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MICROSCOPIA ESAME
Le cellule si possono studiare anche dal punto di vista morfologico e biochimico e funzionale. L’analisi morfologica prende in esame l’organizzazione strutturale delle cellule, delle varie parti di esse e dei costituenti extracellulari. Ci si avvale dei microscopi, atti a ingrandire l’immagine delle strutture in esame. Importante e cruciale è l’integrità dell’oggetto da sottoporre all’osservazione. L’analisi biochimica e funzionale ha lo scopo di studiale la natura chimica e le modalità di funzionamento delle cellule, delle loro parti e delle loro interrelazioni in ambito tissutale. ANALISI MORFOLOGICA: (strumenti: microscopi ottici ed elettronici, citofluometri. Tecniche: allestimento preparati nel modo più conservativo possibile) (occhio umano: 1) cristallino: lente che proietta un’immagine ottica sulla retina 2) iride: diaframma che regola l’incidenza dei raggi luminosi 3) coni e bastoncelli: recettori fotosensibili inizio della via ottica che porta le informazioni al cervello dove viene elaborata l’immagine) Ottica geometrica: se un raggio luminoso si propaga in un mezzo non omogeneo può subire fenomeni di riflessione (colore), assorbimento, rifrazione. Se i raggi provenienti dallo stesso punto, dopo aver subito rifrazioni e/o riflessioni, convergono nuovamente in uno stesso punto, si dice che formano una immagine reale della sorgente. Lente: mezzo trasparente limitato da due superfici curve.
- Per conoscere l’organizzazione strutturale ci sono dei metodi di osservazione diretta, che richiedono diversi tipi di microscopi. La microscopia si divide in microscopia ottica e elettronica. l’occhio è utile in tutti i tipi di microscopia infatti a prescindere dallo strumento di osservazione, che può essere semplice con una sola lente, composto con due o più lenti (campo chiaro, campo scuro, contrasto di fas, fluorescenza), moderno o antico, l’occhio era, è e rimarrà sempre la parte più importante dell’osservazione di materiale. Ciò che contraddistingue la microscopia ottica da quella elettronica è la natura del mezzo con cui si analizza l’oggetto, in quello ottico si impiega la luce in quello elettronico si usano appunto gli elettroni.
Microscopio ottico: aberrazione: difetti nel creare l’immagine, possono essere cromatiche
e sferiche l’obiettivo è a corta distanza focale, e l’oggetto viene posto appena al di là del fuoco. di questo, nello spazio tra i due gruppi diotttrici, si forma un’immagine reale ingrandita e capovolta, detta immagine intermedia IR. Se l’oculare viene posto in modo che l’IR cada all’interno della sua distanza focale, si ottiene un’immagine secondaria, virtuale, ancora ingrandita e diritta, anche se capovolta rispetto all’oggetto. Il rapporto tra le dimensioni dell’immagine finale e quelle dell’oggetto esprime l’ingrandimento ottenuto. Ci sono due sistemi di lenti, l’oculare che è il gruppo di lenti più vicino all’occhio e l’obiettivo che è la lente più vicino all’oggetto.
Oltre un certo limite non si distinguono particolari ulteriori, cioè non cresce il potere di risoluzione, ovvero la capacità di distinguere come separati due punti molto vicino tra loro fino a 0.2 mm, il microscopio ottico fino a 0.2 μm, mentre il microscopio elettronico fino a 0.2 nm. R= λ/ 2n x senα Non si possono definire come separati due punti che distano tra loro meno di 0.2μm. si dice che l’ingrandimento utile per un microscopio ottico è di 1000 volte e il suo potere risolutivo è di circa 0, μm. questo è il limite massimo che si può ottenere da qualunque tipo di microscopio che sfrutta il potere della luce, ovvero per ogni microscopio ottico. Il limite di risoluzione è appunto fornito dalla formula di Abbe dove λ è la lunghezza d’onda della luce, n l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra oggetto e lente, solitamente aria, e α il semi-angolo di apertura della lente obiettivo. Il prodotto tra n e il seno dell’angolo viene definito apertura numerica. Dato che l’indice di rifrazione per l’aria è circa 1, e sen di alpha può essere considerato prossimo a 1, R risulta proporzionale a ½ λ, cioè alla metà della lunghezza d’onda della luce. Considerando la luce con la lunghezza d’onda di 400nm, il potere di risoluzione sarà quindi pari a 200nm (0,2 μn). per migliorare il limite di risoluzione una