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SINDROMI DA MICRODELEZIONI E MICRODUPLICAZIONI
In questo caso si osserva una bambina che si presenta con:
- basso peso alla nascita
- qualche lieve dismorfismo facciale → ha delle caratteristiche piuttosto sfumate nella facies , come la forma degli occhi
- è nata con un soffio cardiaco e un foro tra le camere inferiori del cuore, ovvero un difetto ventricolare settale. La bambina viene rivista all’età di 3 anni:
- i problemi cardiaci sono risolti
- ha un lento sviluppo del linguaggio → parla male e poco
- lieve malformazione palato
- sembra avere anche un lieve difetto di apprendimento
- forma degli occhi particolare
- naso stretto
- il padiglione delle orecchie è eccessivamente ripiegato in una forma particolare nella parte superiore sono indicatori della facies che possono far pensare che dietro ci sia una sorta di dismorfismo anche lieve che sia indicativo di una sindrome. Con tutte queste caratteristiche e anche sulla base di quanto detto in precedenza, l’esame che viene in mente di prescrivere è il cariotipo. L’analisi del cariotipo mostra il seguente risultato: 46,XX ovvero un esame perfettamente normale. Tuttavia, le caratteristiche di questa bambina non lasciano “tranquilli” quindi non si può escludere il fatto che possa avere qualche difetto sempre in ambito di riarrangiamento genomico e riarrangiamento cromosomico, il quale non possa essere messo in evidenza con il cariotipo standard. Il cariotipo standard ha dei limiti, cioè evidenzia dei difetti che abbiano almeno 5-10Mb. Qui siamo nel range che va da 1 milione fino a 5- 10 milioni di basi, il quale non è evidenziabile dal cariotipo standard e nemmeno dal sequenziamento del DNA Sanger o NGS. A meno di introdurre delle metodiche più nuove e di frontiera delle analisi NGS, le grosse delezioni non vengono viste, cioè quelle che vanno oltre le 30-50 basi. Ci si trova quindi ad avere una sorta di “terra di mezzo” che per molti anni non è stata presa in considerazione. Ma avere una delezione di 1-2Mb può avere delle conseguenze fenotipiche importanti. Come si affronta questa fascia (terra di mezzo) delle mutazioni genetiche? Recentemente è stata introdotta un’analisi che prende il nome di Array-GCH. Metodo FISH Prima che venisse introdotto questo nuovo metodo, si utilizzava una tecnica più semplice chiamata FISH ( Fluorescence In Situ Hybridization ), quindi una ibridazione fluorescente in situ. Permette un’analisi mirata di una regione cromosomica consentendo di mettere in evidenza riarrangiamenti di alcune centinaia di chilobasi. Le metodiche in situ evocano delle metodiche di indagine, ad esempio di acidi nucleici, che vengono fatte sul vetrino istologico; oltre che esaminare la struttura cellulare e l’eventuale colorazione certi marcatori e anticorpi, è possibile fare anche delle indagini sulle cellule a livello di acidi nucleici. Si può valutare l’espressione dell’RNA in situ oppure anche delle analisi del DNA sempre in situ, perché presuppone che sia fatta su cellule fissate su vetrino.
