¡Descarga Tinciones microbiología y más Apuntes en PDF de Microbiología solo en Docsity!
Tema 2. Tinciones y Microscopía.
Microscopio:
El instrumento de estudio en microbiología es el microscopio y este puede ser:
- Óptico: presente en todos los laboratorios.
- Microscopio laser confocal.
- Electrónico: estudio detallado (SEM y TEM)
Nos dan distintas informaciones: morfología (M. óptico y TEM), estructura (M. óptico y TEM) y composición (adición al SEM o TEM de espectroscopía de rayos X).
La obtención de una buena imagen depende de 3 factores:
- Aumentos: es la característica más importante. La parte del microscopio que nos produce el aumento son los objetivos. En los objetivos encontramos lentes convexas que desvían los rayos de luz por refracción encontrándose en un solo punto denominado punto focal. Refracción: son cambios de dirección debidos a un cambio de medio. Distancia focal: es la distancia entre el centro de la lente y el punto focal. A menor distancia focal, más conseguiremos aumentar el tamaño del objeto. El aire tiene un índice de refracción menor que el del vidrio, cuando la luz pasa del aire al vidrio su velocidad disminuye y el haz se desvía hacia la normal (línea perpendicular a la superficie de la lente), al volver al aire aumenta otra vez la velocidad y se vuelve a desviar alejándose de la segunda normal. El índice de refracción (n) de un medio es el cociente de la velocidad (c) de la luz en un medio de referencia (el vacío) entre la velocidad de fase (vp) en dicho medio: n vacío=1; n aire=1; n vidrio=1.5. Los microscopios ópticos que encontramos en el laboratorio son de 10x, 40x y 100x, y los oculares de estos microscopios son de 10x y algunos de 15x. Siendo 1500x los máximos aumentos con los que podemos ver una muestra.
- Contraste: son las diferencias en la intensidad de la luz lo que nos permite apreciar que una zona de la imagen es diferente de otra zona próxima del fondo del campo.
La mayoría de los microorganismos carecen de color, son transparentes y para poder verlos se han desarrollado dos técnicas:
- Aumentar el contraste de forma artificial con colorante. El problema de teñirlos es que matamos los microorganismos y si lo que queremos es observar el movimiento hay que utilizar otra técnica.
- Modificaciones al microscopio. Hay microscopios que están modificados permitiéndonos apreciar los microorganismos sin necesidad de teñirlos ( campo oscuro y contraste de fase ).
- Resolución: se llama poder de resolución de un microscopio a la menor distancia entre dos puntos adyacentes que pueden ser percibidos por separado uno de otro. Es una característica de las lentes y depende de 3 factores:
- Tamaño de la lente del objetivo.
- Longitud de onda de la luz empleada en la iluminación del espécimen (se utiliza luz blanca y para mejorarlo se pueden usar electrones).
- (^) Índice de refracción del material que se encuentra entre la lente objetivo y el espécimen.
Apertura numérica (AN) : indica el poder de resolución de una lente y se define como:
“n·senӨ”
n =índice de refracción del medio
senӨ = mitad del ángulo del cono de luz que entra en el objetivo.
Límite de resolución:
Reparaciones y tinciones de las muestras:
Todos los colorantes son compuestos químicos que poseen grupos cromóforos (con dobles enlaces conjugados), que son los que van a unirse a diferentes estructuras celulares mediante enlaces iónicos, covalentes o hidrófobos.
- Colorantes básicos : tienen grupos cargados positivamente, se unen a moléculas con cargas negativas (ácidos nucleicos, proteínas, superficies de procariotas). Azul de metileno, safranina, verde malaquita... En microbiología se usan más habitualmente este tipo de colorantes.
- Colorantes ácidos : eosina, rosa de bengala y fucsina ácida. Poseen grupos cargados negativamente ( -COOH ; -OH ) y, por tanto, se unen a moléculas cargadas positivamente.
Tipos de tinciones:
▲ (^) Tinciones simples: La muestra se trata con un único colorante:
- Extensión sobre un portaobjetos.
- Fijación de la muestra (se fijan las estructuras celulares y la muestra al portaobjetos). Esto se puede hacer de diferentes maneras: secar al aire, hacer un frotis (proceso realizado mediante calor) o fijación química.
- Añadir colorante.
- Lavar el exceso de colorante con agua.
- Poner un cubreobjetos, aceite y observar.
▲ Tinciones diferenciales: permiten clasificar a las bacterias en grupos diferentes según sus propiedades en la tinción. Primero se realiza una tinción primaria (método igual al de las tinciones simples) y, posteriormente, se hace una tinción de contraste (se utiliza otro colorante que tiñe las células no teñidas por el primer colorante). Ejemplo: tinción de Gram y tinción ácido alcohol resistentes.
