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Professoressa Brun

 - Anno 2023/ 

• 0 - Introduzione Indice
• 1 - Batteriologia
  • BATTERI, STRUTTURA, ELEMENTI ACCESSORI
  • CRESCITA DEI BATTERI IN LABORATORIO
  • ANTIBIOTICI e ANTIBIOTICO RESISTENZA
  • 1.1 - Patogenesi delle infezioni microbiche............................................................................
  • GENETICA BATTERICA
  • MICROBIOTA
• 2 - Virologia
  • RIPRODUZIONE VIRALE
  • INFEZIONI VIRALI TRASMESSE DA ARTROPODI..............................................................
  • TERAPIA ANTIVIRALE
• 3 - Micologia
• 4 - Parassitologia
• 5 - Vaccini

MICROSCOPIO

Il microscopio è stato inventato da Antonie van Leeuwenhoek. Sovrapponendo delle lenti e ingrandendo fino a 200 volte, riuscì ad osservare la patina bianca che si forma sui nostri denti. Dopo di lui, gli altri due padri della microbiologia furono Pasteur e Robert Koch. Il primo inventò la pastorizzazione, per tenere sotto controllo il livello di microbi, per esempio negli alimenti; mentre il secondo fu il primo a introdurre il concetto di agente eziologico , come agente che può essere trasmesso da un individuo malato ad uno sano. Ad oggi vengono utilizzati quattro tipi principali di microscopio: ➢ Microscopio ottico: non esistono microrganismi visibili ad occhio nudo e con il microscopio ottico siamo in grado di individuare microbi dai 5 micrometri in su, grazie al contrasto di fase e alla luce diretta sul campione. Si può effettuare un’osservazione diretta dopo prelievo, oppure dopo aver fissato il campione; anche utilizzando coloranti, che permettono un’individuazione migliore, anche per aumento dell’ingombro sterico. E’ il più utilizzato nei laboratori di microbiologia e permette di osservare batteri, protozoi e miceti. ➢ Microscopio a fluorescenza: richiede che il campione sia trattato con sonde fluorescenti, le quali si legano ad una sostanza del microrganismo, il quale colpito da un raggio, risulta poi visibile. Si può usare anche per individuare un agente patogeno dentro le cellule. ➢ Microscopio confocale a scansione laser: uguale a quello a fluorescenza, ma ci permette di avere immagine 3D del campione stesso, grazie al segnale amplificato dal fotomoltiplicatore. ➢ Microscopio elettronico: ha una risoluzione tale da vedere una proteina dentro una cellula e in microbiologia viene utilizzato per osservare i virus (es. filovirus , responsabile della febbre gialla). Il contrasto è aumentato trattando il campione con ioni metallici e la luce ha una lunghezza d’onda molto superiore ai microscopi ottici. Si ottengono immagini in bianco e nero digitali, che possono essere successivamente colorate. E’ poco usato a scopo diagnostico. CLASSIFICAZIONE I microrganismi ad oggi vengono classificati secondo una classificazione filogenetica, mentre è stata abbandonata quella fenotipica. Si sequenzia l’RNA ribosomiale e si paragonano poi le sequenze nucleotidiche ottenute, con quelle già in nostro possesso, per costruire degli alberi ramificati che

rappresentano la distanza di divergenza da un antenato comune. Questo ha permesso di avere l ’albero filogenetico della vita , che classifica tutti gli esseri viventi. Si hanno 3 grandi rami: ● archea ● bacteria ● eukarya Tutta la vita ha preso origine da un ancestrale comune, molto probabilmente un virus, che si è originato da solo e il cui RNA è stato poi trasmesso e modificato. FUNZIONI I microrganismi principalmente:

1. causano malattia in uomo e animali
2. sono importanti bioreattori per la formulazioni di farmaci, molto economici
3. molti svolgono importanti funzioni benefiche per l’uomo (es. hummus) 1. Causa di malattia Ogni patologia infettiva è causata da un agente eziologico, fattore causale della patologia, che può essere anche trasmesso. Koch (1876) scoprì ciò dal Mycobacterium tubercolosis. In Italia anche Spallanzani contribuì alla scoperta di molti microbi e allo sviluppo della sterilizzazione. Koch scrisse 4 postulati (1850), per determinare se un microrganismo è infettivo. Infettò degli animali di laboratorio ed effettuò degli studi su di essi, concludendo che:
4. il presunto agente responsabile della malattia in esame deve essere presente in tutti i casi riscontrati di quella malattia ed essere assente in animali sani;
5. deve essere possibile isolare il microrganismo dall’ospite e farlo crescere in coltura pura;
6. ogni volta che una coltura pura viene inoculata in un ospite sano, si riproduce la malattia;
7. il microrganismo deve poter essere nuovamente isolato dall'ospite infettato sperimentalmente e se ne deve poter dimostrare l'identità con l’originale. Sono postulati ormai superati perché si è visto che non tutti i microrganismi infettivi danno malattia (es. herpes , può restare latente per anni) e inoltre non possiamo coltivare tutti i microrganismi responsabili di malattia, perché non sappiamo in che condizioni crescono e si replicano. Questo rappresenta un limite perché ci impedisce di studiarli e conoscere gli interventi terapeutici da effettuare per combatterli. Koch scoprì i microbi della lebbra (Mycobacterium leprae ), del carbonchio ( Bacillus anthracis ), derivata da pelli di animali non trattate e della trichinellosi ( Trichinella spiralis ), da carni non cotte. Lo