Vengono prese delle cellule come quelle che si utilizzano per fare un cariotipo, ovvero cellule che sono messe in coltura e si dividono, si determina l’avvio della metafase, su cellule vive a cui si induce la mitosi. Poi si blocca la mitosi e si ottiene un preparato su vetrino simile a quello che si avrebbe con un cariotipo standard. Si procede con la metodica FISH che è più sensibile, poiché l’analisi del cariotipo non ha portato risultati. Sulle cellule sul vetrino, sul cariotipo e sui cromosomi che ci sono sul vetrino, viene depositata una sonda fluorescente , ovvero un tratto generalmente di DNA a doppia elica, che è complementare ad una determinata regione genomica che si ipotizza possa essere coinvolta nella malattia in questione. Il problema è “ quale sarà la malattia del mio paziente? ” Per chi ha una certa preparazione genetica, ci sono alcune caratteristiche della bambina che evocano una possibile sindrome nota per avere un difetto cromosomico piccolo, non evidenziabile quasi mai al cariotipo standard. È necessario verificare questa ipotesi con una molecola di DNA a doppia elica complementare alla porzione del genoma che si ipotizza possa essere coinvolta nella sindrome della bambina. La sonda va a verificare se c’è qualche problema sui cromosomi della paziente; la sonda viene modificata aggiungendo un marcatore fluorescente e viene denaturata (separate le due eliche del DNA), stessa cosa per i cromosomi sul vetrino. Si ottiene del DNA a singola elica sia della sonda fluorescente sia del DNA della paziente. Mescolando questi due reagenti si formeranno delle doppie eliche ibride (→ da cui ibridizzazione in situ), cioè una doppia elica costituita da un’elica di DNA del paziente e da un’elica della sonda fluorescente. Entrambe le eliche del cromosoma della paziente andranno a ibridarsi alle rispettive eliche complementari della sonda, formando quindi delle doppie eliche ibride fluorescenti che è necessario indagare con un microscopio a fluorescenza. Il risultato FISH ottenuto per la bambina è quello nell’immagine. Era stato ipotizzato che il problema fosse a carico del cromosoma 22 , quindi è stata presa una sonda con una fluorescenza verde che andasse a colorare la porzione terminale del cromosoma 22, cioè la porzione telomerica del braccio lungo. Poi è stata presa una sonda colorata con un fluorocromo rosa che andasse a ibridarsi alla porzione del cromosoma 22 che si ipotizzava potesse essere coinvolta nel problema della bambina. È presente una sorta di contro-colorazione che fa vedere un po’ tutti i cromosomi, si notano 2 segnali verdi, uno su ognuno dei cromosomi 22, come era emerso dal cariotipo standard. La sonda rosa colora un solo cromosoma 22, ma non il secondo; questo significa che non ha trovato il complementare su quel cromosoma 22, cioè la sonda cerca di legarsi sia all’uno che all’altro ma non trova il complementare perché manca. Quindi, è possibile che ci sia una delezione. La FISH vede dei riarrangiamenti anche di alcune centinaia di chilobasi , quindi 70k-100k basi mentre con il cariotipo standard si vedono delezioni di 5-10 milioni di basi. Il difetto della metodica FISH è il fatto che possa essere eseguita solo su mutazioni già note; quindi il problema è l’ipotesi di partenza. Nel caso della bambina c’è stata un’intuizione ed è stato indagato un tratto specifico del cromosoma 22 che la sonda ha riconosciuto. In particolare, si tratta di una porzione del braccio lungo, segmento 11. ( 22q11.2 ).
Pazienti affetti dalla sindrome di Williams delezione del braccio lungo del cromosoma 7 ( 7q11.23 ). Non sono parenti tra di loro ma si assomigliano molto. Volto caratteristico molto sorridente, forma simile di occhi, naso e bocca. Hanno una personalità molto socievole, associata a disabilità intellettiva più o meno evidente, problemi cardiaci e ritardo di accrescimento. La delezione è a livello di 1.5Mb e sono coinvolti 17 geni; tra questi è stato identificato un gene che principalmente può essere coinvolto nella sindrome, ovvero l’ elastina. Infatti, sono stati trovati dei casi con mutazioni solo di questo gene, che ha permesso di capire che tra i 17 geni ce ne fosse uno maggiormente coinvolto. Molte di queste sindromi da microdelezioni sono de novo , cioè i genitori non hanno quello stesso riarrangiamento. Perché avviene? Il meccanismo è già stato trattato quando si era parlato di copy number variants; infatti, tra copy number variants e microdelezioni c’è un certo