tecnologie genomiche, Sintesi del corso di Genetica

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Tecnologie

Genomiche e

Farmacogenet

ica

Introduzione al corso:

ESAME: vale da giugno in poi. 9 domande a risposta multipla + 3 domande aperte ( 1 per ogni parte). SLIDE: su classroom, ma da sole sono inutili, servono le spiegazioni.

(una della possibile domande aperte: descrivere i risultati della review).

CONTENUTI DEL CORSO: 1.PRIMA PARTE (SCAPOLI): introduzione alla farmacogenetica ed alle tecnologie genomiche:

1. Elementi di genetica di base: polimorfismi, mutazione, mutazioni sinonime e non, inserzione/delezione
2. Variabilità fenotipica (genetica, ambientale) e variabilità genetica nella popolazione umana Variabilità individuale nelle risposte alla terapia farmacologica:
3. Efficacia e tollerabilità
4. Tratti monogenici e poligenici
5. Fenotipi farmacocinetici e farmacodinamici Ricerca del bersaglio biologico e genomica:
6. Genoma umano e ricerca on-target del bersaglio dinamico
7. Metodi di studio in farmacogenetica e farmacogenomica: studi GWA e gene candidato (WES, WGS)

2.SECONDA PARTE (VIZZARI) bioinformatica e tecnologia di sequenziamento

tecnologie genomiche:

1. Metodologie di caratterizzazione della variabilità genetica
2. Da Sanger agli SNP-chip alle next generation sequencing
3. SNV Panels, NGS short reads, NGS long reads
4. Principi delle metodologie NGS: Vantaggi, svantaggi, prospettive. 3.TERZA PARTE (FUSELLI) geni target della farmacogenomica:

Nel momento in cui il farmaco viene ad essere somministrato ed entra all’interno dell’organismo ( FASE FARMACOCINETICA ) segue un percorso costituito da quattro fasi che presentano l’acronimo ADME. Durante il percorso del farmaco all’interno dell’organismo, questo viene ad essere modificato da parte degli enzimi cellulari, i quali lo attivano. Le quattro fasi dell’ADME sono:

1. ASSORBIMENTO : descrive il modo con cui il

farmaco riesce ad entrare all’interno dell’organismo tramite una serie di processi e descrive anche in che modo supera le diverse barriere corporee.

2. DISTRIBUZIONE : il modo in cui il farmaco si

distribuisce nell’organismo e viene trasportato dai trasportatori fino ad arrivare all’organo bersaglio.

3. METABOLISMO : il modo con cui il nostro corpo

modifica chimicamente il farmaco. Descrive come il farmaco viene scomposto (in modo particolare nel fegato)

4. ESCREZIONE: descrive il modo in cui l’organismo

elimina il farmaco sotto forma dei suoi metaboliti. Percorso del farmaco = ADME Per cui la FARMACOCINETICA si occupa di definire il destino del farmaco nell’organismo, ovvero:

• Descrivere quello che fa il farmaco nell’organismo – si può riassumere con lo

slogano “Tutto quello che compie l’organismo al farmaco”

• Utilizzo dei processi fisiologici utilizzati per le molecole endogene e nutritive
• Studia di quanto il farmaco arriva al bersaglio d’azione, il target molecolare. Il farmaco per poter entrare nell’organismo, deve poter attraversare le membrane cellulari, per cui i farmaci devono essere costruiti in modo tale da poter passare le membrane cellulari, soprattutto quelle dell’organo bersaglio. Esistono diversi modi di trasporto e passaggio del farmaco, in base alle caratteristiche chimico-fisiche del

farmaco stesso ( es: diffusione, trasporto). A volte il farmaco può poter passare

attraverso le membrane tramite diffusione passiva ( diffusione passiva di un farmaco

idrosolubile attraverso un canale acquoso o un poro) ( o diffusione passiva di un farmaco

liposolubile sciolto in una membrana) oppure può essere trasportato tramite trasporto

attivo meditato da un carriers specifico – recettore specifico. Quindi, un farmaco può essere trasportato o per diffusione (libera o mediata) o trasportato attivamente. Esistono delle barriere morfo-funzionali in alcuni distretti dell’organismo che limitano il

passaggio a molte molecole, inclusi i farmaci ( barriera ematoencefalica, placenta…)

