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IL DNA
Il ruolo
All’inizio degli anni quaranta del novecento ormai era certa l'esistenza dei geni e il fatto che fossero stanziati sui cromosomi, era in dubbio quale fosse la sostanza alla base della trasmissione delle informazioni ereditarie, ripercorriamo quindi le tappe che portarono al riconoscimento del ruolo del DNA: La scoperta del DNA e confusione iniziale Il DNA venne scoperto nel 1869 da un medico tedesco che isolò questa sostanza sulle garze usate in ospedale, inizialmente la sostanza venne chiamata nucleina , dopo le analisi chimiche venne chiamata acido nucleico e poi acido desossiribonucleico. Quindi quando nel 1900 dimostrarono che i geni si trovano sui cromosomi iniziò il dibattito su quale fosse la sostanza alla base della trasmissione dell informazioni ereditarie, poiché i cromosomi erano formati da DNA e proteine , tale sostanza era una delle due, i primi esperimenti si concentrarono sulle proteine, ma dai risultati si vide che non potevano esser loro, così con una serie di esperimenti successivi che vedevano il DNA come tale sostanza si arrivò alla soluzione. Per tali esperimenti si utilizzano batteri e virus, questo perché avendo loro una struttura più semplice rendevano il lavoro più agevole. Esperimento di Griffith Il primo esperimento che portò a vedere il DNA come sostanza alla base delle trasmissioni generiche fu quello di Griffith, lo scienziato voleva trovare un vaccino contro la polmonite studiandone il pneumococco. Griffith lavorava su due diversi ceppi di pneumococco: ● il ceppo S, che produceva colonie dalla superficie liscia e lucida, il quale era altamente patogeno; ● il ceppo R, che produceva colonie dalla superficie irregolare, il quale non era patogeno; Inizialmente inoculò nei topi dei batteri S prima esposti ad alte temperature, osservò che non erano più capaci di produrre un'infezione; poi inoculò una miscela di batteri S uccisi e batteri R vivi, osservò che si generava un infezione, dall’autopsia dei topi notò la presenza di batteri sia R che S vivi, concluse che
alla presenza dei batteri S alcuni batteri R si erano trasformati nel ceppo patogeno S, tale cosa avveniva anche in provetta e per di più alcuni anni dopo si vide che bastavano solo dei frammenti del ceppo S insiema agli R per far generare un’infezione. Dunque l’esperimento di Griffith indicò la presenza di una sostanza che passata dal ceppo S a quello R, produceva in loro un cambiamento ereditario, tale sostanza venne denominata fattore di trasformazione. Esperimento di Avery I risultati di Griffith vennero ripresi da Avery, che voleva scoprire cosa fosse il fattore di trasformazione allora fece degli esperimenti: prese i campioni contenenti il fattore di trasformazione del pneumococco e con diversi trattamenti distrusse selettivamente i diversi tipi di biomolecole, e verificò la capacità di trasformare le culture batteriche dei campioni trattati. Così si vide che gli unici campioni in grado di non trasformare le culture erano quelli in cui veniva distrutto il DNA, anche dopo l’esperimento di Avery molti scienziati rimasero scettici. Esperimento di Hershey e Chase Un ultima conferma che il materiale genetico è costituito da DNA arrivò dall esperimento di Hershey e Chase. Questi due scienziati usarono il batteriofago T2 che infetta il batterio dell Escherichia coli per determinare se il materiale genetico fosse costituito da DNA o proteine. Scelsero il T2 perché sapevano fosse costituito da DNA e un rivestimento di proteine, quindi un ottimo modello di studio. Sapendo che quando il batteriofago infetta un batterio una parte del virus penetra nella cellula e dopo 20 min la cellula collassa e libera particelle virali. Gli scienziati si adoperano a capire se tale sostanza fosse fatta di proteine o DNA. Prepararono due campioni di fagi: ● uno costituito da T2 contenente l’isotopo radioattivo 32P del fosforo che venne incorporato nel DNA; ● uno costituita da T2 contenente l’isotopo radioattivo 35S dello zolfo che venne incorporato dalle proteine; Usarono i due campioni per infettare colture di E. coli in fiasche separate. Dopo l’infezione le soluzioni vennero omogeneizzate e poi centrifugate, i risultati erano chiari: il DNA era all’interno delle cellule mentre le proteine in sospensione all’esterno.