legame di parentela. La prima può essere anche più piccola, può essere per definizione una variante presente nella popolazione generale, quindi una forma di delezione o duplicazione piccola ma comune, non necessariamente associata a un fenotipo. L’origine di microdelezioni e microduplicazioni è la stessa delle copy number variants, cioè avviene un appaiamento dei cromosomi omologhi durante la meiosi che non è corretto ma è sfasato ; quindi, quando avviene la ricombinazione darà origine ad una delezione o ad una duplicazione. L’appaiamento dei cromosomi omologhi potrebbe essere sfasato perché queste microdelezioni sono ricorrenti, avvengono quasi sempre a livello delle stesse porzioni genomiche dato che quelle presentano, a lato della sequenza unica (in verde nell’immagine → viene deleta), delle sequenze definite dupliconi o low copy repeat (in arancione) di circa 200 - 400 kb. Queste ultime sono abbastanza diffuse, sono presenti circa nel 10% del genoma e si trovano spesso nelle regioni subtelomeriche o pericentromeriche ; sono responsabili in prima persona dell’appaiamento disuguale, sfasato, dei cromosomi omologhi, dato che sono abbastanza grandi da fare in modo che il cromosoma omologo si appai in maniera sfasata. Quindi nell’immagine, al posto di appaiarsi con la porzione arancione in corrispondenza dell’arancione, quella verde in corrispondenza dell’altra verde, l’arancione in corrispondenza dell’altra arancione, poiché le arancioni sono molto simili tra di loro, una sequenza arancione si è appaiata all’arancione a valle del gene dell’altro cromosoma omologo. Se avvenisse anche il crossing-over , oltre a questo difetto di sfasamento e appaiamento, alla fine della prima divisione meiotica abbiamo un cromosoma che ha due tratti verdi a sequenza unica e un cromosoma che non ha nessuno tratto verde. Quest’ultimo è quindi il cromosoma con la microdelezione oppure, se è un pezzo più piccolo del polimorfico comune alla popolazione generale, con una copy number variant deleta che può essere causa della sindrome velocardiofacciale o di Williams. Invece, se avviene la duplicazione possiamo attenderci anche in questo caso un fenotipo che per lungo tempo non è stato così indagato, solo più recentemente è stato visto che la maggior parte delle sindromi da microdelezione hanno anche una controparte da microduplicazione.
Ad esempio, la regione critica di 3Mb, che è deleta nella sindrome di DiGeorge, può trovarsi anche duplicata, con una conseguenza fenotipica. È stato visto che causa un ritardo psicomotorio di grado variabile. La sindrome di Williams è causata da una delezione di un segmento del cromosoma 7, ma è coinvolto anche quando è duplicato, in una patologia che porta a ritardo del neurosviluppo, ed è anche associata a difetto del linguaggio e ad autismo. In generale, le microdelezioni causano un fenotipo più lieve ma quando una certa porzione di cromosoma è sia deleta o duplicata, è atteso un certo fenotipo clinico. Infatti, all’inizio erano molto più note le sindromi corrispondenti al difetto di delezione perché più gravi. Le caratteristiche delle sindromi da microduplicazione e microdelezioni sono eventi quasi sempre de novo, sono ricorrenti; infatti, i punti che vengono deleti ( break-point ) sono molto simili nonostante i pazienti non siano imparentati tra di loro. Questo perché sono mediate da eventi di crossing-over disuguali, durante la gametogenesi dei genitori, che a loro volta sono mediati dalle low copy repeat presenti in particolari porzioni di molti cromosomi. Quindi, mediando l’errore più o meno nello stesso modo, i break-point sono sempre gli stessi. Di conseguenza, quando si ha una delezione della sindrome di DiGeorge, i geni deleti sono sempre gli stessi in tutti i bambini perché il break-point è corrispondente in tutti i casi di delezione che portano a questa sindrome. Il rischio di ricorrenza , poiché de novo, è minimo ma non zero e non uguale alla popolazione generale, dato che si può pensare che ci sia un mosaicismo della linea germinale ; questo fa sì che occorra analizzare i genitori, verificare che sia de novo e anche se de novo proporre alla famiglia una possibile diagnosi prenatale per gravidanze successive. Come sono state identificate queste diverse microdelezioni/microduplicazioni? Come si affronta attualmente questo argomento? La FISH è un buono strumento, ma prima passa attraverso la generazione di un’ipotesi che non sempre è disponibile. In effetti, fino a 