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Chapitre 4 : La régulation du cycle cellulaire
Pourquoi on a toujours le même cycle cellulaire qui se produit?
I- Cycle cellulaire : quelques données spécifiques
Phase G1, S, G2, M.
La mitose dure 1h : temps de division physique de la cellule est très court.
L’interphase dure de 9 à 30h : détermine la durée du cycle. Certaines cellules hépatiques mettent plusieurs jours voire plusieurs mois à se diviser.
Phases :
- Phase G1 : la phase la plus longue : détermine la durée du cycle. Temps très long (hépatiques : plusieurs jours). On prépare toutes les protéines et molécules nécessaires à la réplication
- Phase S : 7h réplication de l’ADN
- G2 : 3h : synthèse des protéines et molécules nécessaires à la division de la cellule : ribosomes, mb, RE etc. elle est absente dans les cellules très embryonnaires. L’embryon est déjà très riche. Les cellules épithéliales ont la particularité d’avoir une phase G2 très longue
- M
Dans la phase G1, la cellule peut sortir du cycle : phase de quiescence G0 : pour entrer dans la voie de différenciation. Une cellule bien différenciée ne se multiplie plus. Entre les 2, il y a les cellules plus ou moins différenciées. Une cellule peut aussi entrer en division : cellule quiescente a besoin à un moment donné de se diviser. Cette entrée est contrôlée : notamment au niveau de la taille de la cellule, et il faut la présence de facteurs de croissance qui proviennent de l’extérieur de la cellule pour qu’elle puisse se diviser.
Tout le long du cycle, il y a des contrôles, toujours dans le mm sens. Les points de contrôle sont :
- Point de restriction R ou point START : permet l’entrée de la cellule en G1 et à partir de ce point, si elle passe ce point, la cellule termine le cycle. Elle ira jusqu’à la fin de la phase M. pour mette les cellules dans un contexte particulier, on met les cellules dans une boite de pétri, mais pas de sérum donc pas de facteurs de croissance, donc elle rentre en G0. Puis on lui met des facteurs, elle rentre en G1, passe le pt de contrôle R, et après mm si on retire les facteurs, elle continue dans le cycle
- Point de contrôle en fin de G1 : pour savoir si tout se passe bien, ADN intègre
- Point de contrôle en fin de G2 : pareil, est ce que l’ADN est tjrs intègre après la réplication
- Point de contrôle en métaphase : pdt migration sur le fuseau mitotique : est ce que les chromosomes sont bien positionnés.
La sortie de cycle c’est soit pour la différenciation, soit pour une attente, soit pour apoptose.
II- Mise en évidence de facteurs contrôlant les transitions de phase
On a pris 2 cellules distinctes qui n’étaient pas dans la même phase : on a pris une cellule en phase M et une autre cellule (en G1 par exemple). On fait une fusion : mb cytoplasmiques et mb nucléaires fusionnent. On s’aperçoit que l’ADN de la cellule en G1 qui était un ADN non condensé car en interphase, il voit son ADN se condenser. (ADN plus petit que l’ADN normalement condensé car pas eu de réplication). Donc l’ADN a reçu l’information comme quoi elle doit rentrer en phase M : c’est fait par un facteur de la cellule qui est en G1.
Et ça marche aussi quand on est en G2 : fusion cellulaire de M et G2. L’ADN ne doit pas encore être compacté, mais on voit une condensation des chromosomes donc il existe bien ce facteur qui induit la phase M.
C’est le facteur de passage en phase M = MPF (maturation promoting factor)
Et on a aussi disparition de l’enveloppe nucléaire.
Ça marche aussi sur des cellules en phase S. Même les cellules qui sont en cours de réplication s’arrêtent et rentrent en phase M sous l’influence du facteur.
Le MPF est présent dans la cellule, mais il faut qu’il soit présent qu’en fin de phase G2.
C’est un facteur diffusible, induit l’entrée en mitose de cellules quelle que soit l’étape.