occupa dei componenti alimentari con effetto nutritivo o fisiologico, che hanno un ruolo importante nel mantenimento in salute dell’organismo e nella riduzione dei fattori di rischio di patologie croniche.

1 - Batteriologia

BATTERI, STRUTTURA, ELEMENTI ACCESSORI

I batteri sono organismi procarioti ( pro = primitivo, karyon = nucleo) e unicellulari, tranne alcune eccezioni. Hanno dimensione di 0,2 - 10 micrometri e morfologia variabile, determinata dagli acidi nucleici (cocco, bacillo, spirillio). Per esempio, nel liquor il diplococco indica la presenza di meningite

batterica; lo stafilococco si trova in gruppi; lo streptococco in catene e così via. Molti batteri sono mobili e hanno ampia varietà di vie metaboliche. I batteri hanno una struttura molto semplice, quasi priva di organelli. Il DNA è circolare, aploide, a doppio filamento e prende il nome di nucleoide. Presenta degli istoni, che consentono di avere il DNA tutto concentrato in un punto. Ci possono essere anche i plasmidi , molecole circolari autoreplicanti, che forniscono informazioni aggiuntive non contenute nel genoma, come per esempio la resistenza antibiotica. Sono presenti ribosomi per produrre proteine, con coefficiente di sedimentazione 70s (30s e 50s). MEMBRANA CITOPLASMATICA La membrana citoplasmatica è a doppio strato, ma senza steroli e glicoproteine. Ha funzione:

• ritenzione del contenuto cellulare: trattiene l’acqua contenuta nel citoplasma, permettendo alla cellula di vivere anche su una superficie inanimata dove l’acqua non è presente.
• regola la permeabilità e l'escrezione cellulare: elimina e porta all’esterno le sostanze di scarto, ad esempio gli esoenzimi , enzimi importanti dal punto di vista industriale, perché sono dotati di capacità enzimatica. Vengono utilizzati nei processi di fermentazione, nel riciclo della carta, come sbiancanti dei tessuti e dello zucchero.
• trasduzione dei segnali ambientali: ha una funzione regolatoria perchè passano messaggi, come la presenza nell’ambiente di sostanze nutritive o tossiche; essendo una cellula semplice non ha meccanismi complessi di segnale intracellulare. Ad esempio se è presente zucchero lo assimila finché la concentrazione di zucchero è abbastanza elevata e poi si sposta, o al contrario se percepisce alta concentrazione di tossina abbandona il luogo in cui si trova.
• biosintesi: è una struttura attiva perché passano componenti attraverso essa prodotti a livello del citoplasma, e alcuni vengono portati all’esterno per accrescere la parete batterica.
• è sede degli enzimi della catena respiratoria per la produzione di ATP. Tutte le sostanze passano attraverso dei sistemi di trasporto. Si ha: ● Trasporto semplice: attivo o passivo, secondo gradiente ● Traslocazione di gruppo: modifica chimica del nutriente (es. fosforilazione di un nutriente prima di essere introdotto) che, essendo meno concentrato all’interno della cellula, entra secondo gradiente; ha bisogno di ATP come le cellule eucariotiche per trasportare molecole contro gradiente di concentrazione ● Sistema ABC: trasporto con proteine di membrana, con energia fornita dall’ATP Lo scopo della cellula è quello di ingrandirsi e replicarsi: per farlo necessita di energia, che viene prodotta tramite la fosforilazione ossidativa, la quale genera un gradiente ionico transmembrana. A livello della faccia interna della membrana ci sono gli stessi enzimi che si trovano nei mitocondri della cellula eucariotica, per questo si dice che i mitocondri siano dei piccoli batteri ( teoria dell’endosimbiosi : piccoli batteri che in un momento ancestrale si sono incistati in una cellula più grande e si sono stabiliti all’interno, donando energia alla cellula). Differenza tra cellule eucariotiche e procariotiche EUCARIOTI PROCARIOTI Dimensioni più di 5 micrometri da 0.5 a 3 micrometri Strutture nucleari membrana nucleare no membrana nucleare