10-15 anni fa, c’erano tantissimi bambini con caratteristiche simili a quelle viste finora, ma negativi per difetto del cariotipo e anche per delezioni/duplicazioni, ma sempre con caratteristiche tipiche da sindrome cromosomica , le quali sono piuttosto comuni e che quindi segnano tantissimo l’attività di un genetista, ma gravano molto sulle famiglie rimanendo senza diagnosi. Si è pensato di fare uno step intermedio che ancora si utilizza per certe applicazioni, ovvero il metodo del chromosome painting. CHROMOSOME PAINTING Invece di fare una sonda solo per un pezzo di cromosoma, si possono fare delle sonde che vanno a ibridarsi su tutti i cromosomi. In particolare, è possibile fare tante piccole sonde che vanno a ibridarsi al cromosoma 1, al cromosoma 2, ecc., avendo cura di usare dei coloranti diversi per le sonde che andranno a legarsi ai diversi cromosomi. Questa metodica non è utilizzata in maniera routinaria ma talvolta è ancora in uso. Vengono disegnate tante sonde in modo che vadano a legarsi, una vicino all’altra, a tutto il cromosoma 1; poi ne disegno tante altre che si leghino al cromosoma 2 ma utilizzando un colorante differente dal precedente, e via dicendo. L’effetto ottenuto è molto bello: ogni cromosoma ha un colore diverso dall’altro.
Nell’immagine è rappresentato un vetrino semplificato, dove ci sono tutte le sonde ben schierate. A ciascuna corrisponde un certo pezzo di un certo cromosoma. Concetto di “comparative”: si prende il DNA del paziente, dal sangue o dalla saliva. Si colora il DNA con una fluorescenza, in verde nell’immagine, chiamata Cy3. Poi, si prende il DNA di un controllo; generalmente non è mai una singola persona ma un gruppetto di persone sane che non hanno una patologia cromosomica. Il DNA del controllo viene colorato con un fluorocromo rosso, chiamato Cy. A questo punto, si denatura il DNA del paziente e del controllo e si deposita sulle sonde già denaturate e pronte sul vetrino a legarsi con il DNA sia del paziente che del controllo. Le sonde non distinguono se si tratta di paziente o controllo, ma si legano all’una o all’altra. Qui non è la sonda ad essere fluorescente ma il DNA; prima era la sonda ad essere fluorescente e non fluorescente il DNA del cromosoma del paziente. In questo caso si inverte perché si costruiscono delle sonde che vanno bene per tutti i pazienti. Si legano in maniera tale che se non ci sono differenze quantitative nella quantità di DNA tra paziente e controllo, allora si legano con la stessa efficienza, non competono e sono alla pari. Quando questo avviene, il segnale che si identifica è indicato in giallo. Cosa vuol dire che una sonda lega di più il DNA di controllo? Sono stati messi il DNA sia del paziente che del controllo e si sono misurate bene le quantità di DNA del paziente e del controllo, non si è fatto questo errore grossolano; infatti, ci sono delle metodiche per misurare la quantità generale e quindi partono alla pari, ma per certe sonde vince il controllo cioè si lega di più rispetto al paziente. Se il controllo si lega di più vuol dire che il paziente ha qualcosa in meno rispetto al controllo in quel punto e quindi si può ipotizzare che se c'è una prevalenza di colore rosso ci sia una delezione nel paziente perché si lega di più il controllo rispetto al paziente. Si potrebbe anche ipotizzare che ci sia un risultato diverso, cioè che il problema sia nel controllo e non nel paziente, però è chiaro che il controllo fenotipicamente sta bene, quindi si ritiene che abbia una quantità di DNA per tutti i cromosomi standard, corretta (è per questo che si evita di mettere un singolo soggetto come controllo perché potrebbe avere magari una copy number variant e si potrebbero avere un sacco di risultati che vanno ad analizzare il controllo e non il paziente, quindi si usa un gruppetto per fare in modo di ricostruire il genoma di riferimento del controllo). Se invece predomina il segnale del paziente già verde vuol dire che in quei pazienti si lega di più perché ha più copie, potrebbe avere una duplicazione. Di ogni sonda si registra la quantità di segnale rosso e la quantità di segnale verde, si fa un rapporto e se il rapporto è attorno ad 1 non c'è né delezione né duplicazione; se il segnale prevalente è verde c'è una duplicazione; se si vede un segnale prevalente del controllo cioè rosso, il rapporto Cy5 (il controllo) su Cy 3 (paziente) è >1, vuol dire che c'è una delezione. NB: Cy5 e Cy3 sono i fluorocromi con cui si