librerie genomiche, Slide di Biologia Molecolare

Scarica librerie genomiche e più Slide in PDF di Biologia Molecolare solo su Docsity!

Costruzione di librerie

 Vettori

 Librerie genomiche

 Librerie a cDNA

 Librerie di geni artificiali a

sequenza random o semi-random

 Analisi e screening di librerie

2. Manipolazione in vitro 3. Inserimento in cellule batteriche

DNA genomico

Sequenze artificiali RNA

Sintesi cDNA

DNA a doppio filamento

1. Preparazione del **vettore

4. Selezione (esempio antibiotico)
5. Analisi dei ricombinanti**

Screening della libreria

Sintesi artificiale

Frammentazione

2. Manipolazione in vitro 3. Inserimento in cellule batteriche

DNA genomico Sequenze artificiali RNA

Frammentazione (^) Sintesi cDNA

DNA a doppio filamento

1. Preparazione del **vettore

4. Selezione (esempio antibiotico)
5. Analisi dei ricombinanti**

λ di sostituzione o cosmidi

Preparazione di librerie genomiche

Sintesi artificiale

Estrazione del DNA genomico

Svantaggi

• La digestione non è completamente casuale e la sequenza che interessa potrebbe essere localizzata in un frammento di DNA genomico troppo lungo o troppo corto per entrare nel vettore usato.

E E

E E

• Essendo tutti cloni indipendenti, non è possibile ricostruire per intero la sequenza del genoma (non c’è sovrapposizione tra i cloni)

2) Frammentazione meccanica (“mechanical shearing”) E’ una frammentazione veramente casuale, ma il DNA così ottenuto viene sottoposto a diversi passaggi prima del clonaggio, riducendo l’efficienza di clonazione (a volte insufficiente per ottenere librerie rappresentative dell’intero genoma). I frammenti vanno convertiti in DNA con estremità compatibili con il vettore, e questo richiede molti passaggi

1. Sonicazione 3. Appiattimento delle estremità 2. Purificazione dei frammenti della dimensione desiderata 35-45kb

4a. Ligazione di adaptor

4b.1. Metilazione (es. metilasi Eco RI)

4b.2. Ligazione di linker (es linker Eco RI) 4b.3.^ Restrizione (es. Eco RI)

Esempio:

Preparazione di una libreria genomica in cosmidi

Defosforilazione inserti 5’P 5’P

Bam HI Sau 3AI o MBo I

Esempio:

Preparazione di una libreria genomica in cosmidi

Defosforilazione inserti 5’P 5’P

Nel caso della costruzione di librerie genomiche la defosforilazione degli inserti impedisce di clonare due frammenti genomici nello stesso vettore. Se questo succedesse, si avrebbero delle mappature genomiche scorrette

Domanda : Quanti cloni devo produrre (e analizzare) per avere la certezza di isolare qualunque gene o frammento di DNA? Ovvero quale deve essere la complessità della mia libreria?

Dimensione del genoma 2.8 10^9 bp n = = = 1.4 10^5 Dimensione media dei frammenti 20 ˙000 bp

Poiché nel clonaggio si esegue una sorta di campionamento (alcuni frammenti si clonano più volte, mentre altri raramente), il numero N di cloni ricombinanti che è necessario produrre per avere la probabilità P di includere nella libreria ogni particolare sequenza, è data dalla formula: ln (1 - P) N = ln (1 – 1/n)

Es. Se P = 95%, allora per una libreria genomica umana con inserti da 20 kb si dovrà produrre:

Es. Se P = 99% :

ln (1-0.95) N = = 4.2 10^5 cloni ln (1 – 1/ 1.4 10^5 )

ln (1-0.99) N = = 6.5 10^5 cloni ln (1 – 1/ 1.4 10^5 )

n aumenta se si vogliono cloni sovrapposti

Per il DNA genomico umano (2.8 10^9 bp), se i frammenti (di dimensione media di 20kb) fossero indipendenti il numero n di cloni da produrre sarebbe:

Organism

Approximate DNA content of haploid genome (bp)

N for 20 kb inserts (λ vector)

