic activity Farmaco's interference test showed positive results with sulfametoxasoi/trimetoprima and procainel benzylpenicilline. The hydrolytic activity of biotinidase averaged 7.04 '2.2 nmol/min/ml in a group of 205 healthy children. No statistically significant differences in enzymatic activity was observed between variables of sex, races and age group. The standardize assay can deter- mine the hydrolytic activity of biotinidase human serum samples and can confirm the positive cases detected by neonatal screening programs for biotinidase deficiency. Key words: Biotinidase deficiency, colorimetric assay, neonatal screening.
Uno d e los errores innatos del metabolismo d e la (^) biotinidasa. Descrita en la década d e los 50, la biotina lo constituye la deficiencia d e la enzima (^) biotinidasa e s la enzima encargada del reciclaje
Correspondencia: d e la biocitina obtenida d e la degradación d e las
Playa C. Habana, Cuba. (^) a las proteínas de la dieta, llevándolas a una forma Recibido: 07/05/01; aceptado: 19/11/01 (^) biológicamente viable (l,2). DETERMlNAClON DE LA DEFICIENCIA DE BlOTlNlDASA La deficiencia de biotinidasa es un trastorno (^) (PABA), el fosfato de potasio, el nitrito de sodio metabólico autosómico recesivo que se clasifica (^) (NaNOZ), el sulfato de amonio. el N-l-naftiletil- en deficiencia total (<lo% de actividad hidrolitica) (^) endiaminodihidrocloruro (vitamina K-6) y el ácido o parcial (10-30%)(3-5). El cuadro clinico y el (^) etilendiaminatetraacético(EDTA) se obtuvieron de tiempo de presentación de los síntomas es muy (^) Sigma Chemical Co., St. Louis, U.S.A. variable (6-10). La sintomatologia inicial está relacionada con el sistema nervioso: hipotonia **_Ensayo para determinar la actividad_** muscular, ataxia y retraso en el desarrollo **_hidrolitica de la enzima biotinidasa en_** psicomotor (6,8). También puede observarse **_muestras de suero humano_** pérdida de la audición, atrofia óptica, alopecia, (^) El ensavo se basa en una modificación al método problemas respiratorios, dermatitis, conjuntivitis, (^) descritiporwolf et al. (23), en [a cual se adicionan infecciones fúngicas e inmunodeficiencias (8). Las (^25) m1 de suero a una mezcla de reacción manifestaciones bioquimicas más frecuentes son la acidosis cetoláctica y la aciduria orgánica. La descompensación metabólica puede llevar al coma y a la muerte (6). Un diagnóstico temprano en el periodo neonatal permite una terapia efectiva con biotina (6-8). En 1984, se comenzó el primer programa de tamizaje neonatal de la deficiencia de biotinidasa en el estado de Virginia, Estados Unidos (11). Otros paises también han desarrollado programas para el tamizaje de la enfermedad como un acto de medicina preventiva (12-21). Se estima que la incidencia mundial de la deficiencia de biotinidasa es de 1:60.000 (4). Su incidencia es baja si se compara con otras patologias conocidas como son el hipotiroidismo congénito (1:4.000) y la fenilcetonuria (1 :15.000), pero es similar a otras como la galactosemia (1 :60.000). El presente trabajo describe la estandarización de un ensayo colorimétrico que permite la cuantificación de la actividad hidrolitica de la enzima biotinidasa en muestras de suero humano. La interferencia de los medicamentos de la familia de las sulfonamidas se ha informado en los ensayos para la detección de la deficiencia de biotinidasa que emplean el BPABAcomo sustrato. Por tanto, es importante evaluar el posible efecto de fármacos de uso común en el período neonatal y en la infancia sobre este tipo de ensayo, para disminuir la posibilidad de falsos resultados (11,22). **_Materiales y métodos_** **_Reactivos_** El ácido tricloroacético (TCA), el N-biotinil-p- aminobenzoico (B-PABA). el p-amino-benzoico compuesta por 200 mM del sustrato B-PABA y 4,5 mM de EDTAen solución tampón fosfato de potasio, 47 mM, pH 6,O para un volumen final de 500 ml. Se empleó una curva de calibración de 5, 1 0 , 2 0 , 4 0 y 80 mM de PABA y 4,5 mM de EDTA en solución tampón fosfato de potasio. 47 mM, pH 6,O. Se incubó a 37 "C en cámara húmeda para que ocurriera la reacción enzimática. Se detuvo la reacción con 50 m1 de una solución fria de TCA (1,84 M). Después de 10 minutos, se centrifugó a 16.000 g; se tomaron 300 ml del sobrenadante y se le añadieron 100 ml de agua destilada. Luego, se adicionaron 40 ml de los siguientes reactivos con intervalos de 3 minutos: nitrito de sodio (14,5 mM), sulfamato de amonio (43,8 mM) y vitamina K-6 (3,86 mM). Se esperaron 10 minutos y se transfirieron 200 ml a placas microELISA. Se midió la densidad óptica a 546 nm, empleando el lector de placas Fluorimetro- Fotómetro PR 521 (Tecnología SUMA, Centro de Inmunoensayo). La figura 1 muestra el diagrama de la reacción enzima-sustrato, los productos obtenidos y las reacciones que dan lugar a la formación del complejo coloreado. La actividad enzimática se calculó según la siguiente fórmula: actividad enzimatica = n m o l e s d e PABA producidosltiempo de incubaciónivolumen de muestra. Se determinó si la adición de detergentes a la solución de nitrito de sodio eliminaba las burbujas de nitrógeno formadas durante la reacción de diazotación, las cuales interfieren en la señal obtenida de absorbancia. Se emplearon los DETERMINACION DE LA DEFICIENCIA DE BiOTlNlDASA metabólicos que puedan asociarse con la deficiencia de biotinidasa. **_Análisis estadístico_** Para el análisis estadístico de los datos se utilizó el programa Statistics for Windows, versión 4.5. Para evaluar la influencia del proceso de congelación-descongelación sobre la actividad de la biotinidasa en muestras de suero humano, se utilizó un análisis de varianza (AROVA) de clasificación simple. En la comparación de los valores promedios de actividad hidrolítica de la enzima biotinidasa, obtenidos por sexo, raza y grupos de edad se empleó la prueba t de Student. Con ambos datos estadísticos se trabajó oara un nivel de significación de p<0,05. **_Resultados y discusión_** **_Evaluación de la adición de detergentes a la solución de nitrito de sodio y determinación del tiempo óptimo de incubación del ensayo_** En la figura 