via possibile è quella di aumentare il valore dell’indice di rifrazione del mezzo interposto (n). si potrà interporre pertanto un mezzo con indice di rifrazione più alto, come per esempio una goccia di olio con indice di rifrazione all’incirca uguale a quello del vetro (pari a 1.5): in questo caso si parla di osservazione microscopica a immersione che permette di distinguere punti distanti poco più di 0.1 μm. Se no si può utilizzare luce di lunghezza d’onda minore, come per esempio la radiazione ultravioletta con la quale possiamo arrivare a un potere di risoluzione pari a 0.1 μm, che rappresenta il limite estremo della microscopia ottica. In questo caso, essendo la luce ultravioletta invisibile all’occhio umano, per il rilevamento delle immagini occorre fare ricorso a pellicole fotografiche sensibili all’ultravioletto. Struttura del microscopio ottico composto: il tubo portaottica sorregge una coppia di oculari dal lato dell’osservatore (in caso di microscopi più economici, non si hanno due oculari bensì uno (microscopi monooculari)) e gli obiettivi dal lato del tavolino su cui viene posto l’oggetto da osservare. Gli obiettivi sono su una torretta girevole denominata revolver che consente una rapida sostituzione dell’obiettivo. Il tubo e il tavolino sono montati su un braccio ricurvo e il tutto su un basamento. Braccio e basamento prendono il nome generico di stativo. Per la messa a fuoco vengono utilizzati dispositivi meccanici di spostamento, uno per grandi spostamenti (vite macrometrica) e uno per la messa a fuoco fine (vite micrometrica), i dispositivi di messa a fuoco agiscono in ceri microscopi spostando il tavolino, alzandolo e abbassandolo, mentre in altri microscopi agiscono sul tubo. Sotto il tavolino è posto il dispositivo di illuminazione costituito da una sorgente di illuminazione e dal condensatore di Abbe. La sorgente di illuminazione è oggi data da lampade a incandescenza o alogene mentre un tempo era costituito da un specchietto concavo che raccoglieva la luce diffusa e la mandava alle parti ottiche sovrastanti. Il condensatore di Abbe è una lente convergente che concentra la luce, emessa dalla sorgente, su una zona limitata del preparato, da cui fuoriesce un cono luminoso il cui diametro coincide con
Microscopio ottico in campo scuro : Il normale condensatore in campo chiaro è
sostituito con un condensatore (paraboloide) che deflette il fascio di luce in modo tale che attraversi l’oggetto con forte obliquità proseguendo in massima parte fuori dal sistema ottico MICROSCOPIO A CONTRATO DI FASE: (ottiene informazioni utili circa la composizione di cellule e tessuti analizzati) si basa sul fenomeno dell’interferenza luminosa. L’occhio apprezza le differenze di lunghezza d’onda (colore) e di intensità della luce (ampiezza); tuttavia non riesce a percepire le variazioni di fase. Per questo è stato trovato il sistema per sfruttare al massimo le piccole differenze nell’indice di rifrazione dei vari elementi cellulari, rendendole visibili e consentendo l’osservazione di cellule viventi non colorate con un microscopio detto a contrasto di fase. Questa tecnica di microscopia è molto utilizzata per andare ad osservare le cellule di colture in vitro; infatti si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali. Il preparato viene illuminato da un fascio luminoso in realtà suddiviso a livello del condensatore in due porzioni di fase differente e con diverso angolo di incidenza. Il cambiamento ulteriore di fase dovuto alla porzione di luce che attraversa il campione, andandosi a ricombinare con la luce non rifratta renderà visibili componenti trasparenti ma di indice di rifrazione differente da quello del mezzo. Dall’oggetto di fase, colpito dal cono cavo di luce, partono onde di luce diretta e onde difratte sfasate tra loro di ¼ λ. Le onde dirette verranno ulteriormente sfasate di ¼ λ dall’anello di fase dell’obiettivo mentre le onde diffratte passeranno inalterate Così si ha una differenza di fase di mezza lunghezza d’onda (1/4 +1/4) tra onde dirette e onde diffratte, che è la stessa di un oggetto di ampiezza. Contrasto di fase positivo (anticipo): L’anello di fase anticipa l’onda diretta di ¼ λ Contrasto di fase negativo (ritardo): L’anello di fase ritarda l’onda diretta di ¼ λ. 1 Caso (ANTICIPO): oggetti con indice di rifrazione più alto del mezzo che li