Est-ce qu’il existe un SPF? Pour savoir, on refait la même manip : cellule phase S et cellule phase G1. On voit que le noyau de la cellule en G1 synthèse de son ADN. Donc ce facteur SPF existe bien. A la fin de phase G1, induit la synthèse de l’ADN.
Est-ce que ça se fait de la même manière avec des cellules qui sont en G2 ou M? Non si on prend une cellule en phase S avec des cellules soit en G2 ou M : il ne se passe rien : pas de réplication d’ADN. Donc il existe un mécanisme qui bloque une nouvelle réplication tant qu’on n’a pas passé la mitose.
Donc ce sont 2 mécanismes distincts.
III- Etude chez la levure
On a étudié chez la levure car plus simple que eucaryotes supérieurs.
On prend des mutants incapables de passer une phase : mutant cdc (cell division cycle) : cellules arrêtées à une étape précise. On va faire ça pour toutes les phases. Ces mutants sont dus à des mutations dans des gènes qui codent pour des protéines essentielles pour le passage de cycle.
Tous les mutants qu’on va utiliser sont des mutants thermosensibles : pour le sauvegarder, à 25°, ils ne sont pas mutants, et à 42° la protéine a une structure un peu différente, et n’est plus fonctionnelle donc mutant. On els cultive à 25° pour en avoir beaucoup, et dès qu’on veut étudier, on passe à 42°.
Ces mutants cdc, on appelle les gènes mutés cdc. Si on parle de gène cdc 25 : c’est le gène normal. Il code pour une protéine cdc 25 : cette protéine permet le passage G2 – M. on mute Cette protéine chez le mutant cdc 25, incapable de produire la protéine cdc 25.
Quand on a identifié tous ces mutants, on en a eu pleins. Certains n’étaient pas intéressants car ils codent pour la DNA poly par exemple (fonction triviales), on a donc éliminé ceux-là et on a gardé ceux qui étaient inconnus qui codaient surement pour des protéines de transition de phase : ils jouent dans la régulation du cycle cellulaire
IV- Les cyclines et les CDK
Quand on a mieux regardé ces MPF et SPF, on s’est rendu compte qu’ils étaient des complexes protéiques hétérodimères qui contiennent :
- Une sous unité régulatrice : cycline
- Une sous unité catalytique : Cdk (car elle a une activité enzymatique dépendante de la cycline. Toute seule, elle n’a pas d’activité
Ce sont bien des facteurs protéiques diffusibles.
Cycline a joué son rôle enzymatique et ensuite, la cdk ne doit plus fonctionner, donc on raccroche des peptides d’ubiquitine sur la cycline. Donc la cycline est repérée par le protéasome puis dégradée : la cdk se retrouve toute seule. Il existe 2 systèmes de dégradation : 2 complexes :
- SCF : présent tout le temps dans la cellule mais pas activé. Il est activé à la fin de la transition de phase : quand elle est entrée en phase S. Activité ubiquitine-ligase : dégradation de la cycline E spécifique de la phase G1. On sort donc de la phase G1 suite à cette dégradation.
- APC/ co facteur (complexe de promotion de l’anaphase) : le cofacteur peut être de 2 types o cdc 20 : on l’a identifié dans les mutants de transition de phase. Une fois que ce signal est donné, il faut l’arrêter. Ce système APC rajoute des ubiquitines sur la cycline de la phase G2-M o Cdh1 : autre protéine. Agit sur les cyclines A et B normalement impliquées dans la transition G1-S. ils sont très importants car il ne faut pas qu’on a accumulation de ces cyclines A et B
A un moment donné, il faut accumuler les cyclines de la transition G1-S car il faut arrêter le système de dégradation. Pendant la phase G1, une enzyme est stimulée : elle inhibe le système APC-cdh1. Il faut que le système marche et qu’il s’arrête de fonctionner.
2) Régulations de l’activité des Cdk
Il y a un 3ème^ partenaire, ce sont des toutes petites protéines qui jouent un rôle dans la structure du complexe et stabilité de l’hétérodimère. Ce sont : p9, p15.