La genetica interviene e svolge un ruolo importante durante il trasporto, in quanto i carriers sono normalmente proteine codificate da geni specifici. Ma la genetica può intervenire anche a livello del bersaglio molecolare, in quanto questo nel 99% dei casi è una proteina. È importante conoscere la quantità di farmaco disponibile e per quanto tempo il farmaco rimane disponibile all’interno dell’organismo. La concentrazione plasmatica di un farmaco è la risultante di quanto farmaco è presente nei tessuti e di quanto farmaco viene ad essere metabolizzato ed eliminato. Misurare i livelli plasmatici permette di sapere quanto e per quanto tempo il farmaco è disponibile. Per cui è importante capire la dose e le modalità del dosaggio del farmaco stesso. La FARMACODINAMICA , invece, si occupa di studiare l’effetto del farmaco quando interagisce con i recettori posizionati sull’organo bersaglio, scatenando l’effetto del farmaco stesso. In linea generale, si può affermare che i farmaci agiscono stimolando o bloccando le funzioni fisiologiche presenti nell’organismo umano. I meccanismi d’azione dei farmaci si possono ridurre schematicamente a:

1. STIMOLAZIONE di una funzione dell’organismo (ad esempio la digitale che aumenta la forza di contrazione del miocardio)
2. DEPRESSIONE di una funzione (ad esempio anestetici che deprimo le funzioni del SNC)
3. SOSTITUZIONE o supplemento di una attività funzionale mancante o carente (es. insulina nel diabete o tiroxina nell’ipotiroidismo)
4. ELIMINAZIONE di agenti infettivi (antibiotici, antimicotici, antivirali, antiparassitari) o di cellule tumorali (antitumorali). Per cui i farmaci hanno come effetto generale quello di andare a stimolare alcune vie metaboliche o bloccarne (come la via del dolore). L’effetto dei farmaci è dovuto sempre all’interazione tra esso e la struttura biologica del recettore , la cui attivazione media l’effetto terapeutico. Il farmaco agisce sui tessuti bersaglio e sui recettori in senso amplio. La farmacodinamica si può riassumere in modo grossolano come lo stimolo o blocco di una funzione dell’organismo. Il farmaco è una molecole esogena che mima e sostituisce una molecola naturale che di base è già presente all’interno dell’organismo (es. insulina). Il farmaco per scatenare il suo effetto e la sua azione deve andare ad interagire con il recettore cellulare e per questo motivo i recettori sono molto studiati quando si vuole costruire un farmaco. Il recettore cellulare svolge una sua funzione fisiologica, ma può essere riconosciuto e legarsi al farmaco per mediare/contrastare una situazione patologica. Il principio di base

POTENZA = la quantità di farmaco per un determinato effetto (per es. per 50%)  la

potenza di una farmaco è raccomandata per poter garantire l’efficacia in un amplio numero di soggetti, limitare i rischi di tossicità, avere dosi e modalità di dosaggio maneggevoli. Efficacia e potenza sono parametri importanti da studiare in fase di ricerca pre-clinica, in quanto si riferiscono anche ad effetti secondari del farmaco, che talvolta possono anche

essere indesiderati. Si possono costruire delle curve dose-risposta , le quali

permettono anche di poter confrontare tra loro due farmaci differenti. Queste curve permettono di poter definire la concentrazione alla quale il farmaco risulta avere un effetto terapeutico e la concentrazione in cui il farmaco ha un effetto avverso indesiderato. La concentrazione del farmaco che induce una risposta avversa è maggiore della concentrazione del farmaco che induce l’effetto terapeutico, ma è importante anche definire la differenza tra questi due valori di concentrazione. FINESTRA TERAPEUTICA = viene definita come l’intervallo tra la concentrazione minima, al di sotto della quale il farmaco è clinicamente inefficace e la concentrazione

massima al di sopra della quale compaiono i primi effetti tossici. (meglio quando è

grande) tanto più è amplia la finestra terapeutica, tanto più il farmaco è sicuro