circonda appariranno scuri su fondo più chiaro 2 Caso (RITARDO): oggetti con indice di rifrazione più basso del mezzo che li circonda appariranno chiari su fondo più scuro. L’ Anello di fase proietta sul preparato un cono di luce, cavo al centro. I raggi che colpiscono gli organelli citoplasmatici producono due raggi: uno diretto (che non subisce alterazioni); l’altro che risulterà deviato e sfasato di valore pari a una frazione di λ (x·λ). Quest’ultimo subisce un ulteriore ritardo di fase, pari a ¼ λ (ritardo finale= ¼ λ+x·λ) quando attraversa la parte più spessa dell’anello di fase (obiettivo). I raggi deviati interferiscono con quelli diretti dando origine a raggi finali che avranno una minore ampiezza (minore luminosità). Gli organelli, pertanto, risulteranno visibili, con diverse tonalità di grigio fino al nero. Tramite la microscopia a contrasto di fase si evita l'utilizzo di coloranti e fissativi che spesso comportano notevoli alterazioni strutturali ottenendo così dei dati molto più reali di quella che è l'organizzazione cellulare. Osservando una qualunque immagine in contrasto di fase, si sarà notato che gli orli dell’oggetto sono marcati da un doppio alone, di solito scuro all’interno e chiaro all’esterno. Se tale alone è utile per mettere in risalto i contorni dell’oggetto, per contro, nasconde i dettagli presenti in corrispondenza dell’alone stesso. lo sfasamento è dato dal rapporto fra cammino ottico e lunghezza d'onda Le condizioni di contrasto sono quindi variabili all’interno dello spettro ottico:si ottiene la sovrapposizione di infinite immagini leggermente diverse fra loro, corrispondenti a tutti i valori di λ presenti nella radiazione utilizzata. Ciò riduce il contrasto e compromette la definizione. È per questo motivo che molti costruttori forniscono nel corredo di fase un filtro verde: introducendolo nell’illuminatore, si fa lavorare il sistema per quella porzione dello spettro per cui l’occhio è più sensibile e per cui, quindi, il progettista ha calcolato il sistema
MICROSCOPIO A LUCE POLARIZZATA:
la comune luce consiste in un insieme di raggi che hanno in comune una direzione di propagazione, ma vibrano in differenti piani. La microscopia a luce polarizzata utilizza appunto la luce polarizzata, cioè LUCE CHE VIBRA IN UN SOLO PIANO. Un oggetto può risultare isotropo, se trasmette la luce con la stessa velocità in tutte le direzioni, se cioè presenta lo stesso indice di rifrazione in tutte le direzioni, oppure anisotropo o birifrangente, se non trasmette la luce con la stessa velocità in tutte le direzioni in quanto presenta indici di rifrazione diversi secondo il piano di vibrazione del raggio di luce rispetto all’orientamento delle molecole. Il microscopio in questione è in disuso ma in passato veniva utilizzato per identificare strutture birifrangenti e distinguerle da quelle monorifrangenti. MICROSCOPIO INTERFERENZIALE DI NOMARSKI: anche questo tipo di microscopio utilizza la luce polarizzata. Tramite un particolare prima di Wollaston, questa luce viene scissa in due raggi convergenti tra loro di una distanza piccola compresa tra 1 e 0,1 μm. così facendo il primo raggio colpisce un punto dell’oggetto e l’altro un punto immediatamente adiacente, sempre compreso però all’interno della risoluzione di quell’obiettivo. Tra i due raggi si viene a creare una sfasatura, dipendente dall’indice di rifrazione e dallo spessore dei mezzi attraversati. Tramite un secondo prisma, sempre di Wollaston, i due raggi vengono fatti interferire e l’immagine che si ottiene è simile a quella del contrasto di fase, con in più un evidente effetto tridimensionale. Permette lo studio di oggetti trasparenti non colorati in cui appunto appaiono gli aspetti tridimensionali dei preparati. Consente di osservare i vari piani di un oggetto relativamente spesso fornendo immagini con caratteristico rilievo. MICROSCOPIO A FLUORESCENZA vantaggi: sistema facile da usare, poco costoso e a buona sensibilità. Svantaggi: Il campione si illumina completamente, tutte le molecole fluorescenti presenti sono eccitate => photobleaching, Il campione se “vivo” è sottoposto a fenomeni di fotocitotossicità => danneggiamento campione, La luce osservata al detector non arriva esclusivamente dal piano di osservazione, ma può arrivare da sopra o da sotto => immagini poco nitide, In esperimenti di