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TEMA 5. EXPRESIÓN DE LA INFORMACIÓN.
La información genética reside en el DNA. Consideramos que un gen es una secuencia que da lugar a un producto, puede ser RNA o una proteína. Sea cual sea el producto hay que pasar por la síntesis de RNA, que es la TRANSCRIPCIÓN. También se dan casos de que ciertas regiones del DNA no generan ningún producto, pero aún así son muy importantes.
• FLUJO DE INFORMACIÓN
La herencia es cuando un ácido nucleico da lugar a un ácido nucleico idéntico que se reparte en las células hijas, pero ahora vamos a hablar de EXPRESIÓN: un gen va a codificar un producto. Los genes van a sintetizar RNA (este puede codificar o no una proteína) ¡¡Los genes NO son secuencias que van a sintetizar proteínas. Un gen codifica un producto que puede ser funcional por sí solo o un RNA que va a codificar una proteína (no funcional por sí solo)!!!!
• ESTRUCTURA GENERAL DE UN GEN
Todos los genes tienen una estructura similar. Están formados por una secuencia de DNA de doble cadena con una región promotora que tiene que ser reconocida por la maquinaria. Después del promotor está la secuencia que se transcribe (secuencia codificante). Al final está el terminador que permite que la secuencia termine. El gen contiene dos cadenas y solo una sirve de molde para transcribir el RNA (que solo tiene una cadena), este se sintetiza en una reacción muy parecida a la de síntesis de DNA. El transcrito es igual en secuencia y polaridad a la cadena complementaria, solo que cambia T por U. Se requiere: fosfato, NTP, RNA polimerasas Mg2+ y la cadena de DNA molde. La síntesis se hace en sentido 5-3’ El inicio del gen decimos que está dónde se inicia la transcripción. Todo lo que está antes decimos que esta ‘’aguas arriba’’ y lo que está después esta ‘’aguas abajo’’. Cuando decimos que algo está aguas arriba nos referimos que algo está por delante del punto de que hablamos y cuando decimos que está aguas abajo nos referimos a que esta por detrás.
• DOGMA DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR
Trata de buscar una explicación al porque el genotipo determina el fenotipo, de manera que la información contenida en el DNA (genotipo) se transfiere al RNA y luego a las proteínas (fenotipo) Crick se dio cuenta que el DNA estaba escrito en un idioma diferente al de las proteínas (nucleótidos VS aminoácidos). Además, sabía que el DNA se encontraba en el núcleo y las proteínas hacían sus funciones en el citoplasma.
• TRANSCRIPCIÓN
-Para este proceso es imprescindible la RNA polimerasa. Es una proteína muy eficaz que depende de la hebra molde de DNA, pero a diferencia de la DNA polimerasa no necesita cebador y es capaz de abrir por sí sola la burbuja y va sintetizando RNA. -El DNA se abre formando una burbuja y solo la hebra molde del DNA accede al centro activo de la enzima. Aquí se van añadiendo nucleótidos de RNA elongando por el extremo 3’. El RNA no queda unido al molde, va saliendo por un poro de la enzima poco a poco. El producto de RNA no permanece apareado a la cadena de DNA molde, si no que la enzima desplaza la cadena en crecimiento solo unos pocos nucleótidos por detrás de donde se añade cada ribonucleótido. Este desplazamiento es fundamental para que el RNA cumpla sus funciones (por ejemplo, para que se traduzca para generar su producto proteico). Además, dado que esta separación sigue tan cerca de el sitio de polimerización muchas moléculas de RNA polimerasa pueden transcribir el mismo gen a la vez, una muy cerca detrás de la otra. Así una célula puede genera una gran cantidad transcritos en un solo gen en poco tiempo. Conforme el producto de RNA se disocia del DNA molde justo detrás de cada RNA polimerasa en proceso de avance, las dos cadenas de DNA vuelven a aparearse. -La trascripción es más lenta y menos precisa que la replicación. No pasa nada porque sea menos precisa ya que habría muchas copias del mismo gen en la misma célula y ese producto se degrada y no se trasmite a nadie. -No todo el DNA se transcribe, solo regiones concretas de cada tejido. -A veces (especialmente en procariotas) se trascriben varios genes a la vez, porque están organizados en operones que se regulan a la vez. -La transcripción es asimétrica: solo una hebra funciona como molde, la otra no interviene en el proceso. -Para cada gen, la hebra que es molde es molde siempre. Pero en un genoma para un gen puede ser una hebra la molde y para otro gen otra. LA CADENA MOLDE Y LA CADENA COMPLEMENTARIA LAS DEFINIMOS PARA UN GEN CONCRETO.
