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GENETICA
MUTAZIONI e POLIMORFISMI
POLIMORFISMI= variazione del DNA con effetto neutrale (non causano patologie) MUTAZIONE= cambiamento permanente del patrimonio genetico, ossia nella sequenza dei nucleotidi codificanti, con effetto negativo nel fenotipo.
ORGANIZZAZIONE DEL DNA NEI CROMOSOMI
1. CROMOSOMI= DNA + PROTEINE (ISTONICHE O NON ISTONICHE)
NUCLEOSOMA= DNA + PROTEINE ISTONICHE (8)
COMPATTAMENTO DEL DNA:
Consente il contenimento in un ristretto spazio cellulare (NUCLEO) Protezione da eventuali danni Maggiore stabilità per una corretta espressione delle informazioni geniche Efficiente trasmissione alle cellule figlie Facilita l’espressione genica e la ricombinazione
- ISTONI= proteine attorno alle quali si avvolge il DNA eucariotico CARATTERISTICHE: proteine basiche cariche positivamente, questa carica consente al DNA, carico negativamente di essere attratto.
- DNA LINKER= tratto di DNA fra due nucleosomi (tratto di DNA che non è avvolto attorno a proteine istoniche). DNA CORE= tratto di DNA associato ai nucleosomi (tratto di DNA avvolto attorno a proteine istoniche). Le zone di DNA che non sono organizzate in nucleosomi, sono impegnate nell’ESPRESSIONE GENICA, REPLICAZIONE e RICOMBINAZIONE.
- ETEROCROMATINA= cromosomi che rimangono condensati dopo la mitosi, sono perciò porzioni di DNA geneticamente inattive e per questo non vengono trascritte (corrisponde all’80% del DNA nucleare). Formata spesso da sequenze di nucleotidi ripetute molte volte. EUCROMATINA= la porzione di cromatina trascrizionalmente attiva e meno condensata. È formata da sequenze nucleotidiche non ripetute. ETEROCROMATINA FACOLTATIVA= porzione di DNA che è in grado di trasformarsi in eucromatina. I geni sono repressi. L’inattivazione di un segmento di cromosoma non viene accompagnato da un alterazione della struttura genica
CODICE GENETICO
= insieme di tutte le possibili combinazioni di 4 basi prese a 3 per volta per formare un amminoacido. Le triplette sono 64 in totale e gli amminoacidi sono 20, per cui:
- Molti amminoacidi vengono codificati da più di una tripletta
- Esistono 3 triplette di stop
- Esiste una tripletta d’inizio (AUG)
MUTAZIONI
ENDOGENE: errori della DNA polimerasi.
CROMOSOMI EUCARIOTICI= 50%
DNA + 50% PROTEINE ISTONICHE
ESOGENE: le cause sono esterne: raggi x, raggi ultravioletti… DANNI AL DNA DERIVANTI DA ESPOSIZIONE A RADIAZIONI IONIZZANTI: ROTTURA SINGOLO FILAMENTO ROTTURA DEL DOPPIO FILAMENTO MODIFICAZIONE CHIMICA DELLE BASI: cambiano le regole di appaiamento RIMOZIONE DI SINGOLE BASI TIPOLOGIE DI MUTAZIONI
- CROMOSOMICHE ANOMALIE DI NUMERO: o POLIPLOIDIA o ANEUPLOIDIA ANOMALIE DI STRUTTURA: o TRASLOCAZIONE o INVERSIONE o DELEZIONE/INSERZIONE o DUPLICAZIONE MIXOPLOIDIA: o MOSAICISMO: la presenza di due o più linee genetiche diverse, ossia diversi patrimoni genetici all’interno di uno stesso individuo che vengono espressi contemporaneamente.
- GENICHE: MUTAZIONI PUNTIFORMI o INTRONI: sequenze non codificanti o PROMOTORI: o ESONI: sequenze codificanti MUTAZIONI EPIGENETICHE: variazioni dell'espressione genica senza però alterare la sequenza del DNA, quindi senza provocare modificazioni nella sequenza dei nucleotidi che lo compongono.