( maneggevole ). Tutti i farmaci presentano delle reazioni avverse e potenzialmente tossiche, le quali possono variare in base ai soggetti. Infatti, la risposta dell’organismo ai farmaci non è uguale per tutti i pazienti: pazienti diversi sottoposti alla stessa dose di uno stesso farmaco presentano effetti differenti. Questa differenza è dovuta alla variabilità genetica che differenza ogni individuo tra loro, per cui le differenze sono riscontrabili a livello del genoma. Questo comporta la diversa risposta ai farmaci.

Articolo “Your genes: one size doesn’t fil all” di Magaret Tempero (2017) descrive come

un gruppo di pazienti tutti affetti dalla stessa patologie (es. ipertensione) sottoposti alla

stessa dose di un farmaco non rispondono in maniera uguale tra loro, ma si possono

avere risposte differenti: effetto terapeutico, nessun effetto, tossicità. Questo è dovuto

al fatto che anche se i pazienti presentano tutti la medesima diagnosi, non sono tutti

uguali a livello genetico. Le diverse risposte ad un unico farmaco è dovuta alla

variabilità genetica.

FARMACOGENETICA e FARMACOGENOMICA: GENETICA = studio dei singoli geni di un organismo e delle caratteristiche individuali ereditabili legate ad essi  FARMACOGENETICA = studio delle differenza ereditarie nella risposta di un farmaco, dovute a polimorfismi specifici di geni. (1 GENE) GENOMICA = determinazione e studio dell’intera sequenza del DNA di un organismo, identificazione e studio del livello di espressione dei geni per comprendere le interazioni e l’influenza sui meccanismi biologici e fisiologici in situazioni normali e patologiche (genomica funzionale)  FARMACOGENOMICA = applicazione delle tecniche usate nella genomica per la determinazione e lo studio di più geni associati a malattie ed alla riposta ai farmaci per individuare sia nuovi geni bersaglio per nuove terapie, sia profili genetici utili per lo studio di nuovi farmaci e il loro sviluppo.

( struttura del nostro genoma, coinvolge diversi geni.)  questo risulta studiare un

quadro più complesso che coinvolte più geni all’interno del genoma. Spesso i termini farmacogenetica e farmacogenomica vengono utilizzati come sinonimi. La farmacogenetica si occupa dello studio della variabilità di risposta ad un farmaco dovuta a fattoi genetici ereditari. Nel 1959 Friedrich Vogel conia il termine “farmacogenetica” parlando di una risposta ai farmaci ereditaria e variabile in popolazioni diverse. La farmacogenetica prevede come metodi di studio: analisi genetica (SNPs, profili di espressione genica) ed ha lo scopo di fornire una maggiore sicurezza nella somministrazione della terapia. L’applicazione della farmacogenetica prevede che possano essere individuati per una stessa patologia i pazienti che non rispondono ad un farmaco o i pazienti a rischio di tossicità per quel farmaco. In modo tale, da poter trattare solo i pazienti risultati “responders” con quel determinato farmaco. Mentre gli altri saranno trattati con una terapia alternativa o con dosi ridotte dello stesso farmaco. Le reazioni avverse ai farmaci: la maggior parte di reazioni avverse forti, sono su base genetiche. VARIABILITA DELLA RISPOSTA AI FARMACI: Nonostante i farmaci vengono prescritti come validi per ogni paziente con la stessa diagnosi, vi è una notevole variabilità di risposta alle molecole che vengono somministrate che si può manifestare:

• Mancata o parziale efficacia ( metabolizzatori lenti o intermedi )
• Comparsa di più o meno gravi effetti collaterali. Per cui mentre un determinato p.a. può essere benefico ed innocuo per alcuni soggetti, per altri può rivelarsi inutile o addirittura letale. ( ADR = Adverse Drug Reaction ) È stato registrato che negli USA durante il 1994, quasi 2 milioni di pazienti sono stati ospedalizzati a causa di reazioni avverse a farmaci (ADR = adverse drug reaction),