Essa è responsabile del risultato della colorazione di Gram : protocollo di colorazione delle cellule procariotiche che permette di distinguere i batteri in Gram Positivi (risponde positivamente, viola, forma di cocchi) e Gram Negativi (risponde negativamente, rosa, forma di bacilli). Il risultato dipende dalla struttura delle pareti batteriche. Risale alla fine dell’800 ma è ancora oggi la tecnica più usata per identificare una specie microbica. Il campione microbiologico viene messo su un vetrino e si aggiungono dei coloranti:

1. Si aggiunge il cristal violetto che è un colorante generico. Lo si lascia incubare per 5 minuti circa e si butta via;
2. Si aggiunge iodina (mordenzante) che consente al cristal violetto di fissarsi nelle cellule;
3. si aggiunge etanolo che porta via la colorazione, perchè è lipofilico; alcune cellule vengono quindi decolorate;
4. infine si aggiunge safranina per poter visionare le cellule non colorate (traslucide) al microscopio, colorandole di rosa. Si conclude quindi che la struttura della parete cellulare è diversa nei due casi, messa in evidenza dalla microscopia elettronica. Questo è il principale metodo di distinzione dei batteri. Parete cellulare Gram+ Parete caratterizzata da membrana citoplasmatica e sopra uno strato di peptidoglicani. Nella colorazione di Gram il cristal violetto penetra nella struttura dei peptidoglicani perchè è di base acquosa, l’etanolo, lipofilico, toglie acqua, facendo collassare la struttura di peptidoglicano e il cristal violetto rimane intrappolato. Il peptidoglicano rappresenta il 90% della parete dei gram+. E’ attraversato da acidi teicoici (glicerolo e ribitolo) e lipoteicoici (prendono contatto con la membrana citoplasmatica), che attraversano in altezza la parete. Hanno delle cariche ioniche alle loro estremità, infatti stanno bene in ambienti ricchi di acqua, e riescono a sopravvivere senza difficoltà. Sono il sito di ancoraggio dei batteriofagi. Parete cellulare Gram- In ordine: membrana citoplasmatica, peptidoglicano presente in uno strato più sottile rispetto ai Gram+ e sopra un'altra struttura di fosfolipidi (membrana esterna, la parte interna si chiama periplasma). Nel metodo di Gram il cristal violetto fa fatica a passare attraverso la membrana esterna, ma applicando l’etanolo lo strato di membrana più esterna si dissolve, ed il peptidoglicano essendo presente in bassa quantità non riesce a trattenere il colorante e quindi l’etanolo se lo porta via. Si mette la safranina per metterli in luce. E’ più irregolare rispetto a quella dei Gram+; la membrana esterna è asimmetrica, ha tanti canali, pori, enzimi. Nella faccia esterna della membrana esterna è presente un lipopolisaccaride (LPS) : una struttura che si innesca esternamente alla membrana esterna. Assente nei Gram+, è caratterizzante per questi batteri. Il lipopolisaccaride dal punto di vista chimico ha una struttura complessa e caratteristica per ogni specie di Gram-. Sia Escherichia coli che Salmonella typhimurium sono Gram- ma hanno LPS diversi. Struttura LPS: polimero di zuccheri e lipidi.

• LIPIDE A: porzione lipidica, con gli acidi grassi a lunga catena (fino a 18C) che si innestano nella membrana esterna. Serve ai batteri per dare malattia all’ospite. Se si rimuove tutta la porzione superiore e si mantiene solo la porzione di lipide A e si mette all’interno di una coltura batterica, questo sarebbe capace di stimolare la produzione di citochine infiammatorie. Per questa sua attività patogena viene anche definito endotossina : finchè è presente a livello della cavità respiratoria o digerente non provoca problemi, bensì li causa quando raggiunge il circolo sanguigno, perché il

sistema immunitario non riesce più a controllarlo: setticemia (shock settico) e sepsi sono termini per definire il lipide A in circolo. E’ conservata in tutte le specie di Gram-;