POLIPLOIDIA
- TRIPLOIDIA: 3n (tre copie per ogni cromosoma) CAUSE DISPERNIA: fecondazione di una cellula aploide da parte di 2 spermatozoi aploidi (maggior parte dei casi) DIGENIA: fecondazione da parte di un spermatozoo aploide di una cellula uovo diploide DIANDRIA: fecondazione di una cellula uovo aploide da parte di un spermatozoo diploide. NON È COMPATIBILE CON LA VITA
- TETRAPLOIDIA: 4n (quattro copie per ogni cromosoma). CAUSA
MUTAZIONI GENETICHE
MUTAZIONI PUNTIFORMI
- TRANSIZIONI: alcune purine si trasformano in altre purine e alcune pirimidine si trasformano in altre pirimidine.
- TRASVERSIONI: alcune purine si trasformano in pirimidine e viceversa. A seconda di dove avvengono all’interno del gene si possono avere differenti effetti: INTRONI: non portano a conseguenze negative perché queste regioni vengono eliminate durante lo splicing. Se però ciò avviene in zone particolari per lo splicing allora ci saranno delle conseguenze negative, uno di questi effetti potrebbe essere quello che l’introne non viene eliminato perché non riconosciuto come tale. PROMOTORI: non modificano la qualità del gene (la sequenza del gene non cambia e perciò non viene prodotta una proteina diversa), quello che cambia è la quantità. Possono infatti modificare la velocità della trascrizione se la mutazione avviene a livello dei silenziatori, possono inibire la trascrizione se queste avvengono nel promotore. ESONI: sono le più critiche (esoni= sequenze codificanti) o PER SOSTITUZIONE: MUTAZIONE SILENTE: se viene sostituita una base con un’altra (in terza base). Siccome ci sono più sequenze di amminoacidi che sintetizzano una proteina, cambianti di questo tipo non portano conseguenze patologiche. MUTAZIONI MISSENSO: MUTAZIONI NON-SENSO: trasformano una tripletta che codificava per una certa proteina in una tripletta di stop. Come conseguenza si avrà una proteina tronca. o FRAME-SHIFT: sono aggiunte o perdite di basi che portano ad una scorretta lettura da parte della DNA polimerasi delle regioni a valle. DELEZIONE: viene eliminata una base INSERZIONE: viene aggiunta una base
MOSAICISMO
Tali cellule derivano tutte dallo stesso zigote e si formano a causa di irregolari divisioni cellulari, oppure per mutazioni riguardanti il numero e la struttura dei cromosomi, oppure ancora per mutazioni nei geni. Il mosaicismo può riguardare:
- Il DNA mitocondriale, nel qual caso prende il nome di ETEROPLASMIA
- Il DNA nucleare della cellula, generando il MOSAICISMO PROPRIAMENTE DETTO. Il mosaicismo patologico si verifica molto spesso con una non-disgiunzione mitotica, in questo caso la cellula non divide equamente il proprio patrimonio genetico e genererà due cellule figlie, delle quali una con un numero superiore di cromosomi rispetto all’altra. Ognuna di queste cellule figlie avrà poi una discendenza uguale a sé stessa, e ciò comporterà due linee cellulari diverse in un unico organismo. Alla base del mosaicismo c’è un errore nella divisione cellulare durante lo sviluppo embrionale. Se le cellule affette dall’anomalia sono poche, è possibile che gli effetti sull’individuo siano limitati. Qualora fossero la maggioranza, diventa molto più probabile che si manifestino delle patologie. Ad esempio, è possibile avere sindrome di Down, di Klinefelter e di Turner da mosaico.
MUTAZIONI DI SPLICING= avvengono se vengono alterate le sequenze nucleotidiche a monte o a valle degli introni. EREDITARIETA’ DIGENICA= 2 mutazioni in 2 geni distinti ETEROZIGOSI COMPOSTA= 2 mutazioni diverse nello stesso gene. EREDITARIETA’ TRIALLELICA= 2 mutazioni di un singolo gene più una terza in un altro gene.