N for 45 kb inserts (cosmid)

Escherichia coli 4,2 x 10^6 9,2 x 10^2 4,3 x 10^2 (bacterium) Saccharomyces cerevisiae 1,4 x 10^7 3,2 x 10^3 1,4 x 10^3 (yeast) Drosophila melanogaster 1,4 x 10^8 3,2 x 10^4 1,4 x 10^4 (fruit fly) Stronglyocentrotus purpuratus 8,6 x 10^8 2,0 x 10^5 8,8 x 10^4 (sea urchin) Homo sapiens 3,3 x 10^9 7,6 x 10^5 3,4 x 10^5 (man) Triricum aestivum 1,7 x 10^10 3,9 x 10^6 1,7 x 10^6 (hexaploid wheat)

The Number (N) of independent recombinant DNA molecules that must be recovered in either a Lambda Replacement Vector, or a Cosmid, in order to have a 99% probability of having cloned a particular DNA Sequence

A seconda della dimensione del genoma iniziale e del tipo di vettore utilizzato, le librerie genomiche hanno una complessità che va da centinaia a milioni di cloni

Una collana da 100 perle di colore differente. Quante perle N devo prelevare dal sacco per avere la probabilità P di ricostruire la collana?

Es. Se P = 95%,

Es. Se P = 99.99% :

ln (1 - 0.95) N = = 392 perle ln (1 – 1/ 100)

ln (1 - 0.9999) N = = 916 perle ln (1 – 1/ 100)

1. L’informazione contenuta in un mRNA (cDNA) rappresenta la parte trascritta del genoma, che, a seconda dell’organismo, può rappresentare anche soltanto l’1% del genoma (uomo). Il sequenziamento di una libreria a cDNA può aiutarci a comprendere come è organizzata la sequenza del DNA genomico di un organismo di interesse

Repetitive DNA 52%

Exons 1%

Introns 24%

Intergenic DNA 23%

Human genome

Perchè produrre una libreria a cDNA?

2. La funzione di un gene può essere più facilmente studiata se esso viene espresso in un organismo semplice come un batterio. Poiché il batterio non è in grado di fare splicing si preferisce utilizzare per l’espressione la sequenza codificante, privata degli introni (cioè il cDNA).