2 se muestran los valores promedio de absorbancia obtenidos para cada punto de la curva de PABA al evaluar la adición de los detergentes no iónicos tritón X-100 y tween 20 a la solución de nitrito de sodio, con el objetivo de eliminarlas burbujas de nitrógenoformadasdurante la reacción de diazotación y que pudieran interferir en la medición de la absorbancia. Los altosvalores de absorbancia para la condición en la cual no se adicionó ningún detergente están asociados con las interferencias provocadas por la presencia de las burbujas en la solución. No se observaron grandes diferencias en los valores promedios de absorbancia obtenidos entre todas las condiciones donde se adicionó detergente. Sin embargo, la evaluación visual mostróque sólo se eliminaban completamente las burbujas de nitrógeno en la solución empleando el nitrito de sodio que contenía tritón X-100 al O,l%. Este detergente en concentraciones entre 0,l y 0,5% no afectó la actividad de la enzima y ya había sido empleado en el tampón sustrato (24). Con la adición de este detergente a la solución de nitrito de sodio, se mejoraron los valores de absorbancia que se obtienen para el calibradorde concentración de PABA igual a O. Esto garantiza una mejor separación entre los dos primeros puntos de la curva de calibración y mejora la precisión del ensayo. El cuadro 1 muestra los valores de absorbancia obtenidos al incubar a 37 "C la curva de PABA a diferentes tiempos. El tiempo de incubación no afectó los valores de absorbancia obtenidos para las diferentes concentraciones de la curva de calibración y se obtuvo una buena correlación (0,999) entre todos los tiempos estudiados. Seevaluó el efecto del tiempo de incubación sobre los valores promedio de absorbancia obtenidos con una muestra de suero humano con actividad normal de biotinidasa. Los resultados se pueden observar en la figura 3. A partir de los 60 minutos de incubación de las muestras con la solución sustrato, se obtuvieron valores de absorbancia que no variaron con el tiempo de incubación. Estos valores de absorbancia se encuentran en una zona media de la curva de PABA lo cual nos permite hacer una buena discriminación entre las muestras de individuos afectados con la enfermedad e individuos con actividad normal de biotinidasa. A partir de estos resultados, se decidió emplear en el ensayo un tiempo de incubación de 60 minutos. La absorbancia se pudo medir en el lector fluorímetro-fotómetroPR 521, 10 minutos después del desarrollo de color y se observó que esta sefial era estable durante dos horas si se mantenían las placas protegidas de la luz. **_Precisión y exactitud_** En el cuadro 2 se muestran los coeficientes de variación (CV) intra e interensayo. En ambos casos se evaluaron muestras de actividad de biotinidasa conocida y que abarcaban un amplio intervalo de la curva de calibración del ensayo. En todos los casos, los coeficientes de variación fueron inferiores al 10%. Los porcentajes de recuperación obtenidos para el ensayo al mezclar muestras de suero humano con actividad de biotinidasa conocida, fueron de 98,3+7,5% y los porcentajes individuales oscilaron entre 94 y 108%. Los resultados anteriores nos permiten plantear que el ensayo es preciso y exacto dentro de un intervalo que garantiza poder diferenciar poblaciones con diferentes valores de actividad de la enzima biotinidasa. **_Determinación del limite de detección_** El límite de detección del ensayo se definió como el valor promedio de absorbancia del calibrador O de la curva de calibración más tres desviaciones estándar. La actividad mínima detectable fue de 0,64 nrnollminlml. Este valor de actividad nos permite utilizar el ensayo para evaluar la actividad de la enzima biotinidasa en poblaciones normales y clasificar la deficiencia en total o parcial. La deficiencia total se informa para valores de actividad inferiores a 0,7 nmollminlml y la ### deficiencia parcial en un rango de actividad entre 0,7:y 2 1 tirnollminlml. Los heterocigóticos obligados muestran una actividad enzimática entre 2,2 y 5,2 nmollminlml (24). **_Pruebas de interferencia_** En ausencia de sustrato no hubo interferencia en las muestras de suero a las que se le adicionaron las diferentes concentraciones (0-10 mglml) de **0.** **EdTseen 20 (0.05%)** ## E - *:/:: ~ $ **0,** ? ## o 0.2 , 0.1 **1** o -~ , ~-,^ ~ _O_ 30 _60_ **_90_** O **20** _80_ **Tiempo**^ **de**^ **incubaci6n**^ **(minutos)** Figura 2. Comparacián de los valores promedio de Figura^ **3.**^ Efecto del tiempo de^ incubación^ cobre^ los^ valores absorbancia ("=S) obtenidos para los puntos de la curva de de^ absorbancia^ **e n**^ una muestra^ **d e**^ suero humano^ **con** PABA al emplear detergentes **en** la solución de nitrito de actividad normal de la enzima biotinidasa. sodio. Cuadro 1. Valores promedio de absorbancia **d e** la curva de PABA a diferentes tiempos de incubación Curva lumoilmll Tiempo (min) CV: coeficiente de variación para **cada** punta de la curva Cuadro 2. Precisión del ensayo. p~~~~ Actividad enzimática Desviación CV Actividad enzimática Desviación CV (nmoi/min/ml) estándar intraensayo (nmoLlminlmi) estándar interensayo (n=20) (n=10) primarios en la estructura aromática de estos fármacos contribuye a la formación del complejo coloreado aún en ausencia de la enzima biotinidasa. Los estudios que se han realizado no han analizado las condiciones farmacológicas de biodisponibilidad y degradación del medicamento (11,22), lo que no descarta la posibilidad de que algunos de sus metabolitos puedan generar otros interferentes. Los fármacos evaluados son de uso común en el periodo neonatal y en la infancia en general, por lo que estos estudios de interferencia son un elemento muy importante a tener en cuenta al emplear este ensayo, ya que la presencia de ciertos fármacos puede ser una fuente de falsos negativos y, en aquellos casos en que se obtengan valores de absorbancia muy altos, se debe sospechar la presencia de interierentes. De hecho, se recomienda realizar las dos determinaciones simultáneamente (en ausencia y presencia de sustrato) para descartar posibles interferencias (11,22). **_Efecto de la congelación-descongelación sobre la actividad enzimática_** El cuadro 5 muestra los resultados obtenidos al evaluar el efecto de la congelación-descongelación sobre la actividad enzimática de la biotinidasa en cinco muestras de suero humano. El proceso de congelación-descongelación n o afectó significativamente la actividad de la enzima biotinidasa.