7 minutos, 4. Después de calentar limpiamos la muestra y si miramos por el microscopio solo vemos esporas verdes, 5. Se vuelve a teñir la mezcla con safranina durante un minuto.
Tinción negativa: se usa para determinar si un microorganismo tiene o no cápsulas (no tiñe células). Entonces: 1. Cogemos la mezcla de bacterias, 2. Se le añade tinta chica, 3. Se extiende sobre un portaobjetos, 4. Se deja secar al aire.
Microscopía óptica:
Para poder observar los microorganismos sin teñirlos y así poder observar su movimiento, se modifican los microscopios.
Campo oscuro: el microscopio de campo oscuro permite a un observador visualizar células y organismos vivos, no teñidos, simplemente cambiando el modo en el que se ilumina el objeto de análisis. Para poder modificar un microscopio óptico normal de laboratorio a microscopía de campo oscuro se incluye en el condensador un disco opaco que no obstruye la luz completamente, deja que pase por el contorno en forma de cono prismático, el campo que rodea a la muestra permanece negro mientras que el objetivo queda iluminado intensamente. Se utiliza para estudiar flagelos y en microbiología clínica tiene un gran uso también.
Contraste de fase: un microscopio de contraste de fase convierte pequeñas diferencias del índice de refracción y de la densidad celular en variaciones en la intensidad de luz fácilmente detectables y es una excelente aproximación para observar células vivas. Se hacen dos tipos de modificaciones al microscopio: una al condensador incluyendo un disco similar al de campo oscuro, un disco opaco que solo permite el paso de la luz por una rendija, a este disco opaco se le denomina diafragma anular y, también, se hace otra modificación sobre el objetivo, llamado objetivo de contraste de fase, que consiste en añadirle un anillo especial con una serie de cortes que permiten el paso de la luz, es llamado anillo de fase. El contraste de fase se basa en los índices de refracción de los diferentes medios, debido a que el medio de los microorganismos tiene diferente índice de refracción que los propios microorganismos. El diafragma anular produce un cono de luz hueco. A medida que la luz atraviesa las células algunos rayos de luz se desvían como consecuencia de las variaciones en la densidad y en el índice de refracción y se retrasan aproximadamente de longitud de onda. Los rayos de luz no desviados inciden sobre el anillo de fase, mientras que los desviados no son retenidos por el anillo y atraviesan la placa desviándose otro de onda de manera que entre los rayos desviados y los no desviados hay un desfase de de longitud de onda y se anularan entre sí cuando se junten, formando la imagen. Se ven los microorganismos oscuros y el campo claro. Este tipo de microscopía permite ver el movimiento.
Microscopía de Nomarski: Parecido al contraste de fase solo que se usa un prisma y da sensación de 3D.
Microscopía electrónica:
Los microscopios electrónicos utilizan un haz de electrones para iluminar y crear imágenes aumentadas de las muestras. Los electrones sustituyen a la luz como iluminador, pero su longitud de onda es aproximadamente 0.0005 nm , es decir, unas 100.000 veces menor que la de la luz visible. Por lo tanto, los microscopios electrónicos tienen una resolución práctica unas 1000 veces superior que la de los microscopios ópticos. El poder de resolución es menos de 0,05 nm y el aumento útil está por encima de 100.000x.
MET: microscopio electrónico de transmisión (MET) : posee un alto poder de resolución, se emplea para ver estructuras internas de las células, como son los cromosomas del microorganismo... Se requiere una preparación específica y luego cortar los microorganismos para ver su interior.
Microscopio óptico Microscopio electrónico Longitud de onda Luz visible e- Resolución 200nm 1nm-200nm Aumentos 100x-1500x 200.000x
El microscopio electrónico de transmisión tiene un haz de electrones producido por un filamento de tungsteno , que es conducido por unas lentes electromagnéticas que son huecas en el centro, por donde pasan los electrones, y, posteriormente, vendrán una serie de lentes que llevan los electrones a una pantalla fluorescente, donde observaremos la imagen de esa muestra. Las regiones más densas de la muestra se verán más oscuras pues los electrones se dispersan más, mientras que en las zonas en las que inciden más los electrones se verán más claras. Hay que poner la muestra sobre metales pesados de manera que cuanto más denso sea menos electrones permite rebotar en el metal.
MEB: únicamente permite ver la superficie de las células. El microscopio electrónico de barrido tiene un haz de electrones primarios que incide sobre la superficie y, cuando llegan a esta, rebotan, siendo ahora electrones secundarios y formando la imagen tridimensional de estos microorganismos. También hay que recubrir la muestra, anteriormente liofilizada (deshidratada, como método de conservación), con metales pesados para que reboten (oro, platino).