marca (3 per il paziente e 5 per il controllo). Volendo si possono invertire le fluorescenze per confrontare e confermare questo risultato. In questo modo si è in grado di visualizzare pezzetto per pezzetto su tutti i cromosomi il rapporto di fluorescenza e quindi capire se il paziente ha una delezione o una duplicazione. Si ricostruisce l’array di sonde in maniera da mostrare i dati non per puntino perché non capirebbe niente, ma il computer lo restituisce mettendo in ordine le sonde in ordini di cromosoma, cioè il computer mostra i risultati mettendo il segnale di fluorescenza di una sonda accanto al segnale di fluorescenza della sonda che lega la porzione di cromosoma ad esso adiacente, quindi ricostruisce l'immagine dei cromosomi. Ad esempio, questo è un risultato che è stato ottenuto in uno dei primi studi pubblicati ormai un po’ di anni fa (questa tecnica ormai viene avviata ordinariamente da almeno 12 anni): sono partiti da 50 pazienti con la classica sintomatologia di una patologia cromosomica: ritardo mentale, dismorfismi, negativi al cariotipo standard cioè con un cariotipo standard normale, come quelli visti finora, ma con queste caratteristiche sindromiche da patologia cromosomica. Quando questa tecnica è stata introdotta nei laboratori queste casistiche di pazienti senza una diagnosi sono state subito avviate all'indagine e sono stati molti che hanno effettivamente avuto un risultato positivo con Array-CGH.
Interpretazione dei risultati (paziente 10 e 11 nell’immagine sovrastante): questa è la ricostruzione del segnale di fluorescenza del cromosoma 13 per il paziente 10 e del cromosoma X per il paziente 11. Questo lavoro si fa per tutti i cromosomi per tutti i pazienti, cioè viene messo il segnale di fluorescenza di ogni sonda in ordine di cromosoma e appartenente ad ogni cromosoma. Si fa il rapporto di fluorescenza verde-rosso, se è attorno ad 1 si “plotta” attorno allo 0 perché si plotta il valore logaritmico e il logaritmo di 1 è 0. Ovviamente potrebbe non essere 1 preciso, ma avere delle fluttuazioni, ma comunque molto vicino allo 0, nella fascia tra le due righe rosse. Nel paziente 10 e nel paziente 11 ogni puntino corrisponde al segnale fluorescente di una sonda o per meglio dire al rapporto di fluorescenza rosso-verde di ogni sonda. Il paziente 10 ha tutte le sonde sulla riga che significa “rapporto uguale a 1”, cioè il paziente rispetto al controllo non ha né una delezione né una duplicazione, si ibrida più o meno come il controllo e il rapporto di fluorescenza è 1, quindi log1 = 0. Non tutti i puntini però stanno sullo 0: nel paziente 10 ci sono dei puntini che non sono sullo 0, hanno un segnale che nel paziente è inferiore rispetto al controllo, il rapporto è inferiore , potrebbe avere una microdelezione. Nel caso del paziente 11 invece il segnale è superiore alla riga 1 quindi il paziente 11 ha più fluorescenza rispetto al controllo, potrebbe essere una duplicazione. Sono coinvolte due sonde vicine e quindi considerando che ogni sonda è spaziata di 1 milione di basi, si può ipotizzare che se ci sono due sonde coinvolte ci siano 2 milioni di basi coinvolte grossolanamente. Adesso si usano sonde più vicine, più sono vicine le sonde, più si possono vedere pezzi piccoli. In effetti nei due pazienti ci sono una delezione 13Q e una delezione XP, molti di questi pazienti presentano una delezione e una duplicazione più o meno grandi e in particolare ben 12 su 50 pazienti hanno mostrato o delezioni o duplicazioni. Quando si identificano si va analizzare sempre in FISH per conferma, si conferma il FISH, si fa una delezione del 17 presente nel paziente. Una volta confermato il FISH si vede che manca un segnale fluorescente sul cromosoma 17 che è invece presente nei genitori. La FISH si usa come conferma: si vede che il paziente ha una delezione sul cromosoma 17, si è disegnata la sonda, si è usato il FISH che dà una conferma, i cromosomi 17 di mamma e papà non hanno la stessa delezione perché si vede il segnale verde sotto il centromero (rosa) in tutti e due i cromosomi. È una delezione de novo. Questo è il metodo utilizzato: dalla Array-CGH si procede con la conferma per FISH o metodica analoga e all'analisi sempre dei genitori. Se è una delezione de novo si conferma che probabilmente è la causa della sintomatologia di questo paziente. Se i genitori volessero avere altri figli potrebbero andare incontro ad una diagnosi prenatale invasiva perché la ricorrenza ci può essere.
