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MALATTIE MULTIFATTORIALI
Abbiamo finora ragionato molto su caratteri monogenici a trasmissione mendeliana causate da difetti in un singolo gene. Oggi tratteremo i caratteri definiti multifattoriali causati dall’interazione di molti geni e da fattori ambientali. Siamo sicuri che anche per i caratteri monogenici (quindi a trasmissione mendeliana) ci sia realmente il contributo di una sola mutazione a livello di un singolo gene? Come possiamo spiegare la penetranza incompleta (mancata espressione del carattere) o l’espressività variabile caratterizzante alcuni caratteri monogenici? Si può ipotizzare che vi sia un contributo multifattoriale dovuto alla presenza di uno o più secondi geni e di fattori ambientali. I fattori ambientali possono infatti condizionare in modo importante le manifestazioni delle malattie. Si possono a questo proposito citare le malattie metaboliche: con l’adozione di misure contenitive in età neonatale si può ridurre il grado di espressione della malattia. MALATTIE DIGENICHE Nella comunità scientifica si ritiene che alcune condizioni monogeniche si possano meglio spiegare ipotizzando un’ eredità digenica. Ne è un esempio la retinite pigmentosa. Si tratta di una distrofia retinica caratterizzata dalla progressiva degenerazione dei fotorecettori e dalla conseguente disfunzione dell'epitelio pigmentato. I pazienti colpiti da retinite pigmentosa, inizialmente, manifestano problemi di vista, soprattutto in ambienti con scarsa illuminazione (cecità notturna) e lamentano una costrizione del campo visivo periferico. La visione centrale è intatta, almeno fino alle fasi successive della malattia. La progressione della malattia e l’esito finale possono variare notevolmente: molte persone con retinite pigmentosa mantengono una visione limitata per tutta la vita, mentre, altre perdono completamente la vista. Questa variabilità è dovuta all’eterogeneità delle possibili mutazioni (elevate eterogeneità di locus e allelica). Alcune retiniti pigmentose sono dominanti, altre hanno trasmissione x-lynked. Nel 1994 vennero individuati i geni responsabili di questa degenerazione. L’articolo scientifico venne pubblicato sulla rivista scientifica Science. I due geni la cui alterazione combinata è responsabile della manifestazione della malattia sono i geni codificanti le proteine periferina (PRPH2)/RDS e ROM. Codificano per proteine con espressione specifica nei fotorecettori: esse rivestono un ruolo critico nella stabilizzazione dei fotorecettori. Le due proteine segregano su due geni indipendenti formando un tetramero (omotetramero/eterotetramero).
La malattia si manifesta quando si ha una doppia mutazione: sia a livello del gene ROM1 che a livello di PRPH2. Analisi albero genealogico proveniente dallo studio prima citato. I malati di retinite pigmentosa sono riportati in nero e sono in numero di 2. Essi presentano una mutazione sia del gene periferina che del gene ROM1 (indicate come RDS/+ e ROM1/+”, dove il “/+” indica una mutazione in eterozigosi). Il simbolo +/+ indica invece un’omozigosi per il gene sano. Nella prima generazione la combinazione della mutazione a livello del gene RDS proveniente dalla madre e del gene ROM1 nel padre porta alla nascita di due figli malati: un maschio e una femmina. Nella seconda generazione, oltre ai due malati, troviamo: − due fratelli sani con mutazione in ROM1; − un fratello sano con mutazione in RDS Nella III generazione, i due figli nati dagli individui 5 e 6 della generazione II sono sani con gene RDS mutato. Le famiglie analizzate nel 1994 per studiare il contributo delle singole mutazioni furono numerose. Le due mutazioni seguono la trasmissione mendeliana. Sono caratteri indipendenti , cioè non concatenati fra di loro: una persona che presenta entrambe le mutazioni (su geni e cromosomi distinti) può trasmetterne una, l’altra o entrambe in maniera totalmente indipendente → in questo caso si è trasmessa casualmente una sola mutazione. Si tratta, quindi, di caratteri indipendenti su cromosomi diversi che vanno incontro ad un assortimento indipendente dei cromosomi omologhi: una persona che presenta due mutazioni di geni situati su cromosomi distinti può avere figli che presentano nessuna delle due mutazioni, tutte e due le mutazioni, oppure solo una delle due. Essendo geni indipendenti questi quattro casi si verificano con uguale probabilità. Una mutazione singola causerà probabilmente un piccolo cambiamento a livello cellulare, ma non a livello clinico: le persone con una singola mutazione non hanno questa degenerazione e non sviluppano quindi retinite pigmentosa, ma solo dei lievi sintomi. Le due proteine, pur segregando su due geni indipendenti, fanno parte di un tetramero (che può essere omotetramero o eterotetramero) costituito da due proteine periferina e da due ROM1(tetramero normale con fenotipo normale). Se la mutazione missense interessa solo una proteina, la funzione del tetramero sarà sicuramente alterata, ma non verrà alterata la funzionalità del fotorecettore interamente. La mutazione in ROM1 non porta alla produzione della sua proteina, formando quindi un tetramero costituito totalmente da periferina che presenta però comunque un fenotipo normale. Il problema si manifesta quando la mutazione colpisce sia la periferina che la ROM1: si ha in questo caso una creazione problematica del tetramero, con conseguente sviluppo della retinite pigmentosa.