• CORE: parte centrale, struttura zuccherina dove è presente un chetodeossiottonato (KDO), ovvero uno zucchero presente solo nei batteri: molto utili al gram negativo nei momenti di stress nutrizionale perché il KDO può essere facilmente fosforilato per produrre l’ATP. E’ conservata in tutte le specie di gram-;
  • ANTIGENE O: porzione più esterna che definisce la variabilità e la divisione in classi. E’ formata da 4 zuccheri in sequenze ripetute (fino a 30 volte). Antigene stimola i linfociti dell’ospite per produrre gli anticorpi, ovvero le strutture che tengono memoria delle infezioni precedenti. Ha una struttura molto variabile quindi possono esistere centinaia di sottotipi diversi (ad es. Escherichia Coli ) e quindi è difficile difendersi. E’ anche un determinante antigenico per capire qual è la struttura base del batterio in questione. E’ importante dal punto di vista epidemiologico tracciare l’infezione del batterio nei luoghi geografici allo scopo di attuare protocolli di igiene ambientale per evitare che altri microrganismi possano arrivare a diffondersi come questo. Enterobacteriaceae è presente nel nostro intestino ma non subiamo risposta infiammatoria ogni giorno perché si sono insediati a livello del tratto gastrointestinale alla nascita e quindi il sistema immunitario si è abituato all’incontro con questo antigene O, riconoscendolo come non patogeno. Stessa cosa con i ceppi di Escherichia coli che sono endemici in alcuni paesi in cui gli abitanti sono abituati a quel ceppo batterico perché il loro sistema immunitario non si attiva in risposta a quel determinato antigene. Il peptidoglicano dei Gram+ funziona allo stesso modo degli LPS, ma non tutti provocano una risposta immunitaria. Eccezione: batteri privi di parete
• MICOPLASMI : genere mollicutes , sono strutture cellulari duttili, possono subire alterazione della loro morfologia da pressioni osmotiche esterne. Non hanno peptidoglicano. Il loro strato più esterno è costituito da membrana citoplasmatica a 3 strati. La mancanza di rigidità e il facile adattamento agli stress ambientali che trovano consente di riuscire facilmente a passare da un tessuto all’altro (nello spazio extracellulare, costituito da collagene e fibronectina) o insinuarsi all’interno di cellule eucariotiche, persistendo nel citoplasma per molto tempo e replicandosi. Sono responsabili di infezioni alle mucose respiratorie ( m. pneumoniae), del tratto genitale ( m. hominis ), commensali ( m. salivarium, m. orale ). La loro problematica maggiore è che non avendo parete, molti antibiotici non sono attivi contro di essi. Inoltre stando nel citoplasma sono protetti perché gli antibiotici stanno all’esterno della cellula per evitare tossicità. Così si possono replicare in maniera incontrollata, non espongono l'antigene e non vengono riconosciuti dal sistema immunitario.
• MICOBATTERI : genere mycobacterium. M. tuberculosis causa tubercolosi. Oggi si parla di complesso MTC (più batteri: africanum, canettii, microti, bovis ). Viene trasmesso per via respiratoria, tra comunità molto strette, si insinua nei macrofagi del tratto respiratorio e rimane silente per anni. M. leprae causa la lebbra: si trasmette tra i roditori, quindi è frequente quando le comunità vivono a stretto contatto con i topi, non viene trasmesso da uomo a uomo. Si localizza a livello della cute, erodendo le cellule, alterando la conformazione del tessuto (le estremità, naso, mento, sono quelle maggiormente colpite), andando incontro a necrosi tissutale. Hanno una parete estremamente complessa, costituita da molecole di acidi grassi a lunga catena (80C), andando a costruire attorno alla membrana plasmatica una struttura cerosa, andando a formare uno strato idrofobico che conferisce resistenza agli agenti ambientali (ad es MTC resiste