co- localizzazione di due molecole non si può essere certi che queste si trovino sullo stesso piano di osservazione. il preparato viene illuminato da luce ultravioletta a una determinata lunghezza d’onda e i suoi componenti vengono esaminati a seconda della fluorescenza che viene emessa. La sorgente luminosa è una lampada a vapori di mercurio che emette radiazioni ultraviolette (invisibili). LA FLUORESCENZA è il fenomeno per cui determinate sostanze, dette fluorescenti, colpite dalle radiazioni ultraviolette emettono luce di lunghezza d’onda maggiore (visibili). Essa dipende dal rilascio di energia da parte di elettroni di una molecola, che eccitati dalla luce ultravioletta, passano da un determinato orbitale a uno superiore. Gli elettroni eccitati sono però molto instabili, e tendono perciò a tornare al loro stato originale, rilasciando l’energia che hanno assorbito sotto forma di calore e di luce. Questa luce emessa viene chiamata fluorescenza. Poiché parte dell’energia
emessa da punti contigui a quello di focalizzazione torna anch’essa indietro; non è focalizzata nel secondo foro confocale, per cui viene fermata, non giunge al rivelatore e non crea disturbo. Facendo scorrere, il raggio laser nei piani di sezione ottica, il computer registra una serie di immagini puntiformi, perfettamente a fuoco, ricostruendo l’immagine. Questo microscopio permette di avere una buona visione di cellule e tessuti in vivo. I fluorocromi precedentemente usati in epi-fluorescenza erano citotossici e perciò dannosi per le cellule viventi. La scoperta e la produzione di fluorocromi vitali ha permesso di superare questo limite consentendo l’osservazione in vivo delle cellule o di strutture che, a causa del loro spessore, non darebbero immagini accettabili con altri microscopi. Questo microscopio consente di studiare le interazioni tra le molecole mediante le tecniche di FRAP (florescence recovery after photobleaching ovvero recupero della fluorescenza dopo il fotosbiancamento) e FRET (florescence resonance energy transfer ovvero trasferimento per risonanza durante la fluorescenza). FRAP: è una tecnica semplice, che è utilizzata per misurare la mobilità delle molecole, si avvale del fotosbiancamento. Il recupero della fluorescenza avviene poi nel tempo, quest’ultimo può essere misurato e può fornire il tasso di trasporto o le costanti di diffusione delle molecole. FRET: è una tecnica che studia l’interazione tra le molecole. Si avvale di quenching che consiste nel trasferimento di energia da una molecola fluorescente donatrice a un’altra molecola fluorescente accettore, che si trova fisicamente vicina al fluorocromo eccitato (donatore). Il fenomeno del trasferimento avviene se lo spettro di emissione del fluorocromo donatore si sovrappone a quello del fluorocromo accettore e se i due fluorocromi distano meno di 10nm. Laser: fascio di luce coerente e monocromatica concentrata in un raggio rettilineo estremamente coinciso. luminosità delle sorgenti laser elevatissima Il sistema dei “pinholes”: 1. elimina la luce emessa dalle regioni fuori del piano di fuoco dell'obiettivo (fa arrivare poca luce al campione) 2. raccoglie solo la luce proveniente dal piano a fuoco. COLOCALIZZAZIONE: presenza di due o più strutture nella stessa posizione. In microscopia a fluorescenza, la presenza di due o più fluorocromi sulla stessa struttura cellulare. Proteine marcate di colori differenti che co-localizzano danno come output un terzo colore, ad esempio rosso + verde = giallo. Affinchè la presenza di un colore “da fusione” rappresenti realmente la colocalizzazione spaziale di due molecole marcate da due diversi fluorocromi e non la semplice sovrapposizione di molecole dotate delle stesse coordinate X Y ma di diverse coordinate Z (sovrapposizione di più piani focali), è indispensabile che venga analizzato un singolo piano focale. ALLESTIMENTO DEI CAMPIONI: i due principali procedimenti sono l’osservazione diretta di cellule e di tessuti viventi oppure di cellule e di tessuti uccisi. Si potrebbe pensare che la prima delle due sia meglio per studiare un’immagine più vera e dinamica, ma non è così, infatti molti procedimenti limitano l’utilizzo di questo procedimento. Perciò il ricorso a preparati fissati e ridotti in sottili fettine trasparenti e colorate è quello che trova la più ampia applicazione in istologia.