MALATTIA AUTOSOMICA DOMINANTE E RECESSIVA
DOMINANTE= Una malattia monogenica si dice a trasmissione ereditaria autosomica dominante quando il gene coinvolto è localizzato su una delle 22 coppie di cromosomi, detti autosomi, e il carattere patologico si manifesta quando è alterata una sola copia del gene. CARATTERISTICHE: Soggetti affetti generalmente nascono da unioni tra un genitore ammalato e uno sano Probabilità del 50% figli che non hanno ereditato, dai genitori, nessuno degli alleli mutati (individui omozigoti aa) e che a loro volta non trasmetteranno l’allele con la mutazione, in quanto hanno entrambe le copie normali del gene Probabilità del 50% figli affetti che hanno ricevuto una copia normale e una mutata del gene (soggetti eterozigoti Aa) e che a loro volta hanno la probabilità del 50% di trasmettere ai loro figli l’allele mutato A Possono colpire individui sia di sesso maschile che femminile Non salta le generazioni ESEMPIO: la neurofibromatosi RECESSIVA= Una malattia monogenica si dice a trasmissione ereditaria autosomica recessiva quando il gene coinvolto è localizzato su una delle 22 coppie di cromosomi, detti autosomi, e il carattere patologico si manifesta solo se sono alterate entrambe le copie del gene. CARATTERISTICHE: PORTATORE SANO= individuo che ha una sola copia alterata di un gene si chiama eterozigote per una specifica mutazione e non manifesta la malattia Soggetti affetti generalmente nascono da unioni tra due genitori portatori sani Probabilità del 25% figli che non hanno ereditato, dai genitori, nessuno degli alleli mutati (individui omozigoti AA) e che a loro volta non trasmetteranno l’allele con la mutazione, in quanto hanno entrambe le copie normali del gene Probabilità del 50% figli che hanno ricevuto una copia normale e una mutata del gene (soggetti Aa); sono, quindi, portatori sani (come i genitori) e a loro volta hanno la probabilità del 50% di trasmettere ai loro figli l’allele mutato a Probabilità del 25% figli che hanno entrambe le copie alterate del gene (soggetti omozigoti aa) e che manifesteranno la patologia Possono colpire individui sia di sesso maschile che femminile Possono saltare le generazioni ESEMPIO: mutazioni nelle due copie del gene Cx26 sono all’origine di una delle forme di sordità genetica non sindromica.
Questa tecnica viene utilizzata nel caso in cui dal cariotipo non esce nessuna variazione. La FISH non viene applicata di routine all’analisi del cariotipo, ma solo nei casi selezionati in base a specifici sospetti diagnostici o per caratterizzare determinate anomalie citogenetiche. Cariotipo moderno che sfrutta l’ausilio di sonde del DNA che vanno ad ibridarsi nei cromosomi. È un rafforzamento del cariotipo che va eseguito in seconda battuta. Mentre quando il genetista fa il cariotipo è spettatore, nel senso che la maggior parte del lavoro lo esegue un macchinario, qui il genetista deve sapere cosa andare a cercare. Tramite la FISH si possono identificare moltissime alterazioni microscopiche del DNA. Questo metodo non funziona su MUTAZIONI PUNTIFORMI. Qualsiasi sequenza di DNA o RNA di un gene o cromosoma può essere riconosciuta perché in condizioni sperimentali è in grado di appaiarsi con una sequenza complementare di DNA o RNA usata come sonda (PROBE) in modo da formare doppie eliche (= IBRIDAZIONE DELL’ACIDO NUCLEICO). In base al calcolo di quanto DNA dei due organismi si ibrida si può definire se essi appartengono alla stessa specie, allo stesso genere, o di generi differenti. FASI: DENATURAZIONE DNA: in modo tale da rendere visibile al PROBE i singoli filamenti (anche il probe deve essere denaturato per potersi ibridare). Aggiungo il PROBE (sostanza fluorescente) nel DNA. PROBE= breve sequenza a singolo filamento di: o DNA: ibridazione avviene sul DNA genomico, usata per evidenziare la presenza e la posizione di un determinato gene a livello del nucleo o sui cromosomi. o RNA: riconosce specifici