~ ~ En este trabajo nos referimos a la actividad hidrolitica de la enzima. pues es la única función que se puede medir con el ensayo. Por tanto, no podemos afirmar que las otras funciones de la enzima biotinidasa, por ejemplo, la actividad biotiniltransferasa (24), no se vean afectadas por el proceso de congelación-descongelación. Hay que señalar que este estudio se realizó con muestras recientes, por lo que seria interesante evaluar este efecto con muestras conservadas por largos periodos a diferentes temperaturas. **Cuadro 5. Efecto de** la **congelación-descongelación de las muestras de suero humano sobre la actividad de la biotinidasa: para el análisis estadística** **_se_** **empleó un analisis de varianza** (ANOVA) **de clasificación simple.** **Actividad Descongelaciones enzimática** lnmollminlmli **1 2** 3 **_4 5 D_** de niños (n=205), con un promedio de edad de 6,5+4,2 años, fue de 7,04?2,2 nmollminlml. Este resultado es similar a lo informado para otras poblaciones con actividad normal de la enzima (25,26). No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los valores promedios de actividad de la enzima al realizar el estudio por sexo (p=0,33) y raza (p=0,38). La deficiencia de biotinidasa ha sido descrita en distintas poblaciones y no se ha determinado la existencia de una mayor frecuencia de aparición por sexo o raza. En el cuadro 6 se pueden observar los valores de actividad enzimática obtenidos para tres grupos de edad diferentes. El valor medio de actividad de biotinidasa obtenido para el grupo 1 fue ligeramente mayor que en el resto de los grupos; sin embarao. no hubo diferencias estadistica- mente sigKifjcativas al realizar la prueba t de Student entre los grupos 1 y 2 (p=0,1l ) , los grupos 1 y 3 (p=0,21) y los grupos 2 y 3 (p=0,94). Se ha informado que los niveles de actividad de biotinidasa en recién nacidos es entre 50 y 70% inferior al valor promedio de la población adulta (22); pero los niveles de actividad en adultos se alcanzan al mes de nacidos (27). Esto coincide con nuestros resultados, en los cuales el valor medio de actividad de biotinidasa por grupos de -. edad es similar a lo informado para la población adulta. Los valores de activjdad enzimática **_Determinación de la actividad de la enzima_** obtenidos con las muestras 2 y 3 (cuadro 4), que **_biotinidasa en muestras de suero_** los define como heterocigóticos obligados. hablan El valor promedio de actividad hidrolitica de la de la necesidad de realizar estudios que permitan enzima biotinidasa obtenido al evaluar un grupo evaluar la frecuencia de portadores de genes para #### R E V I S I Ó N D E TEMA ## Infecciones por Haemophílus influenzae en ## la población pediátrica Camilo Enrique Gutiérrez División Centro Control de Enfermedades,Inctltuta Nacional de Salud, Bogotá, D.C. Colombia Haernophilus influenzae es un microorganismo causante de una variada gama de patologias en diferentes segmentos de la población, especialmente en la población pediátrica, en la cual representa una carga importante en morbilidad, mortalidad y gastos en salud a nivel mundial. L ~ Sinfecciones por este agente cubren un gran espectro que vadesde colonización asintomática del tracto res~iratoriosuoerior. infecciones suoerficiales v localizadas hasta afecciones sistémicas graies como sepsis. meningitis o epiglotitis. Se hace una revisión actualizada de la infección por H. influenzae, con especial énfasis en los aspectos microbiológicos, de su patogenia, la epidemiología, los procedimientos de diagnóstico y de tratamiento, y se incluyen algunos comentarios sobre las enfermedades especificas causadas por este agente patógeno. mencionando, también. las estrategias de prevención y el impacto de la vacunación contra este agente. Palabras clave: H. influenzae. infección, enfermedad invasora, factores de riesgo. vacunas. Haemophilusinfluenzae infections in children Haernophilus influenzae is the causative agent for a variety of diseases. especially among children, and exacts an important human toll in terms of morbidity, mortality and health-related expenses. lnfections caused by this agent can range from asymptomatic colonization of the upper respiratory tract - including superficial and localized infections - to severe systemic complications such as sepsis, meningitis or epiglottitis. Aspectos of this disease reviewed include the following: (1) microbiological aspects, pathogenesis, epidemiology. (2) diagnostic procedures and treatment, (3) specific diseases caused by this agent, and (4) prevention strategies and the impact of vaccination. Key words: H. influenzae, infection, invasive disease, risk factors, vaccines. Haemophilus influenzae es un microorganismo causante d e una variada gama de patoiogias, especialmente en la población pediátrica, en la c u a l r e p r e s e n t a u n a c a r g a i m p o r t a n t e e n morbilidad, mortalidad y gastos en salud a nivel mundial. Las infecciones por este agente cubren u n gran espectro que va desde colonización asintomática del tracto respiratorio superior e infecciones superficiales y localizadas, hasta afecciones sistémicas graves como meningitis o ### epiglotitis (1 ). S u alta incidencia en algunos sectores d e la población y s u capacidad para Correspondencia: [email protected] Recibido: _23103101:_ aceptado: _06107101_ producir enfermedades graves, sumado a la posibilidad actual de tratamiento y prevención eficaz por medio d e la vacunación, hacen d e este agente uno d e creciente importancia dentro de la práctica actual e n las á r e a s d e m e d i c i n a , bacteriologia y salud pública, entre otras. El propósito d e este artículo es presentar, después de una revisión actualizada de la literatura mundial, l o s p r i n c i p a l e s a s p e