METODI DI STUDIO DI CELLULE E TESSUTI VIVENTI:
Frammenti molto sottili di organi o di cellule isolate dall’organismo possono restare in vita per breve tempo ed essere osservate in sopravvivenza preferibilmente al microscopio a contrasto di fase. È anche possibile colorare cellule viventi. _determinati coloranti non tossici, detti coloranti vitali, hanno la proprietà di colorare elettivamente alcune cellule viventi per identificare o studiare funzioni particolari, per esempio per il fenomeno della fagocitosi si usa il blu trypan, la tionina, il litiocarminio, il pirrolo o l’inchiostro di china. se il colorante viene iniettato nell’animale intero, si parla di colorazione vitale o intra vitam. se no si può immergere un pezzo di organo appena prelevato da un animale nel liquido colorante e ottenere, dopo un breve lavaggio del pezzo, che alcune cellule restino dorate; si parla di colorazione sopravitale. METODI DI STUDIO DI CELLULE E TESSUTI UCCISI:
- FISSAZIONE: è la prima tappa. La fissazione si propone di preservare la struttura protoplasmatica dalle alterazioni conseguenti alla morte della cellula con il minimo cambiamento struttale. Tutto ciò avviene grazie a un trattamento chimico che uccide rapidamente la cellula, agendo sui componenti proteici cellulari in modo da impedire il fenomeno di autolisi. La precipitazione dei componenti cellulari porta ad artefatti da fissazione, cioè produce immagini che non esistevano prima. Perciò i migliori fissativi sono quelli che precipitano le proteine nella forma più fine, possibilmente in aggregati ultramicroscopici, cosi che la morfologia non sia modificata. Ci sono fissativi chimici e fissativi fisici, i più comuni fissativi chimici si possono dividere in due gruppi in base alla loro azione sulle proteine. Un gruppo comprende i fissativi che coagulano le proteine come l’alcol etilico, bicloruro di mercurio. Il secondo gruppo comprende fissativi non coagulanti le proteine come la formalina e l’acido osmico. Nel caso invece della fissazione fisica, si opera in genere per congelamento o per riscaldamento. Le cellule che si trovano disperse in un mezzo liquido, quali le cellule del sangue, quelle dei liquidi di cavità sierose e di qualunque secreto o essudato si esaminano agevolmente con la tecnica degli strisci. Gli strisci di cellule monostrato possono essere di solito osservati direttamente al microscopio dopo essiccamento o fissazione e colorazione. Si usa per l’esame morfologico del sangue e nella citologia esfoliativa allo scopo di evidenziare cellule neoplastiche o comunque alterate in qualche secreto o liquido fisiologico o di lavaggio di organi. FISSATIVI SEMPLICI • Etanolo: coagulante non addittivo • Formaldeide: addittivo non coagulante • Acidi organici e minerali picrico:coagulante; acetico:addittivo • Tetrossido di osmio: non coagulante • Sali di metalli pesanti
Mallory, Galgano, Azan, oltre al colorante nucleare usano poi miscele che contengono diversi coloranti, come arancio G. Coloranti con affinità per componenti cellulari cariche negativamente: basici, sostanze basofile Coloranti con affinità per componenti cellulari cariche positivamente: acidi, sostanze acidolfili Protocollo colorazione cresyl-violetto: Sparaffinare e portare all’acqua: a) 2 passaggi di 2 minuti in Histolemmon b) 2 passaggi di 2 minuti ciascuno in alcool assoluto c) 1 passaggio di 2 minuti in ciascuno dei seguenti alcoli : 95° 70° 50° d) 1 passaggio in acqua di 2 minuti Colorare: Trattare per 3-5 minuti cresyl violetto allo 0,5% Sciacquare per pochi secondi in due bagni di acqua distillata Differenziare in acqua acidulata Disidratatare: a) 2 passaggi di 1 minuto ciascuno in alcol 95° e assoluto b) 2 passaggio di 1 minuto in Histolemmon Montare in resina le aree "bianche"? • I fluidi presenti nei tessuti o negli spazi interstiziali non si colorano con E&E • Sangue, linfa etc. • Si riconoscono come ampi spazi bianchi • Anche i lipidi ed il grasso non si colorano. IMMUNOFLUORESCENZA: Colorazione con anticorpi coniugati con fluorocromi per evidenziare in situ costituenti tissutali che sono specifici antigeni. IMMUNOFLUORESCENZA PER ANTIGENI DI SUPERFICIE si può effettuare anche su cellule vive IMMUNOFLUORESCENZA PER ANTIGENI INTRACELLULARI - è necessario fissare e permeabilizzare le cellule La GFP (Green Fluorescent Protein) è una proteina di 238 aa (27 KDa) isolata dalla medusa Aequorea victoria. Inducendo mutazioni nel gene della GFP sono state prodotte varianti di questa proteina con caratteristici spettri di assorbimento ed emissione: BFP - Blue Fluorescent Protein, CFP - Cyan Fluorescent Protein, YFP - Yellow Fluorescent Protein, RFP - Red Fluorescent Protein (G)FP: proteine intrinsecamente fluorescenti - Possono essere fuse geneticamente alla proteina da marcare - Sono assolutamente biocompatibili e il legame al target è forte - La fisiologia della cellula o dell’organismo non viene significativamente alterata, quindi sono sonde ideali per l’osservazione "in vivo" – è possibile creare linee cellulari o organismi transgenici che esprimono direttamente la proteina marcata anziché quella normale.