mRNA, usata per evidenziare l’espressione di un determinato gene in un aspecifica linea cellulare. Studio l’espressione genetica. IBRIDAZIONE: Vengono riuniti i filamenti e si visualizza il modo in cui si è appaiato il probe con il filamento di DNA del soggetto da analizzare. Se si ha una delezione il probe non riconosce nulla di complementare e quindi non si lega al DNA. Questo cambia se il gene mutato è eterozigote oppure omozigote. DELEZIONE IN OMOZIGOSI: 4/4 cromosomi con segnali di fluorescenza DELEZIONE IN ETEROZIGOSI: 2/4 cromosomi con segnali di fluorescenza LIMITE: la lunghezza del probe, infatti se è troppo piccolo si avrà un segnale molto debole e quindi non si riescono a vedere mutazioni che coinvolgono meno di un centinaio di nucleotidi. È possibile anche creare un probe che riconosce l’mRNA, in modo tale da studiare l’espressione e la locazione di particolari RNA di interesse. FISH CONSENTE utilizzata direttamente su: SEZIONE DI TESSUTI CROMOSOMI METAFASICI NUCLEI INTERFASICI CROMOSOMI MECCANICAMENTE ALLUNGATI FIBRE DI CROMATINA ESTESA Questo metodo utilizza il MICROSCOPIO A FLUORESCENZA per visualizzare il risultato finale.
CARIOTIPO MOLECOLARE (CGH)
CGH= COMPARATIVE GENOMIC HYBRIDIZAZION
Sfrutta tecnologie molto avanzate. Evoluzione del cariotipo e della FISH. Permette di vedere quello che sfugge al cariotipo e alla FISH. Il genetista diviene spettatore come nel cariotipo. CARIOTIPO CLASSICO- FISH- CGH Il successo non dipende dalla scelta del probe, infatti questo metodo si basa su eventi di ibridazione che avvengono su tutto il genoma. SCOPO: consente l’identificazione di variazioni del numero di copie di piccole dimensioni, anche di poche centinaia di paia di basi, e la conseguente scoperta di nuove sindromi da microdelezione e microduplicazione. Inoltre l’array-CGH permette di definire esattamente la regione genomica alterata e quindi anche i geni in essa contenuti, migliorando la comprensione delle relazioni esistenti tra le anomalie del DNA e la patologia del paziente esaminato. Permette l’individuazione di sequenze delete o duplicate nel genoma da testare (RED) mediante il confronto con un genoma di riferimento (GREEN). DOVE VIENE UTILIZZATA
- DIAGNOSI POSTNATALE
- DIAGNOSI PRENATALE: per individuare mutazioni che hanno come conseguenza patologie riguardanti le monosomie, trisomie nel feto. FASI La richiesta di una CGH parte da un medico che ha un paziente con determinati sintomi, con una sospetta patologia.
- Si deve avere il DNA del paziente di riferimento e DNA controllo (DNA genomico reale umano che non presenta alterazioni).
- Tramite la PCR si amplifica il filamento templato di DNA, al fine di produrre un elevato numero di DNA del paziente e del controllo, identificandoli tramite marcatori (verde= paziente, rosso= controllo)
- I due DNA vengono mescolati in parti uguali.
- I due DNA vengono denaturati e successivamente ibridati contemporaneamente su un vetrino da laboratorio sul quale sono disposte migliaia di brevi sequenze di DNA sonde che possono coprire l’intero genoma umano. Ciò consente di verificare se vi siano perdite o acquisizioni di materiale genetico nel DNA del paziente.
- Il risultato poi viene misurato da uno scanner che emette luce laser ed è in grado di leggere l’intensità delle variazioni di fluorescenza dei DNA utilizzati.
- Si fa avvenire l’ibridazione. Se il DNA del paziente e controllo sono uguali, l’attaccamento del probe sarà uguale in tutte e due le molecole. Se è presente una mutazione in omozigosi comparirà nel cip il colore rosso, mentre se è presente una mutazione in eterozigosi nel cip comparirà un giallo tendente al rosso. Teoricamente ogni singolo probe trova il suo segmento complementare e quando si fa avvenire l’ibridazione si hanno sovrapposizioni di segnali dei due diversi DNA, che saranno metà di un colore e metà dell’altro, risultando in un colore di mezzo, ossia il giallo, che identifica la normalità.