c t o s m i c r o b i o l ó g i c o s , e p i d e m i o l ó g i c o s y f i s i o p a t o l ó g i c o s d e l a enfermedad por H. influenzae, y el estado del arte en los métodos d e diagnóstico, tratamiento y prevención de la enfermedad por este agente, haciendo énfasis en su incidencia epidemiológica sobre la población colombiana. D e igual manera, se resalta la importancia de la vacunación y su impacto a nivel mundial y, especialmente, en molecular se ha centrado en la identificación de Colombia. las proteínas de la membrana externa,^ P1^ a P6, El microorganismo fue observado por primera vez en 1882 por Roberi Koch en un exudado conjuntival y lo denominó Haemophilus aegypticus o bacilo de Koch-Weeks. Posteriormente, fue aislado por Richard Pfeiffer en 1892 en el esputo y en el tejido pulmonar de pacientes infectados durante la pandemia de influenza ocurrida dos años antes, por lo que fue inicialmente denominado bacillus Pfeiffer (2). Sólo hasta la pandemia de influenza de 1918-1919 se reconoció la bacteria como parte de la flora normal del tracto respiratorio superior y no como el agente causal de la influenza, como se pensaba hasta entonces. En 1920, Winslow y sus asociados cambiaron e l nombre d e l microorganismo a Haemophilus influenzae, debido a sus caracteristicas especiales de cultivo, especificamente su requerimiento de factores X y V (ambos presentes en eritrocitos y liberados por lisis de esas células), lo que Ilevó al nombre de Haemophilus, que significa "amante de la sangre", e influenzae por su tradicional relación con la influenza (3). En 1931, Margaret Pittman definió las características de las cepas capsuladas y no capsuladas de H. influenzae y distinguió entre las capsuladas seis serotipos antigénicamente diferentes que denominó con letras de la "a" a la ### "Y (4). Además, explicó algunas caracteristicas especificas del serotipo b, lo cual Ilevó a las primeras terapias con antisuero equino y, posteriormente, de conejo para tratar infecciones por H. influenzae tipo b (5,6). Hasta 1933, cuando se descubrió el agente de la influenza, se le consideró como agente causal d e esta enfermedad. Desde entonces, se acepta que H. influenzae es un invasor secundario en esta enfermedad. En las últimas décadas se han desarrollado otros sistemas más finos de caracterización taxonómica para los aislamientos de H. influenzae, entre los cuales se destaca la tipificación basada en los perfiles de movilidad electroforética de un gran número de enzimas rnetabólicas, la subtipificación de acuerdo con el perfil electroforético de las proteínas de membrana externa y aquéllos b a s a d o s e n l a h e t e r o g e n i c i d a d d e los lipooligosacáridos (7). La investigación en biologia las cuales se estudian como variables antigénicas que podrían considerarse blanco para la elaboración de vacunas (8,9). De igual manera, se realiza la caracterización de adhesinas, proteasas y otras proteínas constitutivas ( l o ) , y la caracterización de aislamientos ecpecificos a través de procedimientos como la electroforesis en campo pulsado (11), para determinar patrones d e invasividad y respuesta antigénica del hospedero (12), y el aislamiento de Iocus genéticos a través de medios como el multiplex PCR modificado con polimerasa AmpliTaq Gold (13,14), que permite el análisis y modificación por disrupción génica de los productos transcrip- cionales, la identificación de mecanismos de resistenciaantibacteriana y el desarrollo de nuevas herramientas contra este agente patógeno (15,16). El manejo reciente de H. influenzae se ha centrado en la prevención, básicamente con el desarrollo de nuevas vacunas. Microbiología H. influenzae es un cocobacilo Gram negativo pequetio (1 x 0,3 mm), no móvil, no esporulado, que aparece filamentoso o pleomórfico en especi- menes clínicos, lo cual puede dificultar en ocasiones su diagnóstico y que crece mejor en atmósfera microaerofilica. Sus colonias son usualmente granulares, transparentes o ligeramente opacas, circulares, con forma de domo y presentan un olor característico (17). Su cultivo se realiza en medios enriquecidos con eritrocitos lisados por calor (agar chocolate) o por degradación peptidica (medio de Fildes); para su desarrollo, requiere de una temperatura de 35 "C y una atmósfera de 5 a 10% de CO, (18). Para su crecimiento in vitro, necesita los factores X y V. El factor X o hemina es estable al calor, contiene protoporfirinas necesarias para el funcionamiento de citocromos en la cadena de transporte de electrones, catalasas y peroxidasas. Este factor es útil para distinguir entre las especies de Haemophilus,ya que H.parainfluenzae no requiere del factor X para su crecimiento in vitro. El factor V es una coenzima termolábil relacionada con los nucleótidos de adenina NAD y NADP. Sus mínimas (CIM) por microdilución en caldo o en a la presencia de reflujo en la trompa de Eustaquio, agar o por la prueba de epsilon (E-test), confirman cuerpos extraños, alteraciones del epitelio en la categoría de la resistencia (19) (cuadro 1). fumadores, antecedentes de infecciones virales o Varias estructuras de la superficie del microorga- nismo son fundamentales en los procesos de patogenicidad. La cápsula de polisacáridos que recubre a H. influenzae tipo b consta de repeticiones de polimeros de ribosilribitolfosfato íPRP\ (211. Este hecho es de aran im~ortancia, alteraciones inmunológicas puntuales, como las exacerbaciones de bronquitis crónica, otitis media, sinusitis y conjuntivitis, en tanto que la bacteremia es rara. Otros serotipos como el a, c y f se encuentran hasta en un 2% de los portadores y muy raramente se asocian con patoloyías(28). ,~ , debido a que casi el 95% d e las infecciones (^) Las infecciones invasoras se caracterizan por la invasoras (meningitis, bacteremia) son causadas (^) diseminación hematógena del microorganismo y porel tipo b (22-24).Los otros serotiposcapsulares (^) son ocasionadas, por lo general, por ceDas están compuestos principalmente por hexosas y (^) capsuladas, principalmente tipo b, que se sóloocasionalmentecausanenfermedad invasora. (^) encuentran en 3 a 5% de los