Con questa metodica che affianca quelle viste in precedenza si aumenta un pochino la possibilità di diagnosticare quei casi che o hanno mutazioni troppo piccole o le mutazioni non si vedono o non si capisce bene in che punto sono del gene. In questo modo si capisce la presenza di questa mutazione perché il gene causa un problema di metilazione su tutto il genoma. Si fa un'analisi genome wide della metilazione sulle isole CpG del genoma. Molte sindromi, almeno 40, hanno una loro particolare signature, cioè un pattern di metilazione caratteristico e distintivo. IMPRINTING GENOMICO- SINDROME DI PRADER WILLI E SINDROME DI ANGELMAN È necessario fare un piccolo approfondimento su una parte importante di queste sindromi da microdelezione e microduplicazione, la sindrome di Prader Willi/Angelman , una sindrome da microdelezione. Ci sono due nomi Prader Willi e Angelman che non sono due nomi alternativi della stessa sindrome semplicemente perché, come a volte capita, sono due i ricercatori che l’hanno identificata, ma sono due nomi perché Prader Willi corrisponde ad una sindrome e Angelman corrisponde ad un'altra sindrome. La delezione però coinvolge esattamente lo stesso cromosoma, la stessa parte di cromosoma, il braccio lungo del cromosoma 15. Queste sindromi non si assomigliano: in comune hanno il ritardo mentale e la bassa statura, ma il ritardo mentale è piuttosto lieve nella Prader Willy, molto grave invece nella sindrome di Angelman. Per il resto la sintomatologia è molto diversa: nella Prader Willy c'è oltre che bassa statura, obesità, i bambini nascono ipotonici, hanno difficoltà ad alimentarsi, ma poi man mano che diventano grandi hanno una tendenza a mangiare molto e quindi a sviluppare di fatto obesità; nella Angelman invece oltre al ritardo mentale di solito molto grave, ci sono altri disturbi neurologici come convulsioni, epilessia, disturbi dell'equilibrio e una postura tipica con le braccia ripiegate oltre che una facilità al riso (hanno un sorriso che non corrisponde necessariamente ad una vera gioia, ma è più che altro un’espressione tipica). Sono due sindromi completamente diverse fenotipicamente ma dietro c'è la delezione dello stesso segmento di DNA, sono tutte e due causate nel 70% dei casi da una microdelezione di questa porzione del cromosoma 15 costituita da circa 4 milioni di basi. Come mai questo è possibile? Analisi ormai datate hanno cominciato a far capire una differenza che poi si è rivelata fondamentale per capire il meccanismo delle malattie: si tratta sempre di delezioni esattamente dello stesso segmento per entrambe le sindromi, ma quando c'è la sindrome di Angelman (AS) la delezione riguarda il cromosoma che il bambino/a ha ereditato da sua mamma , quindi è il cromosoma della mamma ad essere deleto, quando invece il bambino/a sviluppa la sindrome di Prader Willy il segmento è sempre lo stesso, ma riguarda il cromosoma di origine paterna. Questo aspetto ora viene raccontato in maniera disinvolta, ma inizialmente quando questi dati sono emersi era abbastanza sconvolgente perché mai un cromosoma di origine paterna o di origine materna con la stessa delezione aveva portato dei fenotipi così diversi. Quindi si ha un fenotipo assolutamente diverso a seconda che sia è alterato il cromosoma 15 trasmesso dal padre o quello trasmesso dalla madre. Da qui in avanti hanno preso origine una serie di approfondimenti che hanno portato a mettere a fuoco un fenomeno noto oggi con il termine di imprinting genomico. Il termine imprinting non è un termine di genetica, ma è un termine di etologia riferito al comportamento animale, gli animali che imitano il comportamento dell'animale che per primo vengono quando sono molto piccoli, quindi una sorta di impronta che si rilascia sul soggetto a partire da un soggetto/genitore o non necessariamente genitore. Qui non è un imprinting che riguarda il comportamento, ma riguarda una sorta di impronta che si lascia sul DNA perché è un imprinting genomico.