Plus généralement, on ne peut pas expliquer l’activité à un moment précis. Donc il faut que ces cyclines et cdk soient modifiées par d’autres partenaires :
- phosphorylation correcte de la cdk pour qu’elle soit fonctionnelle
- présence d’inhibiteurs
- 3 ème^ partenaire
a. Niveau de phosphorylation des cdk
Les cdk ont 3 acides aminés constamment conservés (chez toutes les espèces) : la thréonine 160 ou 161, la tyrosine 15 et la thréonine 14. Ils sont phosphorylés.
La cdk est active que si :
- La tyrosine 15 et thréonine 14 : déphosphorylé
- La thréonine 161 : phosphorylé
Mais la plupart du temps, elles a 3 phosphorylée alors qu’il ne lui en faut qu’un : donc pas active.
(L’inactivation passe par l’inactivation de la cycline.)
Car on va avoir une structuration tridimensionnelle de la protéine particulière. Phosphorylation de la protéine cible : site de fixation de l’ATP et protéine cible. La protéine cible se fixe sur son site de fixation. Et la poche de l’ATP se trouve à proximité pour le transfert du phosphate. Si pas la bonne phosphorylation les 2 poches ne sont pas accessibles.
b. Petites protéines régulatrices
On n’en parle pas.
c. Inhibiteurs des Cdk
Ils interviennent dans le contrôle G1-S, et ils ont 2 mécanismes différents : donc on a 2 groupes : Les p21 et les p15.
- Les p15 : appartiennent à la famille INK4 : empêchent l’interaction cdk-cycline
- Les p21 : famille CIP/ ou KIP : empêchent la fixation de la protéine cible. pas de phosphorylation car pas de substrat
Dans les 2 cas, inhibition totale de l’activité des cdk.
V- Transition G2-M : MPF
Le MPF peut agir sur toutes les phases du cycle en induisant la mitose, donc la cellule se protège en mettant un mécanisme qui permet de laisser rentrer dans le noyau le MPF qu’au moment voulu, alors qu’il est exprimé au cours de la phase S.
Ce MPF est constitué de la cycline B et cdc2 ou cdk1 (chez les mammifères). Pour que la transition se fasse, il va falloir lever les activités inhibitrices d’expression de ce MPF.
Le MPF actif, comme tout hétéroduplex :
- Cdk1 : thréonine 161 phosphorylé et tyr15 et thréonine 14 déphosphorylés
- Cycline B phosphorylée
1 ère^ étape : pdt l’interphase on constitue un stock important de Cycline B/ cdk1 phosphorylés.
On a2 types de kinase qui phosphoryle :
- La wee 1 : peut être inhibée par phosphorylation, elle phosphoryle les 2 aa : thréonine 14 et tyrosine 15
- La CAK : c’est une cdk : cycline H associé à la cdk 7 associé à une petite protéine MAT2 : phosphorylation de la thréonine 161. Elle subit elle-même des régulations pour être active : phosphorylée sur la thréo 161 et déphosphorylée sur tyr 15 et thréo 14
Accumulation de ces complexes dans la cellule.
Ensuite la cycline B associée à la Cdk va être phosphorylée. Donc on transporte ce complexe du cytoplasme vers le noyau. Ensuite, dans le noyau, stock de complexes inactifs. Le complexe doit être déphosphorylé pour être fonctionnel. Il faut un complexe qui retire les 2 phosphates tyr 15 et thréo 14 : fait intervenir une cdc : c’est la cdc
- (il y a plusieurs cdc25) c’est une phosphatase, et non une kinase. Elle déphosphoryle la cdk1. Cette cdc 25 est régulée, elle doit être phosphorylée pour être active. Elle est phosphorylée par la polokinase, en fin de G2. Avant, en fin de phase S, la cdc 25 est dans le cytoplasme. Et à un moment donné, grâce à des partenaires, elle passe dans le noyau, ou elle sera phosphorylée par la polokinase.