- MONTAGGIO:
Microscopia elettronica: gran parte delle strutture subcellulari sfugge all’analisi
microscopica classica, in quanto la capacità risolutiva del microscopio ottico è intimamente legata alla lunghezza d’onda della luce, nel campo del visibile. Utilizzando un fascio di elettroni, ovvero una radiazione elettromagnetica di lunghezza d’onda molto ridotta, si è potuto oltrepassare quel limite di 0,2μm otticamente invalicabile. Ma vi erano numerosi problemi da risolvere, tra cui l’impossibilità di una visione diretta del preparato (la retina non è sensibile agli elettroni) e la costruzione di strumenti che, al pari delle lenti convergenti nei confronti dei raggi luminosi, fossero in grado di modificare il cammino del fascio di elettroni.
MICROSCOPIO OTTICO A TRASMISSIONE TEM : visto che il limite risolutivo del microscopio ottico, espresso nella formula di Abbe è uguale a ½ λ, i limiti imposti dalla lunghezza d’onda della luce possono essere superati soltanto utilizzando radiazioni a lunghezza d’onda minore. È noto da tempo che un fascio di elettroni attraversando un campo magnetico viene focalizzato secondo le stesse leggi dell’ottica convenzionale. Se un fascio di elettroni viene accelerato a forte velocità, alle particelle cariche negativamente in movimento è associata una radiazione la cui lunghezza d’onda è calcolabile in base alla formula di Abbe. Con tensioni di accelerazione dell’ordine di 50000 V, la lunghezza d’onda risulterà perciò pari a 0,05 nm. RUSKA costruì il primo microscopio elettronico dove la sorgente luminosa era sostituita da una fonte di elettroni e le cui lenti erano date da elettromagneti; con questi apparecchi si poteva raggiungere, in teoria, un limite di risoluzione inferiore a 0,1 nm. Il potere di risoluzione in microscopia elettronica, non è di quest’ordine di grandezza, in quanto le lenti magnetiche sono caratterizzate da un angolo di apertura abbastanza piccolo. I più moderni strumenti possono, raggiungere un potere di risoluzione di circa 0,2 nm, con la conseguente possibilità di utilizzare ingrandimenti molto elevati. Costituto da: 1. Colonna elettronottica 2. Sistema di comando e controllo dei circuiti elettrici ed elettronici 3. Sistema di produzione e controllo del vuoto. Gli elettroni sono sottoposti, appena lasciato un filamento metallico portato all’incandescenza, a una forte differenza di potenziale e accelerati lungo la colonna elettronica (Sorgente elettronica, Condensatori, Sistema ingrandimento immagine, Sistema registrazione e visualizzazione immagine): Sorgente elettronica: 1) filamento di tugsteno che portato all’incandescenza emette elettroni + cilindro metallico (Wehenhelt) = CATODO 2) dischetto metallico sotto il catodo con foro centrale caricato positivamente= ANODO; Condensatori: lenti elettromagnetiche che fanno convergere il fascio sul preparato; Sistema ingrandimento immagine Obiettivo: ingrandisce circa 100X= prima immagine dell’oggetto Lenti intermedie Lenti proiettive; Sistema registrazione e visualizzazione immagine: schermo a fluorite+ sistema di ripresa fotografica. Per percorrere la distanza fra sorgente, lenti e infine lo schermo, gli elettroni non debbono incontrare intralci materiali, per cui l’ambiente interno deve essere evacuato dall’aria fino a valori di vuoto. Gli elettroni vengono assorbiti, deviati e in parte trasmessi continuando il loro percorso. Questi ultimi contribuiscono a formare un’immagine su uno schermo fluorescente oppure possono essere osservati su un monitor televisivo o impressionano una lastra fotografica. Da qualche tempo l’immagine viene inviata tramite telecamera ad appositi elaboratori elettronici, trasformata in digitale e conservata su rapporti informatici. Le lenti possono modificare il percorso del fascio elettronico con le medesime modalità previste dall’ottica classica per le lenti in vetro, sono di tipo elettromagnetico, cioè costituite da un solenoide che crea un campo le cui linee di forza fanno convergere gli elettroni in un punto, detto fuoco. COME SI FORMA L’IMMAGINE: •Gli elettroni del fascio entrano in collisione con gli atomi del preparato e vengono deflessi •La deflessione crea una variazione di intensità •Questa variazione di intensità viene raccolta dallo schermo o dalla pellicola e forma l’immagine del campione (in bianco e nero) ALLESTIMENTO DEI CAMPIONI: è necessario che il materiale da esaminare sia fissato, disidratato e ridotto in fettine estremamente sottili, cioè dell’ordine di 50/80 nm di spessore.