È una reazione SEMICONSERVATIVA, infatti il nuovo DNA avrà un filamento nuovo e uno vecchio. TAQ DNA POLIMERASI= enzima che riesce a resistere alle alte temperature (TAQ= termo-resistente). ELETTROFORESI SU GEL= utilizzato per visualizzare il prodotto della PCR e si basa sulla migrazione mediante flusso di corrente di tutti i filamenti di DNA presenti nel pozzetto e in base alla grandezza del filamento questo migrerà in posizione differente. Infine si inserisce un marcatore e si visualizza il prodotto tramite fluorimetro.
REAL TIME PCR
Ct= CICLO SOGLIA PCR è un saggio qualitativo e quantitativo.
SEQUENZIAMENTO GENICO
= arrivare a determinare un ELETTROFEROGRAMMA (decifrare il codice del DNA). SCOPO: mappare il genoma di un organismo, ovvero identificare i geni di un organismo. INVENTORE: Sanger FASI: PRIMA DEL SEQUENZIAMENTO: o SCELTA DEL BERSAGLIO o SCELTA DEL PRIMER o ESTRAZIONE DEL DNA DELLE CELLULE DURANTE IL SEQUENZIAMENTO: o AMPLIFICAZIONE DEL BERSAGLIO o VERIFICA DEL BERSAGLIO o PURIFICAZIONE o VERIFICA o PCR DI SEQUENZIAMENTO o PURIFICAZIONE DELL’AMPLIFICATO ELETTROFEROGRAMMA DOPPIO PICCO= dal punto di vista allelico è l’eterozigosità (presenza di 2 basi diverse A e C). PRINCIPIO DI SANGER NUCLEOTIDE TERMINATOR o DESOSSINUCLEOTIDI= filamento di nucleotide a cui manca il gruppo ossidrile in 3’, ciò impedisce l’attacco della DNA polimerasi. Ha preso il DNA batterico e tramite degli enzimi di restrizione ne ha rotto il DNA Ha poi fatto una miscela contenente:
PRIMER
DNA POLIMERASI
4 NUCLEOTIDI TERMINATOR
4 NUCLEOTIDI NORMALI
A colorato i 4 nucleotidi terminator con 4 sostanze fluorescenti di colore diverso. Ha suddiviso poi la miscela in 4 provette, ciascuna contenente uno dei quattro nucleotidi terminator colorati. In ogni miscela si formano frammenti di lunghezza diversa, a seconda del punto in cui l’allungamento è stato interrotto da nucleotide terminator Si caricano poi i prodotti delle quattro reazioni nei pozzetti di gel per l’elettroforesi. Procedendo dal frammento più piccolo verso il più grande, si ricostruisce l’ordine con cui i nucleotidi sono stati incorporati. La sequenza che emerge è complementare a quella che si intendeva sequenziare. SLIDE 250 ANALISI DI LINKAGE Permette di determinare la posizione cromosomica di un locus responsabile di una determinata malattia rispetto a marcatori polimorfici la cui locazione è nota. È utile per il mappaggio e l’identificazione di geni responsabili di malattie genetiche Mendeliane, mentre è più difficoltosa l’identificazione dei numerosi geni implicati in malattie più comuni ad ereditarietà più complessa. REQUISITI Una o più famiglie in cui segrega il carattere/malattia che si vuole analizzare. Marcatori genetici facilmente tipizzabili e stabili di generazione in generazione, che hanno una posizione nota nel genoma. Microsatelliti= ripetizione in tandem di 2-4-4 nucleotidi. SNPs= differenze di singole basi, non necessariamente riconosciuti da enzimi di restrizione Si basa sulla co-segregazione alla meiosi di 2 o più loci. Se essi vengono ereditati insieme frequentemente allora è probabile che siano localizzati vicini fra di loro sul cromosoma. SLIDE 142+