Queste malattie multifattoriali si trovano nella categoria del “gene + ambiente”: sono infatti condizioni che si manifestano alla nascita (vedremo alcune anomalie congenite) e sono legate soprattutto alle malattie degenerative e metaboliche dell’adulto (malattie multifattoriali come tumori, diabete, ipertensione, obesità, malattie cardiocircolatorie). Ancora oggi non abbiamo degli strumenti di test diagnostici adatti per identificare cause profonde della maggior parte di queste malattie. Qui sopra osserviamo una tabella in cui si ha il confronto alla nascita, in età adulta e nella popolazione generale dell’incidenza di condizioni dovute a malattie cromosomiche, malattie monogeniche e malattie multifattoriali. Alla nascita abbiamo 5 0 /1000 come incidenza delle multifattoriali, valore che è almeno 5 volte superiore alle condizioni monogeniche e cromosomiche. Questa maggiore incidenza si mantiene anche parlando in termini di prevalenza: nelle donne di 25 anni continuano a essere molto maggiori le prevalenze delle malattie multifattoriali e nella popolazione generale la prevalenza raggiunge addirittura un valore di 600/1000. Si tratta di condizioni molto frequenti Per le malattie monogeniche i numeri prevalenti sono nell’ordine delle migliaia, mentre per le multifattoriali si parla anche di milioni (tumori, ischemia cardiaca, diabete) Dal punto di vista tradizionale parliamo di caratteri multifattoriali:
- continui : caratteri per i quali non possiamo definire chi è malato e chi è sano e per i quali non c’è una distinzione dicotomica discontinua, cosa che avviene invece nei caratteri discontinui (di cui fanno parte le vere e proprie malattie complesse). Sono caratteri che si manifestano nella popolazione e assumendo un valore continuo all’interno di essa, come ad esempio statura, peso, pressione ematica.
- discontinui : distribuzione continua del numero di fattori di suscettibilità (effetto soglia). CARATTERI CONTINUI Come accennato prima, per caratteri continui si intendono tutti quei valori associati alla statura, peso, pressione ematica e quoziente intellettivo. Per ciascuno di questi caratteri sono presenti nella popolazione generale tutti i possibili valori in termini di unità di misura. Sono importanti dal punto di vista medico perché si esprimono in tutti gli individui e i loro valori estremi sono indice di un qualcosa di patologico.
Sono anche definiti caratteri quantitativi perché si ritiene che per la loro manifestazione ognuno di noi eredita un certo numero di varianti genetiche, ciascuna delle quali influisce per una piccola quota sul risultato finale: ad esempio sono state identificate circa 12000 varianti coinvolte nella determinazione dell’altezza. L’altezza è un carattere multifattoriale ad elevata componente genetica dato da migliaia di geni diversi (il numero di varianti che ognuno di noi ha porta ad avere una altezza più o meno elevata). Ciascuna di queste varianti ha un suo impatto perché contribuendo per una quota (questioni di millimetri) in modo quantitativo (l’effetto di una si aggiunge all’effetto dell’altra) si avrà il valore dell’altezza finale. In maniera simile si parla del peso o quoziente intellettivo. Questi caratteri sono talmente continui che se noi li mettessimo all’interno di un sistema di assi cartesiani (dove x = valore che il carattere può assumere; y = n° soggetti che presenta quel determinato valore) otterremmo la tipica curva a campana detta gaussiana. Questo ci fa vedere che abbiamo pochi soggetti con valori bassi e pochi soggetti con valori alti, mentre avvicinandoci ai valori medi il numero di soggetti aumenta sempre di più. Come facciamo a capire se possiamo identificare delle persone con valori problematici? Il primo approccio è quello di calcolare la media e deviazione standard dei valori: se la misura si allontana per più di due deviazioni standard dalla media si parla di valori degni di attenzione o patologici. Questo rappresentato a destra è un esempio di grafico del quoziente intellettivo, uno dei primi esperimenti dove il concetto di media e deviazione standard è stato presentato. Abbiamo parlato molto spesso di varie condizioni e sindromi in cui erano presenti una disabilità intellettiva o dei disordini del neurosviluppo: come si fa però a sapere se un individuo presenta una disabilità intellettiva? Ci sono dei test