Legame dei nucleotidi I nucleotidi sono tenuti insieme da un legame fosfodiesterico, ovvero ogni gruppo fosfato tiene insieme due zuccheri, mentre tra le basi azotate si formano dei legami a idrogeno, due tra adenina e timina e tre tra guanina e citosina
La replicazione
La replicazione del DNA è di tipo semiconservativo, ogni filamento della molecola madre funge da stampo per il nuovo filamento, cosicché le due molecole neoformate contengano un filamento vecchio e un filamento neosintetizzato. Eventi Il DNA per replicarsi ha bisogno di altre molecole tra cui enzimi e nucleotidi, la replicazione si divide in due fasi. Nella prima fase, gli enzimi di elicasi si occupano di spezzare i legami ad idrogeno delle basi e gli enzimi di topoisomerasi si occupano di despiralizzare il DNA, in questo modo i due filamenti si allontanano e possono fare da stampo, i filamenti vengono tenuti stabilmente a distanza da proteine chiamate single strand binding proteins, nella seconda fase gli enzimi DNA polimerasi formano il nuovo filamento saldando i nucleotidi con legami fosfodiesterici. La formazione dei nuovi filamenti avviene grazie alla complementarietà delle basi, se la base azotata del filamento stampo è una timina, soltanto l’Adenina potrà prendere posto nel nuovo filamento. Processo La replicazione ha inizio quando il complesso di replicazione , un gruppo di proteine, si lega al DNA in corrispondenza di una specifica sequenza di basi chiamata origine di replicazione , a partire dall’ori il DNA si replica in entrambe le direzioni (replicazione bidirezionale), formando una bolla di replicazione, che genera una struttura ad Y, nota come forcella di replicazione. Poiché negli eucarioti ci sono più ori si vengono a formare più bolle di replicazione, una volta che la bolla termina di sintetizzare i nuovi filamenti si unisce ad altre bolle,quindi le due catene a doppio filamento si separano completamente e formano due nuove doppie eliche quindi due nuove molecole di DNA.
Il complesso di replicazione In passato si riteneva che il complesso di replicazione si muovesse lungo la molecola di DNA, oggi sappiamo che in realtà resta fermo e che è invece il DNA a muoversi all’interno del complesso di replicazione, tenuto fermo da strutture nucleari. La DNA polimerasi Le DNA polimerasi sono enzimi molto grandi, la forma è simila a una mano semiaperta, nel palmo si avvicinano i nucleotidi allo stampo, nelle dita si riconoscono le basi presenti. La DNA polimerasi ha bisogno di un innesco, chiamato primer, che contenga un’estremità 3’ libera al quale aggiungere nucleotidi, Il primer è costituito da una piccola sequenza di RNA che al termine della replicazione viene rimossa e sostituita da DNA. Il primer viene generato da un enzima chiamato RNA primasi. La DNA polimerasi inoltre si muove in una sola direzione, infatti crea nucleotidi in direzione 5’ ➡ 3’ , di conseguenza l'allungamento dei nuovi filamenti procede in modo diverso: ● un filamento è detto veloce perchè può allungarsi in maniera continua senza interruzioni, è il filamento corrispondente a allo stampo che va in direzione 3’ ➡ 5 ’. ● l’altro filamento è detto lento perché procede in modo discontinuo e a ritroso, partendo dalla forcella di replicazione crea filamenti di DNA relativamente piccoli, chiamati frammenti di Okazaki. Sul filamento veloce la DNA polimerasi procede in maniera continua in quanto trova un solo primer all’inizio della replicazione, nel filamento lento invece la DNA polimerasi procede in maniera discontinua poiché trova più primer, dopo essere stati usati i primer vendono comunque sostituiti da DNA e i tanti frammenti di Okazaki vendono uniti da un enzima chiamato DNA ligasi. I sistemi di controllo La replicazione avviene in modo preciso grazie ad alcuni sistemi di controllo, il primo è la selezione delle basi: le DNA polimerasi possono creare legami tra i nucleotidi solo se questi sono guia appaiati correttamente ai nucleotidi complementari sul filamento stampo. Questo sistema oltre a tenere conto della