Arriver en fin de phase G2 avec une forme active du complexe Cycline B-cdk
La cdc 25 enlève 2 phosphates sur cdk : interaction faible, un peu de signal. Elle est active faiblement et doit être active à un moment donné, donc c’est une polokinase (non cdc) qui l’active. Et avant, cdc25, en fin de phase S est toujours présente sous forme inactive dans le cytoplasme, et elle est activée en fin de G2.
Dans le noyau, une autre enzyme : la kinase Wee : capable de re-phosphoryler la cdk. Donc il faut inhiber cette wee kinase, en la phosphorylant par une kinase AKT, pour que la MPF soit active. On inhibe la wee, qui ne pourra donc plus inhiber le MPF.
Ensuite, on produit du MPF actif grâce à la cdc25 et la wee1 complètement inactivée. On a maintenant un rétrocontrôle positif. Il a pour but de produire très vite une grande quantité de MPF. Ce MPF qui est maintenant actif, a lui-même une activité de phosphorylation, et va donc rephosphoryler la cdc25, et là elle devient très active (quand elle était phosphorylé seulement par la polokinase, elle avait une faible acté). On augmente donc le pool de MPF actifs. Et de la même manière, le MPF va phosphoryler aussi wee (par sécurité), donc il n’y a plus de wee actives dans la cellule.
VI- Transition G1-S : SPF
Les mécanismes mis en place visent à limiter l’expression des cyclines D et E à la phase G1.
Différents couples :
- cycline D-cdc 4 : grâce à la cycline D on donne le signal pour rentrer
- cycline E – cdk 2 : permet de rentrer
- cycline – cdk : poursuit la phase S
Il faut un signal extérieur mitogène pour que la cellule se divise. Les signaux les plus importants sont les facteurs de croissance, il y a aussi différenciation, molécules d’adhésion. Via les intégrines et transduction de signaux, permettent la synthèse de novo de la cycline D (synthèse commence en G1 et se poursuit le long du cycle, se termine en phase M).
Cette stimulation d’expression concerne en premier lieu les cyclines D : plusieurs types D1, D2, D3 : se lient à 2 cdk possibles cdk 4 et cdk 6 qui jouent le même rôle.
On a des complexes cyclines d – cdk : but inactiver la protéine Rb pour permettre la libération du facteur de transcription E2F. Rb est une protéine qui se fixe sur le facteur de transcription E2F, permet transcription d’un certain nb de gènes. Donc pour que Rb se détache d’E2F, pour qu’E2F puisse se fixer sur le promoteur. Donc on inactive la protéine Rb pour libérer E2F.
Les cellules sont maintenues en G1 à cause de ce complexe avec E2F.
E2F peut être fixé sur des promoteurs mais inactif car pas dans la bonne conformation, il lui faut des modifications.
3 types de gènes sous contrôle d’E2F :
- gènes impliqués dans transition G1/S (cycline E, A et protéine Rb)
- gènes impliqués dans synthèse des nt et réplication ADN
- et gènes impliqués dans induction d’apoptose : si besoin
La protéine Rb empêche la protéine d’entrer en phase S. les facteurs de transcription induisent l’entrée en G1, et le TFG beta donne un signal pour entrer dans l’apoptose. Tous les facteurs de croissance induisent la prolifération, sauf le TGF beta qui induit l’apoptose.
E2F actif à la fin de la transition G1-S et Rb devient inactif à ce moment, donc il y a bien un lien.
Rb a une forte affinité pour E2F donc il se lie à E2F et le piège. Si le taux de phosphorylation de Rb est bas, le complexe persiste. Par contre si Rb est hyper phosphorylé, E2F est relargué car les interactions ne sont plus possibles. E2F libre peut activer les promoteurs de différents gènes impliqués dans la transition G1-S.
Le complexe effectif SPF est constitué d’E2F lié à une protéine appelée DP : ce complexe est capable d’induire la transcription de différents gènes. Quand Rb est fixé sur ce complexe, on a une non activation de la transcription. L’hyperphosphorylation de la protéine Rb nécessite le complexe : cycline E-cdk 2 lié à la protéine p15.