trasformati in corrente elettrica e opportunamente amplificati •Sistema di produzione e registrazione delle immagini:( CRT) sorgente che genera il fascio responsabile dell’immagine, anodo che li accellera, schermo fluorescente •Sistema del vuoto è un tipo di microscopio elettronico usato per lo studio topografico della superficie delle strutture biologiche. Nel microscopio elettronico a trasmissione La sezione di tessuto viene attraversata da un fascio di elettroni; Nel microscopio elettronico a scansione, invece, la superficie del campione, In precedenza fissato in glutaraldeide o tetrossido di osmio, è precedentemente rivestita con appositi apparecchi da un sottile strato di metalli pesanti per consentirne l’osservazione. Il campione, Inserito In Un’apposita camera Del microscopio, Viene esplorato da un fascio molto sottile di Elettroni, Detti primari, Che deflessi da un particolare dispositivo, formano una sorta di pennello che esplora per punti successivi la superficie dell’oggetto. Gli elettroni primari vanno a eccitare la superficie del campione che mette raggi X ed elettroni secondari. Gli elettroni secondari vengono raccolti da un rilevatore posto vicino al campione. La componente essenziale del rilevatore è uno scintillatore, che emette fotoni, i quali, in sincronismo con il fascio di elettroni primario, operano la scansione sullo schermo del monitor. Il sincronismo tra la scansione effettuata sul campione e quella del monitor è operato dal sistema di scansione. L’immagine che si forma sullo schermo riproduce con effetto tridimensionale la superficie analizzata, rivelandone tutti i particolari con una risoluzione solitamente di 20nm. Tuttavia, con sorgenti elettroniche speciali si possono raggiungere risoluzioni più elevate. Il microscopio elettronico a scansione consente anche la microanalisi dei metalli contenuti nel campione: siccome con l’eccitazione del campione, da parte degli elettroni primari, si ha anche emissione di raggi x, una specifica microsonda raccoglie i raggi x emessi e ne analizza lo spettro che essendo caratteristico di ogni elemento, ne consente l’identificazione.
- Elettroni secondari: elettroni a bassa energia (perché persa in seguito ad urti anelastici) provenienti dalla superficie del campione= morfologia della superficie 2. Elettroni backscattered: elettroni che emergono dal campione senza perdita di energia ma con cambiamento di direzione= informazioni sulla composizione 3. Catodoluminescenza 4. Raggi X. Fissazione Disidratazione: serie crescente degli alcooli Disidratazione al punto critico (CPD): serve per passare dalla fase liquida a quella gassosa senza danni: CO Montaggio su supporto Metallizzazione per sputtering: migliora l’interazione fra fascio e campione: ricopertura con metalli La Metallizzazione è la deposizione di un sottile film di alluminio in condizione di vuoto che consente di rivestire diverse tipologie di prodotti. Lo Sputtering permette di depositare un film sottile di metallo conferendo a un prodotto prestazioni estetiche e meccaniche.
ANALISI BIOCHIMICA E FUNZIONALE: (strumenti: cromatografi, elettroforesi,
spettrometri. Tecniche: frazionamento) le caratteristiche molecolari e funzionali di un campione biologico possono essere valutate con l’uso di particolari tecniche istologiche e tramite specifici metodi di analisi. CITOCHIMICA E ISTOCHIMICA: la citochimica utilizza tecniche atte a localizzare, al microscopio ottico e al microscopio elettronico, la presenza di determinate sostanze nell’interno della cellula e di risalire indirettamente alla loro composizione chimica. Questo tipo di analisi viene nominata anche istochimica, se si prefigge di localizzare sostanze chimiche non solo nelle cellule, ma anche nei componenti extracellulari dei tessuti. Sono metodi di analisi in situ. L’istochimica si differenzia nettamente quindi dalla biochimica, che opera su prodotti estratti dalle cellule e dai tessuti o su frazioni cellulari, sia dalla comune indagine istologica, dove la colorazione del preparato ha il semplice significato di mettere in evidenza la morfologia del tessuto. METODI DI COLORAZIONE: in istochimica, i metodi di colorazione sfruttano la proprietà di determinati reagenti di formare prodotti di reazione colorati, visibili al microscopio ottico. Alcune tecniche trovano anche applicazione in microscopia elettronica; in questi casi interessa che il prodotto di reazione risulti opaco agli elettroni e quindi evidenziabile al microscopio elettronico. I metodi istochimici si basano su due presupposti: che la reazione sia specifica per la sostanza chimica che si vuole identificare; che la sostanza chimica che si ricerca e il prodotto di reazione tra essa e il reagente impiegato non venga allontanato dalla sua posizione originaria nella cellula o nel tessuto da tutti i trattamenti necessari. In istochimica si ricorre spesso