oortadores v Las cepas no capsuladas causan, de manera (^) generalmente causan meningitis (;asta en 50% frecuente, infecciones del tracto respiratorio Y (^) de los casos de enfermedad invasora)(10,11,29), estructuras adyacentes, pero casi nunca llevan a infeccionessistémicas. Las endotoxinas (lipooligo- sacárido) y algunas proteínas como adhesinas, IgA proteasas, hemosina y otras que forman filamentos (fimbrias o pili), constituyen factores importantes en la adhesión, patogenicidad y viabilidad del microorganismo (2526). De igual manera, las proteínas de membrana externa (OMP) cumplen funciones que aún no han sido bien determinadas del todo, pero que son fundamentales en estos procssos (27). Patogenia Con base en el biotipo y en el serotipo, se han determinado diferentes manifestaciones clinicas y patológicas de la infección por H. Nlfluenzae. El biotipo I se aisla con mayor frecuencia en los pacientes con meningitis, siendo H. influenzae tipo b parte de este biotipo. Se ha encontrado usualmente mayor resistencia bacteriana en los biotipos I y II. En las vías urinarias se aislan generalmente los biotipos II, Ill y IV. El biotipo IV es más común en infecciones neonatales y maternas (28). Las infecciones asintomáticas y de las mucosas son las más comunes, ocasionadas, en su mayoría, por cepas no capsuladas que se encuentran en las vías respiratorias superiores en 50 a 80% de los portadoresjóvenes y niños en edad preescolar. Sus principales manifestaciones se producen por extensión desde el tracto respiratorio, facilitadas por alteraciones en el hospedero debido epiglotitis, neumonía, empiema, artritis séptica, celulitis, osteomielitis, pericarditis y bacteremia. De manera menos usual, causan glositis, tendosinovitis, peritonitis, endocarditis y ventriculitis. Es fundamental resaltar que esta clasificación no es excluyente y que se han reconocido cepas deserotipo b causantes de otitis media o sinusitis (30). Algunas cepas no capsuladas son causa poco común de sepsis neonatal (31) y hasta de un 50 % de los casos de meningitis por H. influenzae en edades mayores, especialmente en inmunosuprimidos o personas con defectos anatómicos, trauma encefálico o antecedentes de procedimientosneuroquirúrgicos. Algunas cepas no tipificables son causa común de infecciones invasoras del tracto respiratorio inferior en niños con malas condiciones socioeconómicas (32) y también de bacteremia en adultos (33). Epidemiologia Los humanos son los únicos rese~oriosde H. influenzae. La bacteria se encuentra comúnmente en la faringe y, en menor grado, coloniza las mucosas de la conjuntiva y del tracto genital. La transmisión de persona a persona se produce por vía aérea o por contacto directo con secreciones respiratorias contaminadas; existe alguna evidencia de la transmisión porfómites (34).Algunos estudios han encontrado que hasta 80% de la población es portadora de H. influenzae, especialmente niños sanos que asisten a guarderías, la mayoría de Biornédica 2001:21369-88 H^ _I N F L U E N Z A E_^ EN^ LAPOBLACION^ PEDlATRlCA ellos asintomáticos y portadores de cepas no capsuladas, las que. generalmente, cumplen varios ciclos de transmisión antes de generar la enfermedad en un hospedero susceptible, por lo que es dificil determinar con exactitud los periodos de incubación y el patrón de enfermedad durante endemias (35). La enfermedad invasora por H. influenzae tipo b ocurre de manera endémica y entre 85 y 95% de los casos se presentan en niños menores de 5 años (36-38). Los estudios de vigilancia epidemiológica llevados a cabo por el CDC de Atlanta, a través del National Haernophilus influenzae (Hi) Surveillance Prograrn, estimaron la incidencia de la enfermedad invasora por H. influenzae tipo b en los Estados Unidos en menores de 4 años en 1,81100.000 en 1994 y 1,61100.000 en 1995, es decir, aproximada- mente 8.000 casos por ario (39). Al comparar las incidencias anteriores a la introducción de la vacunación en 1985, que arrojaban datos entre 12.000 y 25.000 casos anuales, se evidencia una reducción muy importante (40,41). En 1996 y 1997, se informaron únicamente 144 casos confirmados de enfermedad invasora por H. influenzae tipo b (42). En diversos estudios se ha observado un patrón de enfermedad estaciona1con un pico entre septiembre y diciembre y otro en marzo y mayo. La razón de estos picos se desconoce, pero se plantea la relación con los nacimientos y el ingreso al. colegio de hermanos mayores, quienes introducen el microorganismo en el hogar (43). En Colombia, las infecciones invasoras del tracto respiratorio inferior y la meningitis constituyen las principales causas de muerte y de hospitalización en menores de 5 años y se estima que H. influenzae puede ser responsable de 39% de esas muertes y hasta de 30% de los casos incidentes (44). Se ha calculado aproximadamente un número de 8.692 casos anuales de enfermedad del tracto respiratorio inferior o meningitis en menores de 5 años, de los cuales mueren 4.121 (45). Desde 1994, el Grupo de Microbiologia del Laboratorio Nacional de Referencia del Instituto Nacional de Salud, en colaboración con 17 Laboratorios de Salud Pública de diferentes departamentos, estableció el programa d e vigilancia de meningitis bacteriana aguda con el fin de mejorar la calidad del diagnóstico y conocer la frecuencia de aislamiento de los principales agentes etiológicos, sus serotipos y el patrón de susceptibilidad. En 1995, se lograron recolectar 130 aislamientos de 11 ciudades o departamentos, de los cuales los de H. influenzae representaban el 45%, seguidos de Neisseria rneningitidis (27%). En menores de 5 años fue el más frecuente (60%) seguido de Streptococcus pneurnoniae (20%) y Neisseria meningitidis (17%) (46,47). Del total de aislamientos de LCR obtenidos en 1996 (n=248), provenientes de 13 de los 17 Laboratorios de Salud Pública, 110 (44,4%) fueron H. influenzae serotipo b, de los cuales, 88,2% fueron recuperados en niños menores de 5 años. Los Laboratorios de Salud Pública Departamen- tales informaron haber procesado 4.548 muestras de LCR, de las cuales 329 (72%) tuvieron un aislamiento y, de éstos, 100 (30,4%) correspondían a H. influenzae (48). En 1997, el Sistema de Vigilancia Epidemiológica del Ministerio de Salud (SIVIGILA). denominado entonces Sistema Alerta Acción, informó 334 casos de meningitis por H. influenzae. Se estimó la tasa de incidencia para ese año en 32,6 1100.000 niños menores de 5 años (49). De igual manera, en 1998 se informaron 306 casos, principalmente en las regiones de la Costa Atlántica (51 casos) y la región Centro Oriente (100 casos). Antioquia, Bogotá, Valle y Cesar fueron las regiones de mayor ### notificación con 72 123.5%).