• TIPOS Y FUNCIONES DE LOS RNA.
Hay algunos que fabrican proteínas y otros que no. Proceden de la transcripción del DNA.
• ARNm: es intermediario en la expresión de los genes que codifican proteínas, es el único que se traduce. De lo que se
transcribe solo se traduce la región intermedia que es lo que se llama ORF (los extremos son regiones no traducibles) Las zonas que no se traducen son necesarias para ayudar a la traducción. Además, interacciona con el ribosoma y con los tRNA. El primero y el último codón del ORF se conocen como codón de inicio y codón de terminación respectivamente.
• RNAt: su función principal es el transporte de moléculas, fundamentalmente de aminoácidos al ribosoma. Destaca por la
abundancia de bases modificadas. ESTRUCTURA: Contiene un extremo 3’ que lleva unido un aminoácido covalentemente. Este brazo contiene una secuencia CCA y la A se une al aminoácido. Otro brazo contiene un bucle DHU, en el cual se hayan dihidrouracilos. Otro brazo tiene un bucle en el anticodón que contiene 3 nucleótidos por donde interacciona con el RNA m. Por último, tiene otra brazo T pseudo C, dónde siempre hay Timina, citosina y citouracilo. Además, también tiene un brazo variable.
• RNAr: constituyente de los ribosomas. Este tipo de RNA es muy abundante en la célula ya que sirve de soporte a los
ribosomas. El ribosoma es la maquinaria macromolecular que sirve para la síntesis de proteínas. El ribosoma está compuesto por dos subagregaciones de RNA y proteínas, llamadas subunidades, una mayor que otra. La subunidad pequeña contiene el centro decodificador en el que los tRNA cargados ‘’decodifican’’ las unidades codónicas del mRNA. Las subunidades mayor y menor se llaman así de acuerdo con la velocidad de su sedimentación cuando se someten a una fuerza centrífuga. La unidad que se utiliza para medir la velocidad de sedimentación es Svedberg (cuando mayor es el valor de S más rápida es la velocidad de sedimentación y mayor el tamaño de la molécula). -En bacterias: 70 S -Subunidad mayor: 50 S= 5S y 23S -Subunidad pequeña:30 S= 16S
-En eucariotas: 80 S -Subunidad mayor: 60 S= 5,8S, 28S y 5S. -Subunidad menor: 40 S= 18S
• RNAnc (no codificante)
Son RNAs que no tienen función en la síntesis de proteínas, de ahí que no sean codificantes. Los hay micro RNA de 20 nucleótidos, los ha pequeños (de decenas hasta centenas de nucleótidos) y los hay largos constituidos por kilobases. Normalmente son pequeños pero se encuentran en grandes cantidades. Clasificarlos es difícil, suelen tener funciones variadas. Los micro tienen funciones de represión génica, los pequeños también función de represión sobre todo y los largos (muy diversos) pueden ser represores, activadores o estructurales. Los RNAnc pueden salir fuera de la célula y regulan la expresión génica en órganos más o menos lejanos.
• scRNA: Capacidad catalítica. Una de las funciones mejor conocidas es reconocer el péptido señal y pegarlos en el
retículo endoplasmático. También tienen función reguladora, de activación o inhibición de la traducción de mensajeros del citoplasma.