superfici (il substrato può essere il tessuto, la superficie di un tavolo o l’epitelio di un organismo vivente). Questa funzione risulta fondamentale dal punto di vista pratico se si prende in considerazione, ad esempio, l’entrata di un batterio nel tratto respiratorio: quest’ultimo è caratterizzato da movimenti (ex: tosse, starnuto…) che tendono ad eliminare i batteri, i quali, se provvisti di fimbrie, possono rimanere adesi all’epitelio del tratto respiratorio in modo stabile. La capacità di adesione di un batterio è fondamentale alla sua sopravvivenza poiché una cellula batterica può assimilare nutrienti solo se è adesa (nutrendosi, poi, può andare incontro alla replicazione e cominciare il processo patologico). Le fimbrie permettono il contatto anche tra un batterio e l’altro; questo fa sì che i batteri rimangano aggregati gli uni con gli altri dando forza alla colonia (ammasso di cellule) e portando alla formazione delle placche, denominate anche BIOFILM BATTERICI (importanti nel processo patologico). ● pili: sono strutture di lunghezza intermedia tra i flagelli e le fimbrie; sono presenti in numero limitato a livello della superficie batterica. Emergono dalla cellula batterica e mediano l’adesione batterica alle superfici proprio come le fimbrie. Presentano anche un’altra funzione, cioè sono implicati nel processo della coniugazione (processo che permette la condivisione o la donazione delle informazioni genetiche da una cellula batterica all’altra). Infatti il legame che il pilo costruisce con un altro batterio consente la trasmissione di informazioni genetiche sotto forma di piccole molecole di DNA dette plasmidi (molecole di DNA extracromosomiale, aggiuntive rispetto al genoma della cellula batterica). I plasmidi permettono al batterio di esprimere delle proteine in più e quindi conferiscono nuove proprietà. Tra le informazioni presenti nel plasmide vi sono quelle per la costruzione del pilo stesso, ma anche informazioni per la sintesi di nuovi enzimi, come quelli che consentono di metabolizzare il fruttosio al posto del glucosio (ciò consente alla cellula di crescere in un ambiente in cui vi è un dato nutrimento rispetto ad un altro). Inoltre, i plasmidi ed i pili riescono a mediare il fenomeno dell’antibiotico-resistenza: nei plasmidi ci possono essere dei geni codificanti enzimi capaci di degradare alcune molecole nell’antibiotico rendendolo inefficace (queste informazioni riguardanti la distruzione della molecola dell'antibiotico, può essere trasmessa da una cellula all’altra tramite coniugazione per via dei pili). La coniugazione può avvenire anche tra specie microbiche diverse (ex: E.coli aggancia la salmonella che percepisce delle informazioni derivanti da E.coli e diventa capace di disseminare nuovi fenotipi e nuove capacità metaboliche). Un’altra struttura accessoria delle cellule batteriche è la capsula (glicocalice o strato mucoso), non è però un'appendice come i flagelli, i pili e le fimbrie. La cellula batterica può vivere anche in assenza di una capsula, ma può decidere di costruirla per far fronte ad ambienti caratterizzati da fattori stressogeni. La capsula è uno strato protettivo che circonda l’intera cellula ed è costituito da molecole idrofile (per lo più da zuccheri e proteine che vengono riversate al di fuori della parete) che trattengono acqua. Questo ulteriore rivestimento cellulare ha una consistenza gelatinosa che gli consente di aderire facilmente alle superfici. Infatti, una delle funzioni principali della capsula è la sua capacità di adesione ai tessuti (da essa possono emergere fimbrie, flagelli e pili). La capsula è anche una riserva di acqua essenziale per i batteri quando si trovano in ambienti poveri di acqua (ex: batteri che devono sopravvivere su superfici secche e aride come la superficie di un tavolo o lo strato corneo che, essendo privo di acqua, è di fatto colonizzato da molti batteri capaci di sintetizzare la capsula, garantendo così la sopravvivenza del batterio). Un altro fattore antigenico espresso nelle cellule batteriche è il fattore antigenico K che è legato alla capsula ed è determinato dalla sequenza di proteine e di zuccheri. (N.B: E.coli è dunque caratterizzato da un antigene O del lipopolisaccaride , un antigene H del flagello e un antigene K della capsula). La capsula ha anche funzione di mascherare gli antigeni del lipopolisaccaride e la struttura del peptidoglicano; la capsula riveste la parete cellulare, perciò tutto ciò che è associato alla parete stessa (ex: lipopolisaccaride e peptidoglicano) è nascosto alla capsula: questo significa che se

arrivasse una cellula batterica provvista di capsula (ex: batterio che produce il mal di gola), la capsula stessa nasconderebbe il lipopolisaccaride, attivando il sistema immunitario grazie all’antigene K. Il sistema immunitario, riconoscendo l’antigene K della capsula, scatena contro di esso una risposta; la risposta immunitaria, però, disgrega la capsula ed espone il lipopolisaccaride: tale processo fa sì che il mal di gola duri fino ad una settimana poiché è necessario del tempo affinché il nostro sistema immunitario riconosca tutti gli antigeni superficiali e debelli la cellula batterica responsabile di questa irritazione alla gola. Un’ulteriore funzione della capsula, è quella di “giocare” con i macrofagi (cellule del sistema immunitario responsabili della fagocitosi). I macrofagi sono le prime cellule chiamate ad agire in presenza di una cellula batterica; questi, infatti, scagliano addosso alla cellula batterica una serie di anticorpi che si legano alla superficie del batterio. La cellula batterica rivestita di anticorpi è definita cellula batterica opsonizzata (l’opsonizzazione è un processo del sistema immunitario che consente di legare una serie di anticorpi sulla superficie di una cellula batterica). Avere una cellula opsonizzata facilita la fagocitosi, che quindi comporta una guarigione più veloce. La presenza della capsula invece, sfavorisce l’opsonizzazione, rallentando il processo di fagocitosi poiché impedisce che gli anticorpi prendano contatto con la cellula batterica. Un’altra struttura della cellula batterica è la spora batterica (o endospora). Questa però non è una struttura accessoria che la cellula batterica produce, ma piuttosto è un modo che il batterio presenta per resistere a determinati fattori esterni (dunque una modalità di sopravvivenza). La spora batterica è una forma di differenziamento della cellula batterica che viene attivata in condizioni di stress (ex: la carenza di nutrienti); il vantaggio che la spora batterica conferisce al batterio è l’elevata resistenza nei confronti di numerosissimi processi ambientali (ex: ai raggi UV, a temperature estreme, a tutti i disinfettanti chimici che potrebbero essere utili per controllare un’infezione batterica). La capacità di resistenza estrema dell’endospora è dovuta al fatto che essa è la forma metabolicamente inerte della cellula batterica; la spora quindi non necessita di nutrienti perché ha un metabolismo azzerato; non ha bisogno di acqua grazie alla sua struttura carente di acqua; non risente degli sbalzi di temperatura poiché non presenta enzimi metabolici attivi e può essere immersa nell’etanolo senza che si verifichi alcun tipo di danno perché non ha una forma vegetativa metabolicamente attiva. Sporulazione È un processo che porta alla formazione di spore a partire da cellule vegetative. Le cellule batteriche che si trovano nel loro ciclo vegetativo, sono capaci di accrescere, dividersi e originare cellule batteriche figlie. Se ad un certo punto una cellula batterica percepisce che nell'ambiente in cui si trova vi è un determinato fattore che le impedisce di portare avanti il suo ciclo replicativo (ex: a causa della mancanza di nutrienti specifici), la cellula inizia ad entrare nel ciclo di sporulazione per produrre la spora. Tale processo è molto impegnativo per la cellula batterica, perché impiega circa 8-10 ore (tendenzialmente la vita di una cellula dura 24 ore, dunque la sporulazione consuma una grandissima quantità di ATP) e coinvolge circa 200 geni. È un processo che passa attraverso stadi successivi: all’inizio si ha la formazione di un setto di divisione su un poro della cellula batterica, che porta alla formazione della prespora ; a questo punto la cellula vegetativa che l’ha ospitata va incontro a degradazione e la spora può essere liberata nell'ambiente dove perdura per un numero indefinito di anni. Nella struttura della spora possiamo riconoscere: ● Il core : rappresenta la parte centrale della spora e contiene tutto ciò che ne era della cellula vegetativa (ritroviamo frammenti di membrana e di parete cellulare, residui citoplasmatici come i granuli di deposito di nutrienti). Nel core della spora, inoltre, è presente l’acido nucleico della cellula vegetativa. Il materiale genetico contenuto all’interno del core è complessato da SASP (small acidic spore proteins) ovvero proteine che si intercalano nel DNA del genoma della cellula batterica, consentendo al DNA di rimanere condensato su se stesso: tale forma condensata è difficile da penetrare, ragione per cui i raggi UV che colpiscono la spora non sono capaci di danneggiare la componente nucleotidica, poiché è protetta da queste proteine. Nel core è presente anche una