● due primer di RNA a filamento singolo sintetizzati in laboratorio, complementari alle estremità della sequenza desiderata; ● i quattro desossiribonucleotidi trifosfato, ovvero guanosina trifosfato, adenosina trifosfato, citidina trifosfato e timidina trifosfato; ● una DNA polimerasi in grado di resistere ad alte temperature; ● soli di magnesio; Procedimento La PCR è un processo ciclico, in cui tre fasi si ripetono molte volte; prima avviene la denaturazione , ovvero si riscalda la soluzione a circa 90°C per separare i due filamenti del DNA, segue poi la rinaturazione , cioè si raffredda la soluzione in modo da permettere al primer di appaiarsi alle sequenze complementari, infine c’è la fase di allungamento , nella quale la DNA polimerasi completa la sequenza compresa tra i due primer. L’intera sequenza viene ripetuta più volte finché non si raggiunge la quantità desiderata, la crescita della quantità di DNA è esponenziale. Taq polimerasi La PCR funziona grazie all’utilizzo di una peculiare DNA polimerasi chiamata Taq polimerasi, ricavata da un batterio termofilo, il Thermus aquaticus, che vive nelle sorgenti termali, questa DNA polimerasi è peculiare poiché non si denatura in seguito alle alte temperature toccate nella PCR.
La struttura dei genomi
L’intero DNA di un organismo se viene srotolato è molto più grande della cellula che lo contiene: ad esempio l’intero DNA umano è lungo circa due metri ma è contenuto in cellule molto più piccole. Genoma dei procarioti Ciò è possibile perché nella cellula il cromosoma è compattato attraverso proteine, la struttura che si ottiene viene chiamata nucleoide. Oltre al nucleoide molti batteri hanno altre molecole di DNA di forma sferica chiamate plasmidi.
Genoma degli eucarioti Oggi sappiamo che il genoma degli eucarioti è notevolmente diverso dal genoma dei procarioti. Il genoma degli eucarioti è diviso in cromosomi lineari , ciò è dovuto al fatto che gli eucarioti sono organismi prevalentemente pluricellulari, con cellule altamente specializzate che quindi necessitano di molte proteine diverse. Funzioni sconosciute del DNA Un fatto interessante è che in tutte le cellule eucariotiche esiste una grandissima quantità di DNA le cui funzioni sono ancora poco conosciute, il 98,5% del DNA umano è formato da diverse sequenze ripetute che non si occupano della sintesi di proteine. Una parte sembra avere una funzione strutturale un'altra sembra non avere alcuna funzione, quest’ultima parte sembra occupare la metà del nostro genoma. Diversi tipi di sequenze ripetute Esistono tre tipi di sequenze ripetute: ● Le sequenze ripetute in tandem: sequenze lunghe da 1 a 5 paia di basi che si ripeto fino a 100 volte; sono usate per distinguere gli individui; ● Le sequenze moderatamente ripetute: responsabili una parte per la sintesi di alcuni RNA e un’altra non è integrata in modo stabile nel DNA ma può spostarsi in varie parti del genoma; ● le sequenze altamente ripetute: lunghe circa cento paia di basi possono apparire anche in milioni di copie; DNA nell’interfase Nell’interfase, il periodo di tempo che intercorre da una mitosi e quella successiva, il materiale genetico di un procariote si trova sotto forma di cromatina , formata da proteine, DNA e una piccola quantità di RNA. Le proteine più abbondanti sono gli istoni che hanno il ruolo di condensare e impacchettare il DNA. Esistono cinque tipi di istoni. Osservando il nucleo di una cellula nell’interfase si distinguono due tipi di cromatina: ● eucromatina, circa l’80%, dove si trovano i geni responsabili della sintesi delle proteine; ● eterocromatina, la parte restante, associata ai telomeri;