En fin de G1, la protéine Rb est phosphorylé par cdk4/cycline D. Ensuite cycline E/cdk2 phosphoryle encore. Ensuite encore phosphorylation par cdk2/cycline A.
Etapes :
- synthèse de cycline D grâce au facteur de croissance. La cycline D se lie avec la cdk4 et 6. Ce complexe se produit, et on a un niveau de phosphorylation adéquat. La cdc25 intervient pour contrôle.
phosphorylation de la protéine Rb. Avec ce niveau faible de phosphorylation, la protéine Rb piège toujours E2F.
- synthèse de cycline E qui se lie à cdk2. Pareil que pour l’étape 1 : puis libération de E2F : fin de phase G1. Forme active d’E2F. E2F se lie à DP cofacteur obligatoire. Transcription à différents gènes : gènes codant la cycline A et cycline E + enzyme de réparation, histones, polymérases (car l’ADN va se répliquer).
- Grace à E2F on a augmenté la quantité de cycline E et cycline A. donc ces partenaires vont pouvoir se lier à cdk2. Rétrocontrôle positif pour libérer E2F qui se lie à son partenaire DP. Puis on rephosphoryle Rb qui est déjà inactif, et d’autre part on phosphoryle le facteur de transcription E2F-DP : devient inactif.
- E2F inactif donc pas d’expression des gènes, donc sortie de S. La phosphatase PP1 nettoie Rb, et E2F est aussi déphosphorylé (mais pas par PP1).
On a des inhibiteurs de cette transition G1-S :
- Famille INK4 : p15 et p16 : TGFβ stimule spécifiquement la p15 et p16 : inhibiteurs du complexe cycline D/cdk
- Famille CIP/KIP : fixe le complexe cycline D/cdk6 : complexe trimérique avec p21 et p27 : la cdk ne peut plus être phosphorylée. empêche transition de phase.
La plupart de la régulation c’est toujours des équilibres. Donc plus on a d’inhibiteurs, plus on empêche. On a des stimulants de ces inhibiteurs en cas de problème.
Dans certains cancers on a des mutations fréquentes de ces inhibiteurs. Le contrôle du cycle passe aussi par l’activation d’inhibiteurs.
Quand on produit plein de MPF ou plein de protéines Rb : on aura transition de phase quand même car pas assez d’inhibiteur essentiel pour contrer les petites fuites.
On a 4 pts de contrôle de l’état de l’ADN
- Phase S : intégrité et réplication de l’ADN
- Contrôle la répartition des chromosomes
Protéines impliqués dans ces contrôles (transduction du signal)
- Kinases qui se lient à l’ADN : kinase ATM, kinase ATR. Elles phosphorylent d’autres protéines pour provoquer l’arrêt du cycle
- Protéines sérine-thréonine kinases Chk1 et Chk2 (check-point protéine kinase)
- Ubiquitine ligase Mdm2 : au pt de surveillance métaphase anaphase
Si l’ADN subit des erreurs, stimulation de l’ATR qui va stimuler la chk1 qui va phosphoryler des protéines qui interviennent dans la régulation de la transition de phase.
Si l’ADN subit des radiations ionisantes : ATM puis chk2 puis les protéines vont induire arrêts de cycle : réparation de l’ADN. La protéine Chk2 est capable de stimuler la p53 importante pour l’apoptose. Quand ça va mal, la p s’accumule, mais quand ça va bien, elle est toujours produite mais demi vie très courte donc vite dégradée.
Au niveau de l’ADN lésé, on a 2 systèmes de correction possibles :
- Transition G1-S : système ATM repère enzyme de réparations qui s’accumulent sur cet ADN et donne un signal chk2 – simulation de p53 (facteur de transcription) qui stimule l’expression de p21. P21 est un inhibiteur qui est là pour piéger quelques molécules pas adéquates. Mais là on l’accumule donc il inhibe la cycline E ou la cycline A – cdk2. Les kinases qui passent par la voie chk2 inhibent la cdc25, (c’est une phosphatase) qui est impliquée dans la régulation de cycline A – cdk2. Donc par la voie ATM on inhibe la