Questo vuol dire che sul cromosoma materno c’è un determinato gene, il gene A, trascrizionalmente attivo, mentre lo stesso gene A sul cromosoma paterno può essere trascrizionalmente inattivo, cioè l'imprinting genomico consiste nel fatto che ci siano delle regioni del nostro genoma (non solo del nostro genoma, ma in generale) che hanno una espressione monoallelica. Innanzitutto, ci sono dei geni che non sono espressi su tutti e due i cromosomi, ma basta evidentemente che siano espressi in maniera monoallelica, o quello di origine materna o quello di origine paterna. In più ci sono delle regioni del genoma dove non è casuale che venga espresso solo quello di origine materna o solo quello di origine paterna, quindi esiste un'espressione monoallelica parentale specifica. In questo caso ipotizziamo che questo gene sia espresso, cioè che venga trascritto solo quello di origine materna e che non venga trascritto dal cromosoma di origine paterna. Si dice che c'è un imprinting paterno e imprinting fa riferimento all’allele non trascritto, quello bloccato nell'espressione. Quindi l'imprinting genomico in pratica è un meccanismo che non ha nulla a che vedere con la sequenza del DNA perché se noi andiamo a sequenziare il gene A materno e il gene A paterno, la sequenza nucleotidica è identica, non c'è magari una mutazione nel promotore e quindi uno si esprime l'altro no, ma la sequenza nucleotidica è perfettamente identica. È un meccanismo epigenetico che passa attraverso una metilazione differenziale delle citosine, dei nucleotidi CG che blocca l'espressione. Questo meccanismo genetico è genitore-specifico, quindi dipende qual è il genitore e può bloccarsi l'espressione o dell'allele materno o dell’allele paterno. Il meccanismo viene cancellato durante la gametogenesi perché un maschio durante la gametogenesi deve produrre dei gameti e deve mettere l'impronta del fatto che quel genitore sia un maschio oppure che il genitore sia una femmina, quindi, deve cancellare l'impronta che ha ricevuto sui due cromosomi dai genitori per poter mettere la propria impronta sesso-specifica e quindi viene poi ripristinato in maniera uniforme secondo il sesso dell'individuo. L'imprinting richiede una sorta di direttore d'orchestra, non avviene in maniera casuale, ma riguarda solo certe porzioni del nostro genoma. La regione del cromosoma 15 dove mappa la regione della sindrome di Prader-Willi è stata la prima ad essere identificata. Ora sappiamo che ci sono alcune centinaia di altre regioni del nostro genoma che sono sottoposte ad imprinting, cioè che presentano un'espressione monoallelica di geni genitore-specifico. Questa differenza di espressione è basata su una metilazione differenziale quasi sempre e richiede un'orchestrazione, non avviene in maniera casuale, c'è in ciascuna di queste regioni quelli che vengono chiamati il centro dell'imprinting , questa sorta di direttore d'orchestra che fa capire come devono esprimersi i geni in quella regione a seconda che il cromosoma derivi dalla mamma o dal papà. Questa è la regione genomica della sindrome di Prader-Willi e di Angelman, si vedono alcuni geni che sono particolarmente importanti poi in questa regione: nel cromosoma di origine il centro dell'imprinting blocca l'espressione di tutti i geni della regione, gli unici geni che si esprimono sono questi due geni segnati con le frecce. Tra questi geni c'è questo gene detto UBE3A che viene espresso. Quello sottostante è il cromosoma di origine paterna, il centro dell'imprinting fa in modo che venga