• RNA POLIMERASAS
Sintetizan el RNA, normalmente buscan una secuencia correcta (la primasa no era especifica de secuencias, pero es una excepción).Son específicas de secuencia porque tienen que leer un promotor concreto. La transcripción en procariotas la lleva a cabo una sola RNA polimerasa, en casi todos los casos tienen varias subunidades. Las subunidades que los constituyen en los diferentes organismos suelen ser similares. En eucariotas hay 3 RNA polimerasas, cada una se especializa en un grupo de RNA concreto. En eucariotas el proceso ocurre en el núcleo, sin embargo, en procariotas el proceso tiene lugar en el citoplasma y además se va traduciendo mRNA (no hay separación entre los dos procesos) La transcripción por la RNA polimerasa progresa en una serie de pasos:
a. INICIACIÓN: La RNA polimerasa (en muchos casos junto con factores de iniciación) al principio se une a una secuencia de
DNA que se llama promotor. Una vez formado el complejo promotor-polimerasa sufre los cambios estructurales necesarios para que prosiga la iniciación. Al igual que en la iniciación de la duplicación, el DNA de alrededor del punto donde comienza la transcripción se desenrolla y los pares de bases se separan, lo que produce una burbuja de DNA monocatenario
b. ALARGAMIENTO: Una vez que la RNA polimerasa a sintetizado un segmento corto de RNA (10 nucleótidos) se entra en la
fase de alargamiento. La RNA polimerasa en esta fase además de sintetizar RNA desenrolla el DNA por delante y lo renaturaliza por detrás.
c. TERMINACIÓN: Después de que la polimerasa transcribió el gen o los genes en toda su longitud tiene que detenerse y
liberar el producto de RNA.
• TRANSCRIPCIÓN EN PROCARIOTAS
La RNA polimerasa de procariotas tiene forma de pinza de cangrejo y requiere cofactor magnesio. Tiene 5 subunidades y otra a mayores para el promotor Ϭ (factor Ϭ: controla la unión de la RNA polimerasa al promotor). Es autosuficiente, es capaz de llegar al promotor, abrir la burbuja y comenzar la síntesis por sí sola. En el centro activo esta el molde y el transcrito, este ultimo sale por un poro y la hebra que no es molde es cortada por otro canal independiente. Al salir la hebra se va enrollando esos superenrollamientos son manejados por las topoisomerasas. Tiene varios canales: por donde entra la cadena, por donde se desnaturaliza, por donde entran los nucleótidos para unirse y por donde sale el mRNA. Los nucleosomas y fibras han de ser liberados mediante complejos liberadores de cromatina.
• FASES:
1. INICIACIÓN: requiere el reconocimiento del promotor (las señales del inicio) y la RNA polimerasa se pega al inicio. Ocurre
antes de la síntesis:
• Reconocimiento del promotor
• Formación de la burbuja de transcripción
• Creación de los primeros enlaces entre rNTP.
■ TFIIB
■ BRE (centro de reconocimiento del factor TFIIB
■ Caja TATA
■ Iniciador (Inr)
■ Elementos promotores corriente abajo (DPE).
Mas allá del promotor central aguas arriba están las secuencias reguladoras:
• Secuencias potenciadoras (enhancers de la expresión génica): se asocian a proteínas activadoras de las transcripción
• Secuencias silenciadoras: se asocian a proteínas represoras que inhiben la acción de la RNA pol.
• Secuencias aisladoras: se unen a proteínas aisladoras (estorbos que impiden la acción de activadores y represores)
■ RECONOCIMIENTO DEL PROMOTOR CENTRAL: Como se ha dicho muchos promotores de la RNA pol
II contienen la caja TATA (a unos 30 pb corriente arriba del sitio de iniciación de la transcripción). El factor de transcripción general (TFIID) reconoce el elemento TATA. TFIID es un complejo de varias subunidades el componente de TFIID que se une a TATA se llama TBP. Las demás subunidades reciben el nombre de TAF, algunos TAF reconocen otros elementos del promotor central, aunque la unión más firme es la producida entre TBP y TATA. Por lo tanto, TFIID es un factor decisivo para el reconocimiento del promotor y el establecimiento del complejo de preiniciación. Cuando se une al DNA, TBP distorsiona la secuencia TATA. El complejo TBP-DNA sirve para reclutar otros factores de transcripción generales y la polimerasa hacia el promotor. In vitro, estas proteínas se congregan a la altura del promotor en el orden siguiente : TFIIA, TFIIA, TFIIF junto con la polimerasa y luego TFIIE y TFIIH. Después de esto se produce la desnaturalización del promotor que necesita ATP y esta mediada por TFIIH.