• bacillus anthracis : è presente sotto forma di spore nelle pelli di animale. Quando gli uomini utilizzavano tali pelli (non conciate) come indumenti, venivano inalate delle spore di bacillus anthracis che raggiungevano il tessuto polmonare. L’ambiente di tale tessuto era riconosciuto come ottimale per la germinazione e dunque veniva causato il carbonchio (una forma di polmonite).
• bacillus subtilis : agente eziologico delle infezioni alimentari
• bacillus cereus: agente eziologico delle tossinfezioni alimentari
• clostridium tetani : agente eziologico del tetano
• clostridium botulinum : agente eziologico del botulismo
• clostridium perfringens : agente eziologico della gangrena gassosa
• clostridium difficile: agente eziologico della colite pseudomembranosa. È uno dei contaminanti microbici più diffusi poiché è facilmente ingeribile a causa del continuo contatto con il suolo. Le sue spore si posizionano nell'intestino, dove però non vanno incontro a germinazione, grazie alla regolazione mediata dal nostro microbiota intestinale. Il clostridium difficile è facilmente eliminabile con le feci. Vi è un problema quando il soggetto deve assumere antibiotici per tempi prolungati (ex: nel caso della polmonite o di infezioni a livello cutaneo); assumere un antibiotico per via parenterale o orale continuamente, andrebbe a decimare il nostro microbiota intestinale. A questo punto verrebbero liberati la maggior parte dei nutrienti che diventerebbero disponibili per le spore di clostridium difficile, le quali andrebbero in contro a germinazione producendo cellule vegetative responsabili della produzione di una tossina che induce una colite definita pseudomembranosa. Questo è un processo infiammatorio grave a livello della mucosa colica, che richiederebbe la somministrazione di altri antibiotici, ma questi non farebbero altro che produrre una nuova germinazione di spore di clostridium difficile (i pazienti che vanno incontro a infezioni da clostridium difficile, difficilmente eradicano la malattia).

TASSONOMIA BATTERICA Permette la distinzione dei microrganismi in categorie in base a somiglianze e correlazioni con lo scopo di:

• facilitare l’identificazione di un microrganismo
• attribuire la giusta nomenclatura seguendo le regole presenti nel manuale di Bergey
• classificarli per caratteristiche morfologiche, biochimiche o importanza medica I caratteri che permettono di identificare un determinato microrganismo sono:
• morfologia: appendici, colorazioni (la divisione dei gram in positivi e negativi)
• funzioni biochimiche
• presenza di antigeni (O, H, K)
• sequenze geniche (rRNA 16S) È possibile determinare un ordine gerarchico in classi successive, che si basa secondo la quantità di caratteri in comune tra microrganismi (scaletta in ordine crescenti di caratteri in comune): Dominio Bacteria Bacteria Phylum Proteobacteria Firmicutes Classe Gammaproteobacteria Bacilli Ordine Enterobacteriales Bacillales Famiglia Enterobacteriaceae Staphylococcaceae Genere Escherichia Staphylococcus Specie coli aureus