metilato il centro dell'imprinting Angelman; invece, l'altro è il centro di imprinting Prader-Willi. Questo porta alla possibilità che si possano esprimere tutti questi geni (azzurri con le frecce). Tra tutti questi geni c'è anche una RNA antisenso che blocca l'espressione di UBE3A. Quindi nel cromosoma di origine materna si esprimono solo questi due geni (rossi con le frecce) e tra questi c'è il gene UBE3A che è particolarmente importante, è una ubiquitin-ligasi; nel cromosoma di origine paterna non si esprime UBE3A, ma si esprimono tutti questi geni (azzurri con le frecce) e tra questi il gene che si deve esprimere necessariamente su questo cromosoma è il gene che codifica per questi small nuclear RNAs, SNORD116, è il gene che deve essere sicuramente espresso sul cromosoma di origine paterna.
Ci sono dei casi più rari dove o c'è una mutazione nel centro dell'imprinting che va a turbare questa orchestrazione di espressione genica oppure ci possono essere casi di mutazione o del gene UBE3A che causa la sindrome di Angelman o nel gene SNORD16 dello Small Nuclear RNA che causa la sindrome di Prader-Willi perché sono rispettivamente i due geni critici delle due regioni che comprendono anche altri geni. È importante distinguere tra tutti questi difetti molecolari quando c’è un bambino-paziente Angelman o Prader-Willi? È importante ai fini del rischio di ricorrenza perché le probabilità sono diverse: la delezione è presente sia nel Prader-Willi sia in Angelman circa nel 70% dei casi, la disomia uniparentale è prevalentemente presente nella Prader-Willi fino ad un 30%, poi mutazioni del centro dell'imprinting o mutazioni puntiformi ed infine ci sono anche alcune traslocazioni sbilanciate o bilanciate che sono presenti soprattutto nella sindrome di Angelman che all'epoca hanno portato a capire qualcosa di più riguardo questa sindrome, a localizzare la posizione genomica. In tutti questi casi cambia la ricorrenza: le delezioni e le disomie uniparentali sono eventi de novo, quindi hanno un rischio basso di ricorrenza attorno al famoso 1% , se c'è invece una mutazione del centro dell'imprinting o una mutazione del gene UBE3A o SNORD16 il rischio di ricorrenza può arrivare fino al 50% (si dice fino al 50% perché nella trasmissione non è facile definire quale sarà il fenotipo perché si deve capire l'origine parentale, non è un 50% come per una qualsiasi malattia autosomica dominante, bisogna tener conto di quale genitori l'ha trasmessa e quindi può manifestarsi o non manifestarsi a seconda del genitore), poi ci sono una serie di soggetti che hanno una traslocazione, in questo caso non è facile stabilire il rischio di ricorrenza e quindi occorre poi fare studiare caso per caso. Ci sono oltre 100 regioni genomiche che sono sottoposte ad imprinting per cui è presente un'espressione monoallelica genitore-dipendente , coinvolgono vari cromosomi, non sono concentrati tutti in un cromosoma oltre al cromosoma 15. In alcuni casi si osserva la loro presenza a seguito di malattie come Angelman o Prader-Willi o la sindrome di Beckwith-Wiedemann che ha un difetto solo se il difetto genetico origina da un genitore e non dall’altro perché sono tutte malattie nelle quali c'è un l'espressione monoallelica genitore-dipendente e quindi questo fa sì che questi siano esempi di malattie che mettiamo nel capitolo delle microdelezioni, ma possiamo mettere anche nel capitolo delle trasmissioni mendeliane atipiche perché a seconda di quale genitore c’è una manifestazione diversa a parità di mutazione.