■ Como ya hemos dicho la iniciación de la transcripción también requiere de unas proteínas
adicionales, el complejo mediador y proteínas modificadoras de los nucleosomas. Esta condición complica la unión de la polimerasa al promotor. Las proteínas reguladoras de la transcripción llamadas activadores contribuyen a reclutar la polimerasa hacia el promotor y estabilizan su unión en ese sitio. Las interacciones entre los activadores unidos al DNA, los factores modificadores y remodeladores de la cromatina y partes de la maquinaria de la transcripción median este reclutamiento. Una de estas interacciones es con el complejo mediador.
• DNA POL I Y DNA POL III: Indican las transcripción desde promotores distintos y trascriben genes diferentes.
Esos genes codifican RNA especializados en lugar de proteínas. Cada una de esta proteínas funciona con su conjunto exclusivo de factores de transcripción generales Sin embargo también necesitan la TBP. En UCE es donde se fijarán los factores de transcripción específicos: UBF y SL1.
• ELONGACIÓN
• TERMINACIÓN
• RNA pol I: Una endonucleasa corta el percusor reconociendo una secuencia de 18 nucleótidos. El factor de
terminación se une a la secuencia de DNA y se encuentra aguas abajo del sitio de terminación.
• RNA pol III: finaliza la transcripción transcribir una secuencia terminadora. Secuencia especial seguida de
U.
• RNA pol II: Se lleva a cabo produciéndose un corte (escisión) y en ese corte se añaden colas de adeninas
(poliadenilación). Este proceso lo lleva a cabo la poli-A polimerasa, que añade unos 200 nucleótidos de adenina.Tras añadir las colas la RNA pol abandona el molde. Un mRNA que no está bien transcrito no puede abandonar el núcleo, ya que no ha madurado, de manera que no se transcribe.
• PROCARIOTAS CONTRA EUCARIOTAS
Hay una diferencia muy importante debido a que en procariotas no hay membrana nuclear. Por lo tanto, en procariotas la transcripción y la traducción serán simultáneas. Sin embargo en eucariotas, el RNA m madura en el núcleo y hasta que no ha madurado no sale al citoplasma, que es donde se produce la traducción.
• PROCESAMIENTO DE RNAs
En eucariotas se procesa el RNAm. Este procesamiento empieza en la fase de transcripción. El primer paso es añadir la caperuza que es guanosina trifosfato al extremo 5’ del RNAm. Tras añadir esto se pasa a la eliminación de los intrones. Los limites entre los intrones y loes exones están marcados por secuencias específicas.
• ERRORES DE LA TRANSCRIPCIÓN
Son menos problemáticos que los errores en la replicación (debido que los de la replicación son heredables). Un gen es transcrito muchas veces por lo que si la replicación tiene algún fallo se obtendrán siempre RNAs siempre erróneos y por ello proteínas mal formadas.
• HIBRIDACIÓN DNA-DNAc
El DNAc es una cadena de DNA sintetizada artificialmente cuya secuencia es complementaria a una de RNAm. Esta hebra de DNAc se usa para conocer la localización del gen con el que ha sido generado ese RNA. Por lo tanto, en la hibridación obtendremos un dúplex, con un DNA o con otro DNAc. El DNA será más largo debido a que posee intrones, la cadena de DNAc no los tiene ya que proviene de un RNA donde antes fueron eliminados. La cadena de DNA tendrá dirección 5’-3’ y la de DNAc 3’-5’ ya que es antiparalela al RNA. Por ello el DNA y el DNA c estarán en su mayoría complementados menos: en los intrones que el DNAc no posee y en las colas de poli-A presentes en el DNAc
• PROCESAMIENTO ALTERNATIVO
Toda la información genética de un individuo está contenida en todas sus células (salvo los gametos), pero se expresan de diferente manera. Esto se debe a que el mismo RNA no sufre las mismas eliminaciones de intrones en todas las células. El procesamiento del RNA varía en los diferentes tejidos ya que se necesitan diferentes productos proteicos según la necesidad del tejido. La mayoría de los genes eucariotas sufren procesamiento alternativo, con el cual a partir del mismo gen el individuo puede obtener productos diferentes. Lo que en unos tejidos se comporta como intrón, en otros se comporta como exón. El pre-RNAm tiene varias zonas con intrones y exones y la cola de poli-A. El concepto de intrón y exón no es absoluto para todo el organismo. Puede que se produzca un exón extendido ( de un intrón se coge algo menos) que nos saltemos un exón, que se retenga un intrón o que salga normal.