~. ,. 59 119.2%1.\. ,. 39 (21.7%) y 21 casos (6,8%), respectivamente (50). En 1999, el SIVIGILA informó 159 casos, provenientes de: Antioquia, 33 casos (20,7%); Santander, 30 casos (18,8%); Bogotá, 17 casos (10,6%) y Cartagena, 12 casos (7,5%) (51). Finalmente, en el 2000 se informaron 119 casos de meningitis por este agente; fueron Antioquia, Cundinamarca, Sucre y Bogotá las regiones de mayor notificación con 29 (24,3%), 18 (15,1%), 10 (8,4%) y 9 casos (7,5%), respectivamente (52). Hasta el 13 de enero de 2001 (segunda semana epidemiológica), únicamente Meta y Boyacá han informado dos casos de meningitis por H. influenzae (53). En el Primer Congreso Mundial de lnfectologia Pediátrica realizado en México en 1996, se H. _INFLUENZAEEN_ LAPOBLACION PEOIATRICA poblaciones negra e hispana, las cuales presentan tasas de ataque mayores que la población blanca (66). El papel de los factores de inmunidad local en las mucosas es poco comprendido. Se plantea, de manera especulativa, la posibilidad de anticuerpos secretores que podrían alterar la adhesión del microorganismo a las células. Por el contrario, la evidencia parece mostrar que los anticuerpos IgA pueden aumentar la susceptibilidad al bloquear la actividad de otros anticuerpos (67). Factores de riesgo El riesgo de desarrollar enfermedad por H. influehzae está determinado por factores tanto del microorganismo como del hospedero y del medio ambiente. Los factores del microorganismo son la infectividad. la capacidad de adhesión a las células del tracto respiratorio y la virulencia, como ya se mencionó. Entre los factores del hospedero, podemos encontrar que usualmente el riesgo es mayor en las edades de 6 a 12 meses. La enfermedad invasora es poco común en menores de 6 meses debido, presumiblemente, a la reducida exposición, a los factores protectores maternos transplacentarios o a la lactancia. Cada tipo de enfermedad invasora tiene patrones de edad determinada; la edad en la que más comúnmente se presenta la meningitis es entre los 6 y los 9 meses y declina marcadamente después de los dos años (68,69). Las celulitis son más comunes durante el primer año de vida, mientras que las epiglotitis lo son después del segundo año de vida (70). Aunque la mayoria de los estudios indica una similitud entre los diferentes sexos, algunos estudios indican una posible incidencia de 1.2 a 1, veces mayor en niños que en niiias (71). La población negra se ve afectada por enfermedad invasora y meningitis causada por H. influenzae tipo b entre 2 y 4 veces más que la blanca (72,73). Estas diferencias se plantean en torno a factores genéticos, como se mencionaba anteriormente. Los niños con enfermedades subyacentes como anemia de célulasfalciformes, inmunodeficiencias primarias o adquiridas del complemento, neoplasias o esplenectomia, tienen mayor riesgo de presentar enfermedad invasora (74-76). Aún está en duda, aunque existe alguna evidencia experimental, que las infecciones previas o concomitantes con agentes virales puedan aumentar la susceptibilidad a la infección por H. influenzae, debido a las alteraciones que ocasionan en el epitelio respiratorio, las cuales pueden favorecer los mecanismos de adhesión y penetración de la bacteria (62). Se ha planteado como factor protector la lactancia materna e n niños menores d e 6 meses. presumiblemente por el paso de factores nutricionales maternos; en las madres lactantes se han identificado anticuerpos contra la cápsula polisacaridica de H. influenzae tipo b, que persisten entre uno y seis meses después del inicio de la lactancia. Inclusive e n madres inmunizadas durante el embarazo, se encuentran títulos de anticuerpos hasta 20 veces mayores contra la cápsula del microorganismo (77,78). Con respecto al medio ambiente, se consideran factores de riesgo el hecho de asistir a guarderías y factores sociodemográficos como el bajo estrato socioeconómico, el bajo nivel de educación de los padres, la sobrepoblación en la vivienda, los fumadores en la familia y el tener hermanos mayores en centros educativos (79-81). Diagnóstico A l igual que l a mayoría d e las entidades patógenas, la historia clínica y el examen físico son pilares de un diagnóstico adecuado. El criterio primario, sin embargo, es el aislamiento y la confirmación microbiológica del microorganismo. Los hemocultivos, los cultivos de LCR y de otros fluidos normalmenteestériles(sinovia, líquido pleural, pericárdico) son mandatorios en circunstancias adecuadas, incluso a pesar de haberse iniciado el manejo antimicrobiano. La tinción de Gram es una coloración rápida y económica y puede ser útil en algunos especimenes, especialmente de líquido cefalorraquideo, según un estudio realizado por Estrada et al. (82), el cual arrojó una sensibilidad del 100% y una especificidad del 96,4%. Está descrito que la coloración de Gram detecta alrededor del 85% de H. influenzae en LCR y la sensibilidad depende especificamente de la centrifugación previa y del número de micro- organismos existentes, esto es, si se realiza en laboratorios de referencia especializados y por personal altamente capacitado y con experiencia. Por ello, no debe considerarse tan sensible ni tan específica, en general. La tinción fluorescente con naranja de acridina y la inmunofluorescencia, aunque sean utilizadas de manera poco frecuente, son de utilidad en algunos casos, especialmente con muestras escasas y con míniha concen- tración bacteriana (83). La reacción de Quellung es otro método utilizado para su identificación; consiste en la demostración mediante microscopia de