La risposta ai farmaci varia perché tutti i pazienti sono diversi tra loro. Per cui anche se si somministra la stessa dose di uno stesso farmaco a pazienti che presentano la medesima malattia si possono ottenere effetti diversi. La grande variabilità nella risposta ai farmaci è dovuta a fattori esogeni ed endogeni che possono essere raggruppati all’interno di tre categorie di cause: fisiologiche, patologiche e genetiche. Vi è sempre più di un fattore che determina questi “fenotipi complessi”. Per quanto riguarda le cause non genetiche , queste possono essere:

1. Patogenesi e severità della malattia
2. Età del paziente
3. Patologie concomitanti
4. Funzione epatica e renale
5. Interazione tra altri farmaci
6. Stile di vita ed abitudini alimentari. Quindi la variabilità di risposta ai farmaci risulta determinare dei “fenotipi ereditari complessi”, visto che questi sono sempre determinati sia da un fattore genetico che da

una componente ambientale – non genetica ( la quale può essere qualsiasi fattore,

anche lo stile di vita, che impatta sulla risposta ai farmaci).

Le cause genetiche responsabili della variabilità inter-individuale possono essere classificate in:

1. Fattori genetici: differenze nel genoma dal punto di vista generale
2. Differenze etniche: differenze nel genoma dal punto di vista della genetica di popolazione Si è calcolato che circa il 25-50% dei casi di terapia inefficace o ADR siano dovute a cause genetiche. Questa variabilità nella risposta ai farmaci determina che gli individui si possano classificare in 4 categorie, le quali presentano anche una spiegazione genetica:

1. Metabolizzatori lenti: dal punto di vista genetico sono omozigoti mutanti per un

gene implicato nella risposta al farmaco. Possono determinare una risposta tossica ai farmaci (ADR)

2. Metabolizzatori intermedi: dal punto di vista genetico sono eterozigoti mutanti

3. Metabolizzatori normali: dal punto di vista genetico sono wild-type

4. Metabolizzatori ultra-rapidi: dal punto di vista genetico sono omozigoti mutanti.

questi individui sono i responsabili delle risposte inefficaci dei farmaci o di risposte tossiche ai farmaci (ADR), ma in misura differente rispetto ai metabolizzatori lenti. Queste cause genetiche sono dovute alla presenza di polimorfismi nei tratti del genoma che presentano i geni che codificano per le proteine che fungono da:  Enzimi farmaco-metabolizzatori (con attività enzimatica aumentata o diminuita)  Recettori del farmaco  Proteine bersaglio del farmaco. Questi polimorfismi nel genoma possono colpire geni che prendono parte sia alla fase di farmacocinetica, che alla fase di farmacodinamica:

1. FARMACOCINETICA ( effetti farmacocinetici ): polimorfismi nei geni codificanti per le proteine coinvolte nella biodisponibilità del farmaco, che entrano in gioco nelle 4 fasi dell’ADME. Questi sono descritti dalla FARMACOGENETICA (1 gene)
2. FARMACODINAMICA ( effetti farmacodinamici ): polimorfismi a carico di geni codificanti per il bersaglio molecolare terapeutico del farmaco (= recettori) e/O di

pathway correlate ( recettori, canali ionici, enzimi, proteine regolatrici). Questi