• EDICIÓN DE RNAs.
La edición del RNA puede cambiar la secuencia de este después de que se transcriba. Hay dos mecanismos:
1. Sustitución: Desaminación enzimática llevada a cabo por la enzima ADAR (adenosina desaminasa) que actúa sobre el
RNA y cambia una adenosina por una inosina. Muy frecuente en RNA t. Le da un juego especial durante el reconocimiento en la traducción.
2. Inserción o eliminación de U: una forma muy diferente de editar RNA se produce en los transcritos de RNA que codifican
proteínas en las mitocondrias de tripanosomas. Aquí un número de uracilos se insertan en regiones específicas de mRNA tras la transcripción e incluso pueden eliminarse los uracilos. Estos se insertan en el RNAm gracias a las RNA guía (RNAg). El RNAg y el RNAm forman un dúplex con regiones monocatenarias que sobresalen. Entonces una endonucleasa lo reconoce y corta el RNAm. En el extremo 3’ se añaden uracilos y después una ligasa los une al resto de la cadena. Para esto proceso es necesaria la fosforilación de ATP, al igual que en la eliminación.
• OTROS PROCESAMIENTOS EN EUCARIOTAS
Además del RNAm se procesan los RNAr y los RNAt. La modificación de bases y el corte es un proceso ordenado. Tras esto dan lugar al empalme de los fragmentos. En el RNAt hay que eliminar los intrones que no son parte de la molécula funcional.
• RNA INTERFERENTE
Parte de lo que se transcribe no posee una función en sí, es decir, no pasara a ser RNAm, RNAt y RNAr. Hace poco se creía que el proceso de transcripción daba lugar a mucho RNA inútil pero se han descubierto RNAs con nuevas funciones. (RNA antisentido) Estos RNAs poseen una secuencia complementaria parcial o total de un RNA funcional. Debido a esta complementariedad, las dos cadenas se hibridan y ello hace que el RNA funcional quede bloqueado, no permitiendo la traducción. El RNA antisentido tiene sentido contrario al RNA funcional, por lo que se unen perfectamente. La represión del RNAm por el RNA antisentido puede manifestarse como una inhibición de la traducción, destrucción del RNAm o silenciamiento de la transcripción del promotor. La unión de ambas cadenas de RNA da lugar al dsRNA. A partir de este se generan RNA interferentes cortos (siRNAs) o micro RNAs (miRNAs), gracias a la enzima Dicer. Esta enzima dirige los dsRNA y da lugar a unos fragmentos de 23 (siRNAs) o 21- (microRNAs) nucleótidos. En realidad entre los micro y los pequeños no hay mucha diferencia, lo importante es cómo funcionan.
• miRNAs: primero se transcriben a partir de una secuencia con repeticiones invertidas de RNA. Tras la replicación esa
molécula de RNA se pliega para formar RNA de doble cadena. El RNA de doble cadena se escinde por acción de la enzima Dicer para producir mRNA. Este se combina con proteínas para formar un complejo, entonces se produce un apareamiento imperfecto con mRNA y se inhibe la traducción.
• siRNAs: se obtienen a partir de RNA de doble cadena. Este RNA se escinde por la enzima Dicer, el siRNA se combina con
proteínas formando un complejo que se aparea con mRNA y da lugar a la degradación del mRNA.