la cápsula, secundaria a la interacción con anticuerpos específicos contra antigenos capsulares. Como se mencionó anteriormente, los requerimientos para el cultivo de H. influenzae son exigentes y las muestras deben ser procesadas inmediatamente en los medios suplementados con los factores V y X. Otras técnicas disponibles y de gran utilidad incluyen la detección de antigenos capsulares por técnicas de aglutinación de látex, coaglutinación e inmunoelectroforesis de contracorriente (CIE), en ese orden de sensibilidad. E n diversos estudios, la aglutinación de látex ha demostrado sensibilidades muy elevadas (casi del 100%). independientemente del fluido corporal estudiado, mientras que la coaglutinación presenta una sensibilidad de 86% en muestras de LCR, pero disminuye hasta 27% en otras como orina y suero. De la misma manera, la CIE presenta una sensibilidad de 91% en LCR, pero disminuye a 40% en orina y suero (84-86). Sin embargo, se pueden presentar falsos positivos en casos de reacciones cruzadas con otros organismos, especialmente Streptococcus pneumoniae, con el factor reumatoideo o en sujetos inmunizados recientemente con vacunas conjugadas contra H. influenzae tipo b. También se presentan falsos negativos por exceso de antigenos de PRP (efecto prozona) y deficiencias e n e l proceso d e centrifugación de las muestras (87). Enfermedades específicas En datos obtenidos por Peltola (88), de 3. pacientes incluidos en 21 estudios desarrollados en diferentes regiones del mundo entre las décadas de 1970 y 1990, se encontró que más del 90% de las enfermedades invasoras por H. influenzae tipo b se manifestaban como seis entidades clásicas: meningitis _(52%),_ neumonia (12%), epiglotitis (10%). septicemia (e%),celulitis (5%) y enfermedades osteoarticulares (4%), siendo la artritis séptica mas común que la osteomielitis. Otras manifestaciones clínicas comprendían el 3% del número total y las ## enfermedades multifocales. el~ ~ ~. ~ 6%~. - restante- - ~ -~- Meningitis: es la complicación más severa de la infección invasora por H. influenzae, siendo el serotipo b invariablemente el responsable. Usualmentehay un cuadro prodrómicode infección de vías respiratorias superiores que dura unos pocos días e, incluso, es común encontrar casos de otitis media, seguido por un período de franco deterioro. En algunos casos, la evolución de la enfermedad es fulminante y ocasiona la muerte en pocas horas, usualmente en menores de un año. Al igual que la mavoria de las meninaitis. los síntomas neurológicos y la fiebre son las principales manifestaciones clínicas, aunque los pacientes menores suelen presentar menos sintomas especificos y usualmente la rigidez nucal está ausente. Otras manifestaciones más severas como las convulsiones o el coma se presentan con la evolución de la enfermedad. Por lo general, la sintomatología es indistinguible de otras meningitis de etiología bacteriana. La infección en neonatos es rara, pero puede ser similar a la ocasionada por Streptococcus del grupo B. La complicación más común es la efusión subdural. debido a la poca edad de los pacientes (menores de 5 años, usualmente). En niños menores, la falta de respuesta al tratamiento antimicrobiano, signos de hipertensión endo- craneana (fontanela abombada, papiledema), los signos neurológicos focales (indicativos del compromiso de pares craneanos) y los cambios en el estado mental deben aumentar la sospecha clinica. A pesar del diagnóstico y tratamiento adecuados, alrededor del 5% de los pacientes fallece (36). Las secuelas neurológicas se presentan hasta en un 30% de los sobrevivientes e incluyen retardo mental, pérdida de la audición (bilateral hasta un l a % ) , alteraciones del crecimiento y aprendizaje, trastornos motores y síndromes convulsivos (89-91). su uso debe ir acompañado de otro agente cuando se utiliza como terapia empírica contra la enfermedad invasora hasta comprobar la producción o no de p-iactamasa. La duración del tratamiento depende del sitio de la infección y de la respuesta clínica al mismo, pero usualmente no es menor de 10 días. El cloranfenicol tuvo excelentes resultados en las infecciones severas y fue tradicionalmente la droga de elección junto a la ampicilina; su dosificación es de 75 a 100 mglkgldia IV cada 6 horas y continúa siendo un antimicrobiano de segunda elección. Su resistencia se ha presentado en regiones aisladas del globo y ha llegado en algunos casos hasta 50% (58). No hay que olvidar los efectos secundarios sobre la médula ósea, especialmente en neonatos o pacientes con alteraciones hepáticas, los cuales son reversibles y dependen de la dosis. En Colombia. según un estudio con datos desde 1994 en el que se analizaron 88 aislamientos de H. influenzae causante de meningitis aguda, se encontró que 9,1% era resistente a trimetroprim- sulfametoxasol, 3,4% a cloranfenicol y 2,3% eran betalactamasa positivos (99). En otro estudio realizado por el Grupo de Microbiología del Instituto Nacional de Salud, se evaluaron 264 aislamientos de LCR y hemocultivos, recibidos entre 1994 y 1997. Se estableció que 10% de los aislamientos de LCR y 28% de los de hemocultivo presentaban sensibilidad disminuida a la ampicilina, con resistencia franca en 6 y 18%, respectivamente. Se determinó que el 6,5% de los aislamientos de LCR y el 22% de los de hemocultivos eran productores de p-lactamasa. Con respecto al cloranfenicol, 5,8% de aislamientos en LCR y 15% de hemocultivos presentaban sensibilidad disminuida, mientras que 5,3 y 15,1%, respectiva- mente, presentaronfranca resistencia. En relación con el TMP-SMX, 12% de los aislamientos de LCR y 87% de los hemocultivospresentaron sensibilidad disminuida. Solo 1% de los aislamientos presentó sensibilidad intermedia a la cefuroxima y todos fueron sensibles a la ceftriaxona. En términos generales, los aislamientos de neumonia presentaron mayor resistencia que los de meningitis (100). inicial en el manejo de la enfermedad invasora, especialmente meningitis, hasta que la susceptibilidad del microorganismo se determine. Se utilizan cefalosporinas que penetren adecuadamente en el LCR, como cefotaxima 