sono descritti dalla FARMACOGENOMICA (molti geni) RIPASSO DEI CONCETTI DI BASE DELLA GENETICA: FENOTIPO = tratti – caratteristiche osservabili di una cellula o di un organismo, è quello che si vede (es. metabolizzatori rapidi, lenti….) GENOTIPO = composizione – costituzione allelica di un individuo riferita ad uno o più loci, che ne spiega il fenotipo. Come vengono ereditati i caratteri ereditari? con la meiosi: la meiosi ha lo scopo essenziale di costituire da una cellula diploide una cellula aploide ( gameti), i quali durante la fecondazione vengono uniti per ottenere una nuova cellula diploide chiamata zigote. Lo zigote darà origine ad un nuovo individuo, con numerose e successive divisioni mitotiche. Ogni individuo definito diploide (2n) presenta due copie di ogni cromosoma: una di origine materna (n) ed una di origine paterna(n). I geni esistono espressi in differenti versioni che sono definite alleli. I diversi alleli occupano il medesimo locus su cromosomi omologhi. Ogni individuo definito diploide presenta per ciascun gene due alleli, ovvero due copie: una di origine materna ed una di origine paterna. Gli alleli sono ereditati nel medesimo modo in cui si verifica la meiosi ( teoria cromosomica dell’ereditabilità 1905). MUTAZIONI e SNPs: Una mutazione è definibile come un evento casuale e stabile che produce un cambiamento del patrimonio genetico ed è quindi ereditabile (= viene trasmesso alla

della regione di controllo dell’espressione genica, il rimanente 10% è rappresentato da inserzioni, delezioni, ripetizioni in tandem e microsatelliti. I polimorfismi sono alla base della variabilità genica tra un individuo ed un altro e possono influenzare l’attività, l’espressione, la degradazione e le caratteristiche delle proteine interessate. Se la mutazione risulta essere vantaggiosa allora si può espandere all’interno della popolazione e si può parlare di genetica di popolazione. Quando la mutazione mi da un piccolo svantaggio, mi determina suscettibilità, ovvero questa mutazione mi predispone a poter avere questa malattia.

MUTAZIONI GENICHE:

le mutazioni geniche sono un evento raro e casuale. Il tasso di mutazione è specie-

specifico e non tutti i geni presentano lo stesso tasso di mutazione. (tasso di mutazione = probabilità che una mutazione si verifichi nel tempo). il tasso di mutazione umano prevede che:

• Maggiore tasso nella linea germinale maschile rispetto che in quella femminile
• DNA mitocondriale è stato stimato presenti un tasso di mutazione di 3-2.7 10^- per base per 20 anni di generazione (variabile in base al metodo di stima)
• Il tasso di mutazione del genoma umano è di 2.5 10^-8 per base per generazione
• Utilizzando dati disponibili dall’intero sequenziamento del genoma umato, il tasso di mutazione umano è stato stimato essere 1.1 ¿×{ 10 } { − 8 } per sito (ovvero per nt) di generazione
• Alcune sequenza di DNA sono più suscettibili alla mutazione
• Il tasso di mutazione varia anche di regione in regione nel genoma umano, ad esempio i microsatelliti hanno un tasso di mutazione più alto (ordine di (^) { 10 }{− 4 }) rispetto ad altre parti del genoma Il DNA mitocondriale presenta un tasso di mutazione maggiore (10 volte maggiore). SNP sono marcatori molto stabili, mutano con una frequenza di (^1) ¿ { 10 }{− 8 }. I microsatelliti sono marcatori poco stabili, in quanto presentano un tasso di mutazione più elevato. Le mutazioni geniche o puntiformi sono dovute in gran parte alla sostituzione di una singola base nucleotidica del DNA con un'altra. Altri tipi di mutazioni possono originare in seguito alla perdita (delezione) o all’inserzione di una o poche

basi dele filamento del DNA  mutazioni indel.

SNV single nucleotide variants:

La variazione del singolo nucleotide è la forma di variazione più comune del DNA, infatti si è visto che confrontando due cromosomi umani omologhi, si osserverà una SNV ogni mille

basi. Le SNV possono essere SNS ( single nucleotide substitution) o indel a singolo nt. Le

SNS sono 10 volte più frequenti delle inserzioni e delezioni (ins/del). Le transizioni sono 2 volte più frequenti delle trasversioni, in quanto si rimane all’interno delle pirimidine o purine che hanno strutture simili tra loro (C e T sono simili tra loro, così come A e G):