Preparazione di librerie a cDNA

ACACATCCGCACCGCATTTTCTTAAACGGCCGACAAGTGACGGGCATCAT TGCCCATTAAGGCAGGTTACAATCCGTGATGATGGGATAGTATATCACAT AACCGCTCTGGGAGGAAGAGGGGAAACATCGTGGTTCATGTCAAGTGTGT GTGTGTGTGTGGTGTGTGTTTGACTCGTCGATCGACACCTTACATGCTAA CTTCGACGTCGAGAGCCCGCACAGAGAGAGGGAAGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGAGAGGCACCGAGAAGGGAGGTATAAGGACCGGGC CGTCTGGCCCAGTTGAGAATAAAAGGAATCCTTCTCTTCTATGTGCCAGC ACTTCAGCAATCCACGGTTCTACCTGGTTCCTCATCTTCATCTACCATCA AGATGAAGTTCTTCTCTGCCCTCGCCCTCTCCTCTCTCCTGCCGACGGCC GCATGGGCCTGGACCGGCAGCGAAAGCGACAGTACCGGCGCCGACTCCCT CTTCCGCCGCGCCGAAACCATCCAGCAGACGACGGACCGATACCTTTTTA GGATCACGCTCCCGCAATTTACTGCCTATCGCAACGCCAGAAGCCCGGCG ACACTGGACTGGTCCTCAGACAGCTGCAGCTACTCGCCCGATAACCCGTT GGGATTCCCCTTTTCGCCTGCTTGCAATCGTCATGATTTCGGGTATCGCA ACTACAAGGCTCAGTCGAGGTTTACGGATAATAATAAGTTGAAGATTGAT GGAAACTTTAAGAGTGAGTATGTCCCTTTTTTTTTTTCTCTCTCTTTCTC TCTCTCTCTCTTTTCCTCCCTCGTTTTATTCCTCTTGTCTCATCCTTCCC CTTGCTTACCTACCTACCCTTCTCCCTTTTTACCCGTCAACGGTCTCCAT CTCTCTTCACATCCTCCTCCGTGAGTAGATTTGATAAAACAGATAGCTAA TCCAACCCTCAACCAACTACATAGTCTCTACTACCAGTGCGACACCCACG GCTACGGCTCCACCTGCCACGCTCTCGCCAACGTCTACTACGCCGCCGTC CGCGAATTTGGTCGCACCAAGGGCGAGCTCCAGGAGGAATACGATCTGCT GCTGGCTCACTACAACGAGCTCGTGGCCGAGGCTATTGCCAAGGGCGAGG ATCCGTTGTATTATTAGTTAATTCAACTGGAAAGGGTGACGAAAGGCCGC TCTCTATCCTCATTATAGACACAGACAACGCTCACCTACGGGTACACTTC ACACACGAGTTTCTCCCTACAAACTTTGTCTTACGTTCATTTTCTCATCA ATCCACAATGCTGTCCCGTTTCATGGGCCATGCCATTTTACATTGCACTT TTGGCTGGTAACAATGACTGGCGCTTGTCCGCAAACGATCAAGTTCCTCA CTTCATCCTCCCAGGGTCAAAGTCAGTCGGCGCTTTAATTTCGCCGCCGC TTCAATCCAAACACCTCCATTCAGAAGACACTCAAAGTGCTGATTAGATT GCAGCATATGTGTGGCTTGGTTTCAGAGCATCGCCATTGCTTGTACATAA CGACATGATCTTTCCACCGCCACTAGAGGCGGTTCTCTGATACTTGGTCT ACCGGCGTGGTATCTTGCAGTCCGCGAACAGAACTCGGCTTGATTTATCC ATCGTCAAGTATCCATCACCCGTCACCCGACCAACCCCACAGATATACCT ACCGCTTATGTTGTAACCGGCACAACTCAACAATTCTTCCGGCCTCCTCT CCTACCTTACCCACCAGTAACGGCTGGTCCTATCCCAGTCCAAGCAAGTT CCCAACGTCTTGGCTCTTGAATCACCGGGAATGTAACCCCATCTTGCTGA AAGAGGATCGACTGTGGATGCCAAGACGTGATGAAACCTACGTGCCTTGC ATGGATACTGTAGTAGTAACTAGTATCCGTTCGCAGTTTCTTTCTGTTCT

