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LE LIBRERIE GENOMICHE
Per costruire una libreria genomica si procede in questo modo: 1) Estraggo il DNA di un individuo (es: Pinot nero). 2) Faccio una digestione con enzimi di restrizione ed ottengo una serie di frammenti che nel loro insieme costituiscono tutto il genoma. 3) Estraggo il DNA di un vettore di clonaggio (es: plasmidi o fagi) e lo digerisco con gli stessi enzimi di restrizione. 4) Prendo i diversi frammenti e ne favorisco l’inserimento nei vettori di clonaggio utilizzati ottengo delle molecole ricombinanti. 5) Se ogni frammento che costituisce il genoma del Pinot nero è inserito in un vettore di clonaggio ottengo una libreria genomica di Pinot nero. Libreria genomica l’insieme di tutti i vettori di clonaggio, ognuno dei quali contiene un frammento di DNA dell’individuo.
I vettori di clonaggio (approfondimento) I vettori di clonaggio “classici” sono i plasmidi ; tra questi, il plasmide pBR322 è uno dei più utilizzati. I plasmidi presentano 3 siti molto importanti: un sito di origine della replicazione, un sito di “polilinker” ed un sito di resistenza ad un antibiotico. Sito di “polilinker” un sito che presenta una serie di sequenze che sono riconosciute dagli enzimi di restrizione. Tutti gli enzimi di restrizione che riescono a riconoscere le sequenze sul “poliniker” possono digerire il plasmide e renderlo lineare. Avere un plasmide in forma lineare è fondamentale per la creazione della molecola ricombinante; se il plasmide è chiuso risulta stabile e non può essere utilizzato!! Sito di resistenza ad un antibiotico questo sito risulta di fondamentale importanza. Infatti le cellule batteriche nelle quali il plasmide verrà fatto replicare vengono cresciute in un substrato nel quale c’è dell’antibiotico. Sito di origine della replicazione
Come unire i frammenti per ottenere l’esatta sequenza del DNA?
- Digerisco il genoma dell’individuo con enzimi di restrizione diversi;
- Tutti i frammenti ottenuti gli metto in vettori di clonaggio, gli moltiplico e gli sequenzio mediante metodo Sanger.
- Otterrò sicuramente dei frammenti che possono sovrapporsi tra di loro in questo modo potrò ricostruire la sequenza completa del genoma dell’individuo.
AMPLIFICAZIONE DI UNA LIBRERIA GENOMICA
Quando abbiamo un vettore di clonaggio per ogni frammento del DNA dell’individuo abbiamo ottenuto una libreria rappresentativa. A questo punto il passo successivo è amplificare la libreria stessa. L’amplificazione della libreria ha lo scopo di ottenere più copie dei diversi vettori di clonaggio ottenere una quantità sufficiente di frammento per effettuare delle successive analisi. I vettori di clonaggio vengono fatti replicare in cellule batteriche (E. coli) secondo la modalità vista precedentemente. Ciò che si ottiene alla fine della moltiplicazione è una serie di colonie: Ogni colonia contiene un clone. L’insieme delle colonie (fagi o di plasmidi) costituisce la nostra libreria genomica.
ANALISI DI UNA LIBRERIA GENOMICA (SCREENING)
Come trovare il frammento di interesse? Lo scopo è cercare una sequenza di DNA che a noi interessa studiare. Molto spesso si conosce tale sequenza in un organismo che non è il nostro ma che è già stato studiato (es: Arabidobsis). Esempio: sono interessato a cercare il gene che codifica per un enzima per la sintesi delle antocianine. Non ho le informazioni riguardo la sequenza di questo gene in vite, però le ho da Arabidobsis. Infatti, in questa specie modello, è stato proprio sequenziato un enzima della sintesi delle antocianine. Inizialmente mi trovo con una scatola petri all’interno della quale vi sono una serie di colonie contenenti diversi cloni. Il DNA presente in ogni colonia viene trasferito su un filtro di cellulosa (viene posto sopra le colonie stesse). A questo punto posso cercare la sequenza di DNA che mi interessa analizzare nel filtro di cellulosa. Una volta trovata, pesco la stessa dalla scatola petri. Il clone desiderato viene quindi prelevato dalla scatola petri e messo in cultura in modo da poterlo analizzare successivamente.