• Transizioni: cambiamento di una pirimidina con una pirimidina o di una purina con

un'altra purina

• Trasversioni: cambiamento di una pirimidina con una purina o viceversa. Il tasso di mutazione più elevato è stato osservato essere presente nelle regioni dove si trovano i dinucleotidi CpG; questo perché questi siti sono generalmente metilati e così è facile che per demetilazione la C diventa T. I polimorfismi di un singolo nt (SNS) sono di norma biallelico e sono stati definiti stabili dal punto di vista evolutivi. In passato si pensava che fossero solo biallelici perché avere due mutazioni nello stesso nucleotide nella linea germinale e che il gamete viene fecondato era ritenuto un evento estremamente improbabile. La realtà è invece che esistono SNPs con tre o quattro alleli, cioè SNPs che hanno A, G, T, C nella popolazione, ma comunque sono rari, infatti i più comuni sono biallelici. Gli SNPs sono stabili perché hanno un tasso di mutazione molto basso, quindi di fatto non cambiano GENOMA UMANO e STRUTTURA DEI GENI NELL’UOMO: Il genoma umano è il materiale genetico completo di un organismo, ovvero tutto il DNA contenuto nel nucleo di ogni cellula. Se analizziamo una popolazione, allora il 99.6% del genoma è uguale tra due diversi individui. Quello che noi dobbiamo verificare è se tra individui differenti lo 0.4% di diversità in cosa consiste per vedere se mi codifica per una reazione avversa ad un farmaco. Il genoma umano è costituito da circa 3.9 miliardi di paia di basi ( 3 milioni di bp) ed è organizzato in:  GENI: rappresentano 2% dell’intero genoma (circa 21.500 geni) e rappresentano la porzione del genoma che codifica per le proteine. I geni sono formati dalla regioni codificanti per le proteine (esoni) + regioni non codificanti (introni) che al termine dello splicing sono rimossi.  SEQUENZE CODIFICANTI che generano RNA funzionali, ma che non codificano per

proteine (es. rRNA, tRNA, miRNA…) ( microRNA sono stati studiati da poco, ma

sono fondamentali dal punto di vista funzionale in quanto regolano i geni che

codificano per le proteine).

 SEQUENZE NON CODIFICANTI: sono le sequenze che non vengono trascritte e possono essere presenti in copie singole o multiple. Questi lunghi tratti non codificanti sono vengono mai trascritti e rappresentano la % maggiore del

genoma umano (96% circa). Possono avere due diverse funzioni ( anche se ancora

ad oggi non sono del tutto conosciute):

1. funzione strutturale  regioni intrageniche. Si tratta di regioni che non sono trascritte e che non regolano la trascrizione.
2. funzione regolatrice della trascrizione  enhancer, silencer, promotori. Si tratta di regioni che non vengono trascritte, ma che hanno una funzione regolatori sulla trascrizione

Quando parlo di SNS parlo solamente dei primi punti (= sostituzioni di un nt).

Il codice genetico è degenerato. È formato da codoni, cioè triplette di 3 nucleotidi. Le sostituzioni in 3° base sono silenti (sinonime), perché non cambia l’amminoacido, a parte per la Met e il Trp che non sono degenerati. Le sostituzioni in 1° base generalmente cambiano l’amminoacido. Le sostituzioni in 2° base cambiano (quasi) sempre l’amminoacido (sono le più “cattive”). Quindi, le sostituzioni in 1° o 2° base portano a mutazioni missenso o non sinonime. Esempi di mutazione SS o sinonima: AAA (Lys)  AAG (Lys) oppure CUA (Leu)  UUA (Leu) Esempi di mutazione MS o non sinonima:

1. Sostituzione della prima base del codone: AAA (Lys)  CAA (Gin)
2. Sostituzione della seconda base del codone: AAA (Lys)  ACA (Thr)
3. Sostituzione della terza base del codone: AAA (Lys)  AAC (Asn)
4. Un esempio di mutazione missenso è la mutazione che dà l’anemia falciforme, in cui vi è una sostituzione da Glu a Val nella catena beta dell’emoglobina.