Sierotipo E.coli S.aureus

CRESCITA DEI BATTERI IN LABORATORIO

La replicazione delle cellule batteriche passa attraverso un processo denominato scissione batterica, in cui una cellula batterica aumenta le proprie dimensioni, duplica il proprio contenuto citoplasmatico e per finire si divide in due cellule figlie. Dunque, la cellula madre originaria cessa di esistere, ma si originano due cellule figlie che sono verosimilmente identiche (verosimilmente perché esiste la possibilità per le cellule batteriche di incamerare delle mutazioni a livello del genoma e dare origine a fenotipi diversi). I batteri quindi, si riproducono mediante scissione binaria che avviene tramite una serie di step successivi (l’insieme di questi processi è definito GENERAZIONE):

• replicazione del DNA
• allungamento della cellula
• formazione del setto di divisione cellulare
• completamento del setto con divisione cellulare
• separazione delle due cellule figlie Il processo di scissione è estremamente veloce per le specie microbiche, poiché il fine di un batterio è la replicazione. Viene replicato tutto ciò che è presente nel citoplasma (dai ribosomi all’informazione genetica); quando è avvenuta la replicazione del genoma, si forma un setto di divisione a livello della parte centrale della cellula batterica. Tale setto permette all’informazione genetica di migrare ai due poli delle due cellule batteriche; alla fine le due cellule batteriche scindono dando origine a due cellule figlie. L’intervallo di tempo all’interno del quale abbiamo una replicazione di cellule batteriche, è definito tempo di generazione. Tale tempo è tipico per ogni specie microbica (ex. E.coli si replica ogni 20 min → si crea un andamento esponenziale poiché ogni cellula figlia originata va in contro a crescita susseguita dalla replicazione. Questo porta alla formazione di un numero elevato di cellule batteriche. Può accadere, però, che una delle due cellule figlie non sopravviva e quindi il numero di cellule batteriche sia inferiore a quello ipotizzato). In laboratorio, il tempo di generazione è fondamentale perché permette di calcolare la velocità di crescita, che deriva dal rapporto dal numero di generazione (ovvero il numero di replicazioni che una popolazione batterica presenta) in un’unità di tempo. K = n/t È essenziale conoscere la velocità di crescita di una specie batterica perché è un parametro usato per valutare l’efficacia di qualsiasi antibiotico o disinfettante (sappiamo che l’amuchina è più attiva contro i gram negativi rispetto ai gram positivi, perché conosciamo la riduzione della velocità di crescita → se disponiamo delle cellule di gram negativi in presenza di amuchina, notiamo che queste rallentano la velocità di crescita molto di più rispetto a quanto farebbero in presenza di gram positivi; per i gram negativi, l’amuchina ha una velocità di all’incirca di 30 secondi). Avere a disposizione delle colture batteriche è essenziale per comprendere l’efficacia dei disinfettanti e per fare ciò è obbligatorio allestire una coltura microbica. Per allestirla si prende un brodo di coltura, ovvero una miscela in cui in soluzione sono presenti tutti i nutrienti necessari per permettere ad una cellula batterica di crescere; a questo punto si prende l’inoculo originario (ovvero la sospensione contenente solo una data specie microbica) e si deposita una piccola quantità sul terreno di coltura.

piccola percentuale di cellule batteriche rimanenti può sopravvivere se re-inoculata in terreno fresco, ricominciando così il ciclo (è un metodo troppo lento e svantaggioso per le grandi industrie; tant'è che viene introdotto un metodo più efficace che si avvale del chemostato) Crescita in sistema continuo Il chemostato è un contenitore molto controllato in cui si può avere la crescita dei microrganismi (possono essere nella scala industriale di 5 L o anche 500 L). Nel chemostato si riesce a mantenere la crescita di cellule batteriche perché si ha la possibilità di introdurre terreno fresco, di eliminare la quantità di terreno esausto che risulterebbe sfavorevole alla crescita o anche di immettere del gas se la coltura microbica lo richiede. Tali variazioni che imponiamo portano avanti la coltura in modo esponenziale e continuo. NUTRIENTI DEI BATTERI Per consentire la crescita batterica è essenziale disporre di:

• MACRONUTRIENTI: riconosciamo principalmente l’idrogeno, l’ossigeno, il carbonio , l’ azoto , il fosforo e lo zolfo (C ed N prevalgono)
• MICRONUTRIENTI: rappresentano gli elementi che fungono da cofattori enzimatici necessari per permettere il funzionamento degli enzimi e il metabolismo dei batteri stessi (ex: manganese, zinco, cobalto, rame…ecc) Tra i nutrienti principali per i batteri troviamo l’ ossigeno , componente fondamentale per il chemostato, il quale insuffla delle particelle di ossigeno nella coltura per mantenere l’ossigenazione e il pH della soluzione. Ha anche un’attività fondamentale nel controllo della crescita batterica, infatti i batteri si distinguono in: ➔ Batteri aerobi: necessitano di ossigeno per crescere, accettore finale della catena respiratoria. ➔ Batteri anaerobi: muoiono in presenza di ossigeno, sfuggono dalla sua presenza. ➔ Anaerobi facoltativi o aerotolleranti: crescono sia in presenza, sia in assenza di ossigeno. Hanno varie catene di produzione dell’ATP, che possono utilizzare o meno l’ossigeno come accettore finale. ➔ Microaerobi: tollerano l’ossigeno ma a pressione più bassa rispetto a quella atmosferica. L’ossigeno è un fattore per il riconoscimento e l’identificazione dei batteri. Incubando una coltura batterica per 16/24 ore, possiamo osservare la formazione di varie colonie, in base alla loro tolleranza all’ossigeno. I batteri che tollerano/richiedono ossigeno sono quelli che hanno un corredo enzimatico utile a detossificare i radicali liberi dell’ossigeno. L'ossigeno che passa la membrana cellulare o che viene processato dalla catena respiratoria, produce dei radicali, come l'ossidrile e l’anione superossido. Il corredo enzimatico dei batteri è esposto ai radicali liberi nel citoplasma, non essendoci membrane, e questi potrebbero creare mutazioni al DNA, incompatibili con la sopravvivenza del batterio. Tra gli

enzimi che detossificano i radicali c'è la superossido dismutasi, la catalasi, la perossidasi e la superossido reduttasi, i quali impediscono il protrarsi del danno ossidativo. I batteri anaerobi sono quelli che causano principalmente infezioni nell’uomo, perché nel nostro corpo abbiamo molte nicchie biologiche in cui l’ossigeno è quasi del tutto assente (es. ceco, colon, ferita cutanea che si rimargina). Di conseguenza è importante far crescere in coltura i batteri anaerobi potenzialmente patogeni (microbiologia clinica) oppure per produrre sostanze di interesse farmacologico. Esistono dei metodi per far crescere i batteri anaerobi in soluzione, per esempio aggiungendo agenti riducenti (solfuro di diidrogeno o tioglicolato), che reagiscono con l’ossigeno trasformandolo in acqua = ambiente anaerobio. Spesso viene addizionato un colorante ( resazurina ) il quale cambia colore se viene ossidato, quindi è indice di contaminazione da parte dell’ossigeno (incolore → rosa). Se non vira invece sappiamo che il microrganismo in coltura è effettivamente anaerobio. Le cellule batteriche di anaerobiosi vengono maneggiate in particolari strumenti, gli incubatori di anaerobiosi, in cui l’operatore lavora con dei guanti. Sono camere sterili e prive di ossigeno, in cui questo è stato sostituito da CO 2 a bassa percentuale oppure azoto, in cui i batteri possono essere trattati ed esaminati. Spesso è annesso un incubatore a 37°C, in cui si incubano le piastre. L’anaerobiosi si può ottenere anche con le giare, pentoloni in cui si mettono le piastre. Vengono poi aggiunte delle cartucce che assorbono l’umidità atmosferica e si elimina l’ossigeno, sostituendolo con un altro gas. La giara viene poi incubata a 37°C. COLTURE BATTERICHE I batteri devono essere coltivati in terreni di coltura, ovvero soluzioni di macro e micro nutrienti necessari per la crescita in vitro. Le colture devono essere soluzioni sterili (autoclavate), per non permettere la crescita di batteri provenienti dall'ambiente. Molto spesso contengono indicatori, che ci permettono di capire quando il pH arriva a valori troppo bassi per permettere la crescita (produzione di sostanze di scarto). A questo punto bisogna rinfrescare la coltura, trasferendola in una parte in terreno fresco. TERRENI DI COLTURA I terreni di coltura possono essere classificati secondo vari criteri: Stato fisico ➢ Liquidi: brodi di coltura (es. brodo lisogenico), dove i batteri crescono in sospensione dopo inoculazione. Con la crescita batterica aumenta la torbidità della soluzione. ➢ Solidi: terreni liquidi a cui viene aggiunta sostanza agarizzante (agar agar 1-2 % p/V), che creano una gelatina molto consistente, ma soggetta ad essiccamento. Si formano colonie batteriche, con varie morfologie. Ogni colonia è originata da una singola cellula batterica di partenza, in cui tutte le cellule batteriche sono identiche tra loro. Spesso in una piastra ci sono colture polimicrobiche , che danno vita a varie colonie, con morfologia, dimensione e colore molto diversi tra loro (es. prelievo da un tavolo, espettorato, …). Si può isolare una singola colonia e porla nel terreno di coltura liquido, per