200 mglkgldia cada 6 horas o ceítriaxona 75-100 mglkg una o dosveces al dia (101). Sin embargo, aunque in vitro sean más efectivas, in vivo tardan más en esterilizar el LCR y no mejoran las tasas de fatalidad (102,103). La cefuroxima no se utiliza en el tratamiento de meningitis por H. influenzae tipo b, ya que tarda hasta el doble de tiempo que los otros agentes en esterilizar el LCR (104). Independientemente del manejo, el tratamiento debe prolongarse hasta que el paciente esté afebril y sin signos clinicos o de laboratorio durante 3 a 5 dias. La duración usual de la terapia es de 7 a 10 días. Los pacientes con endoftalmitis, endocarditis, pericarditis u osteomielitis requieren hasta de 3 a 6 semanas de manejo antimicrobiano (58). Varios estudios han mostrado que, en algunas meningitis, especialmente aquellas causadas por organismos encapsulados, el uso adjunto de dexametasona a dosis de 0,6 mglkg cada 6 horas durante 4 dias, desde antes de la primera dosis de antimicrobiano, modera la cascada de la inflamación y disminuye el riesgo de la pérdida de la audición (105). El manejo antimicrobiano es sólo uno de los pilares del tratamiento y deben establecerse medidas adecuadas de soporte tanto hidro- electrolítico como ventilatorio y nutricional para estos pacientes, incluidas las precauciones de aislamiento respiratorio, incluso 24 horas después de haber iniciado el maneio antimicrobiano. El uso de rifampicina a 20 mglkgldía durante 4 dias (dosis máxima, 600 mg) en niños y contactos, se utiliza como profilaxis ya que erradica hasta en 95% H. influenzae tipo b en los portadores, el cual no logra ser erradicado por el tratamiento sistémico. Algunos datos parecen demostrar que esta profilaxis reduce la incidencia de la enfermedad invasora secundaria. El CDC de Atlanta para todos los contactos intradomiciliarios recomienda la profilaxis, excepto las mujeres embarazadas, sin imoortar la edad. si han estado en contacto con~~~~~ ~~ Actualmente, la recomendación es el uso de (^) un niño menor de 4 anos que no esté inmunizado cefalosporinas de tercera generación como terapia (^) o que se encuentre parcialmente inmunizado, as¡ como para todos los miembros domiciliarios de un niño menor de 12 meses, incluso si las primeras dosis de la vacuna se han aplicado, y para todos los miembros domiciliarios de un niño inmunocomprometido sin importar su estado vacunal contra H. influenzae. Los niños de guarderia o preescolar, sin importar la edad, si se han presentado dos o más casos de enfermedad invasora en los 60 días anteriores también deben recibir profilaxis. El caso indice también debe recibir quimioprofilaxis si fue tratado con antimicrobianos diferentes a ceftriaxona o cefotaxime, la cual usualmente se administra antes de su salida del hospital (106) (cuadro 2). Vacunas contra Haemophilus lnfluenzae tipo b Las primeras vacunas disponibles para la prevención de H. influenzae tipo b fueron desarrolladas a partir de la purificación d.e polisacáridos PRP y autorizadas en Estados ### Unidos en abril de 1985 (b-CAPSAO , Hib-VAXO, Hib-IMUNEO); éstas ya no se encuentran en el mercado (107). La respuesta inmunogénica ante estas vacunas era directamente proporcional a la edad, siendo los nitios menores seroconvertidores erráticos y, frecuentemente, con bajos niveles séricos (108). No se establecieron efectos secundarios mayores con este tipo de vacunas, excepto algunos informes aislados de casos de enfermedad por H. influenzae tipo b una semana después de la vacunación (109) Posteriormente, se han desarrollado múltiples vacunas basadas en conjugados proteicos de PRP, los cuales utilizan los principios de presentación antigénica mediada por haptenos definida por Ladsteiner en 1924 (IIO), es decir. una proteína inmunogénica transportadora que es reconocida por células T y macrófagos, la cual estimula la inmunidad dependiente de estas células. La proteína es covalentemente conjugada a los polisacáridos de PRP, que, d e por sí, confieren respuesta inmunológica (111). Las diferentes marcas comerciales emplean el mismo hapteno (PRP), pero difieren en el tamaño de los polisacáridos, el transportador proteico y el tipo de conjugación, así como en su respuesta inmunogénica (112). En 1987, se lanzó al mercado una nueva vacuna, esta vez conjugada con toxoide diftérico (vacuna PRP-D, ProHIBiTO) (113). Posteriormente, se desarrollaron vacunas conjugadas de oligosacáridos de H. influenzae tipo b (HbOC), en diciembre de 1988 y 1989 (HibTITERO). constituidas por pequeños segmentos de oligosacáridos unidos a Cuadro 2. Indicaciones para la profilaxis con rifampicina a los contactos y casos indices de enfermedad por Haemophilus iniiuenzae t i ~ ob * Quimiaprofilaxis n o recomendada Ocupantes domiciliarios sin niños menores de 4 años, diferentes al caso indice Ocupantes domiciliarios cuando todos los contados menores de 4-8 meses de edad han completado su esquema de vacunación contra H. influenzae. Niños en guarderiac y preescolar contactos de un caso indice, especialmente aquellos mayores de 2 años de edad. Mujeres en estado de embarazo Quirnioprofilavis recomendada Todos los contactos intradomiciiiarioc, excepto mujeres embarazadas, sin importa? la edad. si han estado en contacto. can, por la menos. un niño menor de 4 **años** que no esté inmunizado o que **se** encuentre parcialmente inmunizado. Todos los miembros domiciliarios con un niño menor de 12 meses, incluso si las primeras dosis de la vacuna **_se_** han aplicado Todos los miembros domiciliarios de un niño inmunocomprometido sin importar su estado vacunal contra H influenrae. Niños de guarderia a preeccoiar, sin importar la edad. si se han presentado 2 o más cacos de enfermedad invasora en **los** 60 dias anteriores. El casa indice también debe recibir quimioprofilaxis si fue tratado con antimicrobianos diferentes a ceftriaxona o cefotaxime, usualmente administrada antes de su salida del hospital. * Modificado de: Haemophilus influenrae hfections. En: Commitee of infectious Diseases, American Academy of Pediat- rics Red Book 2000 25th edition. Chicaga. I L American Academy of Pediatrics; 2000.