INSERZIONI/DELEZIONI DI POCHI NT  rientrano all’interno di SNV, ma non sono

SNP. Inserzioni/delezioni di pochi nucleotidi danno luogo a mutazioni frameshift, ovvero mutazioni in cui vi è lo scivolamento del quadro di lettura durante la traduzione. L’aggiunta di una o due basi fa cambiare completamente il quadro di lettura e di conseguenza il significato della proteina. Se vengono aggiunti 3 nucleotidi, vi è l’aggiunta di un codone, ma non cambiano gli altri codoni, cioè, non vi è lo scivolamento del quadro di lettura, quindi la proteina si presenta più o meno simile all’originale. Una mutazione frameshift avviene quando vi è l’inserzione/delezione di un numero di basi che non è multiplo di 3. Sia inserzioni che delezioni hanno le stesse conseguenze, cioè lo scivolamento della fase di lettura.

( Nell’uomo per evitare la formazione di proteine tronche che sono deleterie, si formano

dei complessi nelle giunzioni esoni-esoni. )

Una delle conseguenze delle mutazioni frameshift è che compaiono quasi inesorabilmente dei codoni di stop. Un esempio nell’uomo di delezione è la mutazione che ha dato origine all’allele che causa la fibrosi cistica. Si tratta di una delezione di 3 nucleotidi, che quindi non ha dato luogo allo scivolamento della fase di lettura, ma solo l’eliminazione di un codone. La proteina prodotta non è funzionale come nel caso wild- type e quindi si avrà la malattia. Sequenza nucleotidica wild-type: ATC ATC TTT GGT GTT Sequenza amminoacidica wild-type: Ile Ile Phe Gly Val Sequenza nucleotidica in F508del: ATC ATT GGT GTT Sequenza amminoacidica: Ile Ile Gly Val

EFFETTI DELLA MUTAZIONI:

1.Nel caso delle mutazioni non senso (producono codoni di stop prematuri) e mutazioni frameshift, si avrà un trascritto alterato, che non produrrà una proteina oppure produrrà un troncone di proteina, cioè una proteina tronca e non funzionale. In generale ci sarà un’assenza di proteina funzionale.

in figura è illustrata una delezione di un nt che a portato alla formazione di un codone di

stop prematuro, determinando la sintesi di una proteina tronca.

2.Nel caso di mutazioni missenso, cioè dove viene cambiato un aa del codone, si formerà un trascritto simile all’originale, ma la proteina che verrà tradotta sarà diversa da quella wild-type, e quindi la sua struttura e la sua funzione risulteranno essere alternate. Queste mutazioni portano alla sintesi di una proteina diversa da quella che normalmente verrebbe sintetizzata.

1. le mutazioni che avvengono sulle regioni regolatorie, sono mutazioni che riguardano i enhancer, silencer o nel promotore. Queste portano alla sintesi della stessa proteina, ma in quantità differenti. Per cui quello che si viene ad alternare è il grado di espressione della proteina stessa, mentre non viene mutata la proteina stessa.
2. le mutazioni possono anche avvenire nelle regioni intrageniche, ovvero sulle sequenza introniche , ed in questo caso non hanno nessun effetto sul fenotipo (gli introni non sono codificanti), a meno che non cadano in particolari sequenze localizzate ai confini tra esone ed introne.. In questo caso si hanno mutazioni di splicing, di conseguenza non si avrà uno splicing corretto. Gli introni sono importanti perché possiedono delle sequenze conservate che permettono di far avvenire lo splicing, tra queste c’è la sequenza GA (prima e seconda base dell’introne). Lo spliceosoma (il macchinario di splicing) riconosce le prime due basi e le ultime due basi dell’introne, ricordiamo però che è importante anche il punto di ramificazione, a circa metà dell’introne che aiuta nella formazione del loop.

studiava il “trios” ad una copertura elevata. E poi si sono concentrati a 1000

regioni geniche ad elevata copertura a? soggetti.