Sequenza di un frammento di DNA genomico

contenente il gene X

5’ UTR

3’ UTR

Esone 1

Esone 2

Introne

ACACATCCGCACCGCATTTTCTTAAACGGCCGACAAGTGACGGGCATCAT TGCCCATTAAGGCAGGTTACAATCCGTGATGATGGGATAGTATATCACAT AACCGCTCTGGGAGGAAGAGGGGAAACATCGTGGTTCATGTCAAGTGTGT GTGTGTGTGTGGTGTGTGTTTGACTCGTCGATCGACACCTTACATGCTAA CTTCGACGTCGAGAGCCCGCACAGAGAGAGGGAAGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGAGAGGCACCGAGAAGGGAGGTATAAGGACCGGGC CGTCTGGCCCAGTTGAGAATAAAAGGAATCCTTCTCTTCTATGTGCCAGC ACTTCAGCAATCCACGGTTCTACCTGGTTCCTCATCTTCATCTACCATCA AGATGAAGTTCTTCTCTGCCCTCGCCCTCTCCTCTCTCCTGCCGACGGCC GCATGGGCCTGGACCGGCAGCGAAAGCGACAGTACCGGCGCCGACTCCCT CTTCCGCCGCGCCGAAACCATCCAGCAGACGACGGACCGATACCTTTTTA GGATCACGCTCCCGCAATTTACTGCCTATCGCAACGCCAGAAGCCCGGCG ACACTGGACTGGTCCTCAGACAGCTGCAGCTACTCGCCCGATAACCCGTT GGGATTCCCCTTTTCGCCTGCTTGCAATCGTCATGATTTCGGGTATCGCA ACTACAAGGCTCAGTCGAGGTTTACGGATAATAATAAGTTGAAGATTGAT GGAAACTTTAAGAGTGAGTATGTCCCTTTTTTTTTTTCTCTCTCTTTCTC TCTCTCTCTCTTTTCCTCCCTCGTTTTATTCCTCTTGTCTCATCCTTCCC CTTGCTTACCTACCTACCCTTCTCCCTTTTTACCCGTCAACGGTCTCCAT CTCTCTTCACATCCTCCTCCGTGAGTAGATTTGATAAAACAGATAGCTAA TCCAACCCTCAACCAACTACATAGTCTCTACTACCAGTGCGACACCCACG GCTACGGCTCCACCTGCCACGCTCTCGCCAACGTCTACTACGCCGCCGTC CGCGAATTTGGTCGCACCAAGGGCGAGCTCCAGGAGGAATACGATCTGCT GCTGGCTCACTACAACGAGCTCGTGGCCGAGGCTATTGCCAAGGGCGAGG ATCCGTTGTATTATTAGTTAATTCAACTGGAAAGGGTGACGAAAGGCCGC TCTCTATCCTCATTATAGACACAGACAACGCTCACCTACGGGTACACTTC ACACACGAGTTTCTCCCTACAAACTTTGTCTTACGTTCATTTTCTCATCA ATCCACAATGCTGTCCCGTTTCATGGGCCATGCCATTTTACATTGCACTT TTGGCTGGTAACAATGACTGGCGCTTGTCCGCAAACGATCAAGTTCCTCA CTTCATCCTCCCAGGGTCAAAGTCAGTCGGCGCTTTAATTTCGCCGCCGC TTCAATCCAAACACCTCCATTCAGAAGACACTCAAAGTGCTGATTAGATT GCAGCATATGTGTGGCTTGGTTTCAGAGCATCGCCATTGCTTGTACATAA CGACATGATCTTTCCACCGCCACTAGAGGCGGTTCTCTGATACTTGGTCT ACCGGCGTGGTATCTTGCAGTCCGCGAACAGAACTCGGCTTGATTTATCC ATCGTCAAGTATCCATCACCCGTCACCCGACCAACCCCACAGATATACCT ACCGCTTATGTTGTAACCGGCACAACTCAACAATTCTTCCGGCCTCCTCT CCTACCTTACCCACCAGTAACGGCTGGTCCTATCCCAGTCCAAGCAAGTT CCCAACGTCTTGGCTCTTGAATCACCGGGAATGTAACCCCATCTTGCTGA AAGAGGATCGACTGTGGATGCCAAGACGTGATGAAACCTACGTGCCTTGC ATGGATACTGTAGTAGTAACTAGTATCCGTTCGCAGTTTCTTTCTGTTCT

Regione contenente il promotore

Regione contenente il terminatore (sito di poliadenilazione)

Solamente il cDNA ci può dare informazioni

sulla struttura del gene X

La sintesi del cDNA a doppio filamento avviene in due fasi:

1. Sintesi del primo filamento per retrotrascrizione La sintesi è semplice. Si utilizza la DNA polimerasi RNA dipendente (trascrittasi inversa) in presenza del templato di mRNA (o RNA totale), un primer che si appaia a tutte le molecole di mRNA e i dNTP.

Esistono due trascrittasi inverse che possono essere utilizzate:

• Avian reverse transcriptase ( AMV ): Temp. ottimale 42°C
• Murine reverse transcriptase ( MMLV ): Temp. ottimale 37 °C

2. Sintesi del secondo filamento La reazione viene eseguita con una DNA polimerasi DNA dipendente , ma risulta molto più complessa della prima sintesi perché non è facile trovare un primer comune appaiabile a tutto il cDNA a singolo filamento.

• L’mRNA non può essere clonato, occorre prima convertirlo in DNA a doppio filamento contenente la medesima sequenza (cDNA).

Il cDNA può quindi essere inserito in un vettore opportuno (plasmide o fago λ).

Preparazione del cDNA

• In un organismo pluricellulare in contenuto di mRNA può variare da cellula a cellula, da tessuto a tessuto.