LE LIBRERIE DI ESPRESSIONE
Se prendo una foglia di vite oppure una radice tutte le loro cellule hanno lo stesso DNA. Ma le foglie e le radici si differenziano fra di loro perché esprimono geni di tipo diverso!! La libreria di espressione è tipica di un determinato tessuto. Come si crea una libreria di espressione: Prendo un tessuto (es: foglia) ed estraggo l’RNA totale. Purifico l’RNA messaggero (rappresenta l’insieme dei geni che vengono trascritti e quindi utilizzati). Attraverso un enzima particolare (trascrittasi inversa) l’RNA viene convertito in C-DNA. In poche parole il C-DNA è una molecola di DNA complementare ad una molecola di RNA. Il C-DNA viene inserito nei vettori di clonaggio ( plasmidi ). Se faccio questa operazione per tutte le molecole di RNA alla fine ho una libreria di espressione. Libreria di espressione l’insieme di tutti i vettori di clonaggio, ognuno dei quali contiene una molecola di m-RNA che viene espressa in quel specifico tessuto. Come si purifica l’RNA messaggero? Tutti gli RNA-messaggeri sono caratterizzati da una coda di poliA; questa caratteristica è molto importante e consente di separare l’RNA messaggero dall’RNA ribosomiale (rappresenta il 98-99% dell’RNA totale). Per purificare l’RNA esistono delle colonnine ricoperte con una resina che presenta delle code di T. L’ RNA-messaggero viene trattenuto da questa resina (grazie alla presenza della coda di poliA) mentre l’RNA-ribosomiale viene lavato via. L’uso finale di un buffer permette la rottura dei legami formati tra resina ed RNA permettendo l’estrapolazione di quest’ultimo.
Come avviene la formazione del C-DNA? In una soluzione contenente RNA messaggero aggiungo un particolare primer oligo-dT ; il primer si lega alla coda poliA della molecola. Aggiungo nella soluzione l’enzima “ trascrittasi inversa ” che sintetizza una sequenza di DNA complementare all’RNA messaggero.
Come avviene il clonaggio del C-DNA? Per facilitare il clonaggio delle molecole di C-DNA attacco degli adattatori alle sue estremità (come in figura). In questi adattatori ci sono i siti di riconoscimento degli enzimi di restrizione. Tali enzimi tagliano gli adattatori e formano le sticky ends. Con gli stessi enzimi di restrizione taglio il plasmide. In questo modo il mio frammento riesce a richiudersi con il plasmide grazie alle sticky ends.
N.B. grazie all’utilizzo di due enzimi di restrizione diversi non perdo mai l’orientamento del trascritto (cloning direzionale). Quali problemi con le librerie a C-DNA? In ogni tessuto alcune molecole di RNA sono fortemente espresse mentre altre sono espresse a basso livello (e quindi sono difficili da trovare!). Questo porta ad avere problemi di rappresentatività! Se uso il primer che si lega alla coda poliA dell’RNA favorisco i trascritti più espressi. Si è quindi pensato di utilizzare dei primer casuali al fine di avere una maggiore rappresentatività della libreria. Come veniva fatta l’analisi genica ai tempi delle librerie? Abbiamo un C-DNA e lo sequenziamo con il metodo Sanger; otteniamo una sequenza di 600-800 nucleotidi. Usando il codice genetico deduco la sequenza di amminoacidi che caratterizza la proteina che sarebbe prodotta dall’RNA analizzato. Una volta determinata la “sequenza amminoacidica” vado in una banca dati e cerco proteine che assomigliano alla mia proteina. In seguito a questa ricerca scopro, ad esempio, che si tratta di una fosfatasi. A questo punto prendo la mia sequenza a C-DNA e la marco con un radioattivo, formando una “sonda”. Questa sonda la metto in tutte le placche della mia libreria genomica.