2. 1000 genome : questo progetto aveva come obbiettivo quello di sequenziare 1000 individui (ne furono sequenziati 2500) per ognuna delle 5 aree geografiche. Questo progetto iniziato nel 2001 fu terminato completamente solo nel 2023 tramite il “progetto TVT” che ha permesso di sequenziare anche le regioni più complicate come le regioni telomeriche – centromeriche - sequenze ripetute interne. Questi progetti hanno permesso di poter aggiornare i dati circa il genoma umano, che ad oggi sappiamo contenere 3.9 miliardi di bp con circa 25 mila geni codificanti per proteine. PROGETTO 1000 GENOMI (A thousand genomes): Il progetto 1000 genomi aveva come obbiettivo principale quello di sequenziare 1000 genomi, ma fu terminato con il sequenziamento di circa 2500 genomi, provenienti da 26 popolazioni mondiali. Questo progetto iniziato nel 2001, fornì i primi risultati nel 2010. Fino a 10 anni fa si credeva che gli SNPs fossero pochi, 1000, al massimo 1 milione; ad oggi si sa che ne esistono almeno 15 milioni. Ogni individuo ha nel proprio genoma tra i 4 milioni e i 5 milioni di SNPs che condivide in parte con altri individui. Di questi 4 milioni, circa 3 milioni sono costituiti da SNV (Single Nucleotide Variant) e mezzo milione di Indel. Ci sono un milione di piccole inserzioni e delezioni (di poche paia di basi). È stato visto che vi sono 20 mila varianti più ampie che non erano mai state osservate prima. Dal confronto tra i genomi dei genitori e figli si è potuto stabilire che ogni persona è portatrice di circa 60 mutazioni non presenti nei genitori (mutazioni ex-novo). Infatti, il tasso di mutazione è dell’ordine di 10-8 (per sito, per generazione), ma noi abbiamo un numero enorme di basi nucleotidiche nel nostro genoma. Tra le variazioni del DNA ci sono le varianti strutturali (> 50 bp) che comprendono inserzioni di elementi mobili, grandi delezioni e inversioni, MA le più importanti sono le CNV (copy number variation), cioè le varianti del numero di copie. Nel passato si pensava che grosse mutazioni del DNA fossero gravissime, invece non è proprio così, può capitare che ci siano grandi delezioni del genoma, ma che non ci siano conseguenze o poche.

progetto 1000 genoma. Il genoma di Craig Venter fu descritto per l’ultima volta nel 2007

( etnia caucasica)  aveva 3.2 milioni di SNP ( polimorfismi del singolo nucleotidi).

Presentava nel suo complesso più di 12 milioni di bp diverse dal riferimento.

Si è visto che ogni individui mediamente ha da 4 a 5 milioni di mutazioni pe individuo: di

cui SNV ( da 3.5 a 4 milioni) e indel (queste sono molto più rare da 500-600 varianti per

singolo individui). Per cui non è vero che ogniuno ha dalle 2000 a 2500 grosse variazioni

strutturali. Queste sono variazioni enormi del nostro genoma (1 mega base). La

maggioranza delle mutazioni sono di piccole dimensioni (95%), solo il 5% mi determina

cambiamenti più grossi. Questa piccola parte mi copre una quantità di mega-base molto

più amplia.

Per cui tutte queste varianti come è stato possibile studiarle e caratterizzarle? Tramite l’utilizzo delle Tecnologie genomiche , esistono diverse metodologie per analizzare e genotipizzare gli individui. Di tutti gli SNPs che sono stati individuati si sono aperte delle banche dati con l’obbiettivo di essere delle fonti di depositi di SNPs. Queste banche dati di SNP permettono di:

1. Identificare nuovi SNPs presenti nella popolazione
2. Raccogliere ed elaborare dati tramite bioinformatica
3. Creare delle banche dati di dominio pubblico
4. Hanno permesso la nascita della biologia in silicio per l’identificazione di polimorfismi in regioni codificanti mediate algoritmi al computer che allineano EST (Expressed Sequences Tag) da sequenze sovrapposte. IL GENOMA UMANO è RICCO DI SEQUENZE RIPETUTE: Gli esoni compongono una frazione molto piccola del genoma. Gran parte del genoma è composto da DNA ripetuto (stiamo parlando di DNA