al metodo del freeze-drying o al criostato, che immobilizzano le sostanze chimiche nella loro sede originaria. LIPIDI: l’identificazione dei lipidi viene effettuata per mezzo di alcuni coloranti (solfato di blu Nilo) liposolubili. Poiché i lipidi si sciolgono totalmente nei solventi, dopo fissazione il pezzo viene tagliato direttamente al criostato e le sezioni sono trattate con uno de coloranti. Il montaggio del coprigetto viene effettuato con sciroppi o con gelatine idrosolubili e non in balsamo, perché lo xilolo scioglierebbe i grassi anche dopo la colorazione. Le gocciole di grasso possono essere anche messe in evidenza con la tradizionale tecnica delle fette, ma previa fissazione in acido osmico che, reagendo prevalentemente con gli acidi grassi insaturi, da luogo a composti insolubili nello xilolo, evidenza polisaccaridi neutri, il glicogeno, l’amido, la cellulosa. Si usa in questa reazione il reattivo di Schiff, dato da fucsina basica (rossa) ridotta e decolorata con acido solforoso. Tramite una preventiva ossidazione con acido periodico, i gruppi glicolici, ove presenti, vengono trasformati in gruppi aldeidici che interagiscono con la fucsina ridotta (incolore), riossidandola e riportando l’intensa colorazione rossa. Per aumentarne la specificità si può ricorrere all’impiego di test di controllo con enzimi quali l’amilasi, per eliminare il glicogeno, e verificare se si attua la scomparsa della colorazione. I glicosaminoglicani (GAG) si colorano elettivamente con il colorante Alcian blu o anche con fucsina-paraldeide; per l’elevato contenuto di gruppi acidi, sono intensamente basofili e metacromatici. Alcuni coloranti basici del gruppo della tiazina colorano certi componenti tissutali con una tinta diversa dalla propria. Questa proprietà è detta metacromasia e si verifica con sostanze di alto peso molecolare contenenti molti gruppi anionici liberi, come i mucopolisaccaridi acidi della sostanza fondamentale della cartilagine e quelli dei granuli dei leucociti basofili e dei mastociti. In presenza di questi gruppi acidi, il blu di toluidina vira dal blu al rosso-viola.
possono tenere i relativi anticorpi (proteine del siero prodotte in seguito all’esposizione ad un antigene che formano con essi un complesso immune). Gli anticorpi specifici, ottenuti immunizzando un animale contro un antigene di cui si vuole studiare la localizzazione, Vengono coniugati con una sostanza fluorescente o con una molecola opaca agli elettroni, Quale la proteina ferritina, Oppure marcati con particelle di oro colloidale. Le sezioni di tessuto sono poi esposte all’anticorpo, in modo che questo si leghi solo nei siti del tessuto in cui è presente l'antigene. Se l’anticorpo viene marcato con fluoresceina o rodamina, si formerà un complesso antigene- Anticorpo Visibile al microscopio a fluorescenza; se viene Marcato Con ferritina o con oro colloidale, sarà visibile al microscopio elettronico. Quando si fa legare direttamente l’anticorpo marcato all’antigene si parla di metodo diretto Che però è poco sensibile. Nel cosiddetto metodo indiretto, usato più comunemente, l’antigene viene fatto prima agire con un anticorpo non marcato (anticorpo primario); successivamente, una volta che si è formato il complesso antigene-anticorpo, si fa reagire con un altro anticorpo, Questa volta marcato, contro l’anticorpo primario (anticorpo secondario). Più copie di anticorpo secondario si possono legare all’anticorpo primario con il risultato di dare un segnale più evidente; Inoltre un altro vantaggio del metodo indiretto è che si esclude che la specificità Dell’anticorpo primario venga modificata dai procedimenti chimici impiegati per la marcatura. L’identificazione dell’anticorpo secondario, Oltre che per fluorescenza, Può essere effettuata con metodi colorimetrici. L’immunoistochimica ha infatti compiuto un notevole progresso con l’impiego dell’enzima perossidasi. Questo enzima può essere coniugato con l’anticorpo secondario e successivamente e rivelato per mezzo di una reazione istochimica usando come substrato la diaminobenzidina DAB e l’acqua ossigenata. L’azione dell’enzima perossidasi sul substrato determina un precipitato color rosso-mattone che consente di localizzare l’antigene. Altro enzima molto utilizzato come marcatore è la fosfatasi alcalina. L’utilizzatore di anticorpi marcati con enzimi ha consentito di incrementare la sensibilità dei metodi immunoistochimici in quanto occorrono poche molecole di enzimi per produrre una reazione visibile al microscopio. Si può anche marcare l’anticorpo secondario con isotopi radioattivi, Come per esempio iodio radioattivo, ricorrendo, per la rivelazione, all’autoradiografia. (Reazione indiretta: poiché ad ogni anticorpo primario a livello della porzione Fc, si legano 2 molecole di anticorpo, ad ogni molecola di antigene corrisponde un maggior numero di fluorocromo)