che vengono applicati portando poi ad avere un punteggio numerico con valore continuo nella popolazione generale, per il quale la distribuzione dei valori ha la tipica curva gaussiana. Andando ad analizzare la curva, si è stabilito a livello internazionale di definire una disabilità intellettiva quando i valori sono inferiori alle 2 deviazioni standard : si parla di disabilità lieve. Se poi il valore cresce passando da 2 DS a 3 o più, si parla di disabilità intellettiva moderata o grave. Questo è stato uno dei primi esempi in cui la definizione degli estremi patologici si è basata puramente sulla statistica. Attualmente una persona che presenta dei valori inferiori a 2 DS rispetto alla media è una persona che può giungere alla massima attenzione come una persona con disabilità intellettiva. Lo stesso metodo si può applicare all’ipertensione, dove gli estremi patologici vengono definiti ipertesi : la pressione arteriosa misurata in mmHg sia sulla base della distribuzione (media e ds) sia sulla base di studi che portano a definire quali siano i livelli soglia oltre i quali ci possono essere delle conseguenze patologiche. Per quanto riguarda l’ipertensione si tratta di un’unione tra semplice applicazione della statistica e un continuo aggiornamento della evidence based medicine – ci fanno capire l’importanza del seguire pazienti ipertesi essendo a rischio cardiovascolare. EREDITABILITÁ
L’ereditabilità si può stimare come r/2F (percentuale di geni in comune). Per un carattere completamente controllato da geni r=2F : in questo caso l’ereditabilità è pari a 1. Se il coefficiente di correlazione fosse 1 nei gemelli monozigoti, l’ereditabilità sarebbe del 100%. r dovrebbe essere calcolato di carattere in carattere. Possiamo invece conoscere la percentuale di geni in comune 2F. Per i vari valori guardare la tabella. Per un determinato carattere, come il valore della pressione arteriosa, andiamo a calcolare i coefficienti di correlazione tra coppie di diversi parenti. Il coefficiente di correlazione, come possiamo osservare nella tabella a sinistra, si abbassa in relazione al numero di geni condivisi. Minore è la proporzione di geni condivisi, minore è il coefficiente di correlazione. Nell’immagine di dx è stato invece calcolato il peso della componente genetica (o ereditabilità) per la pressione arteriosa. Possiamo quindi concludere che la componente genetica rivesta un ruolo importante per la pressione arteriosa. Si potrebbe pensare che le pressioni di parenti strettamente imparentati come genitori-figli possano essere correlate alle abitudini alimentari famigliari e stili di vita simili. Sono stati condotti a questo scopo degli studi per confrontare le differenze di pressione nelle famiglie con figli adottivi e quelle con figli naturali.
Si è andato infatti a stimare il coefficiente di correlazione fra genitori e figli naturali o adottivi (che quindi condividono il medesimo ambiente) per valori pressori. È lampante quanta poca rilevanza rivestano i fattori ambientali. Nei figli adottivi il fattore di correlazione assume valori pari a 0,03/0,02. Nei figli naturali pari a 0,30/0,25. Non è sufficiente condividere il medesimo ambiente per avere un coefficiente di correlazione alto. Consideriamo ora i coefficienti di correlazione di altri caratteri continui. Come possiamo osservare in questa tabella, caratteri continui come l’altezza o l’IQ hanno coefficienti di correlazione massimi. Se infatti considerassimo caratteri determinati solo ed esclusivamente dalla componente genetica, 0, sarebbe il massimo valore ottenibile per parenti di I grado. La statura è un carattere ad elevata ereditabilità e il suo coefficiente ha infatti valori molto alti.
- Coefficienti di correlazione nei gemelli I gemelli hanno rivestito un ruolo di particolare importanza nella storia della genetica perché ci hanno permesso di stabilire se determinati caratteri avessero una componente monogenica o meno. Perché? Un carattere totalmente genetico si presenterebbe allo stesso modo nei due gemelli, sia che si tratti di un carattere continuo che di un carattere discontinuo. Non sempre questo accade: spesso il carattere è discordante. Applicando questo concetto ai caratteri continui, se un carattere avesse sola componente genetica, mi attenderei un coefficiente di correlazione 1 nei monozigoti, 0,5 nei dizigoti. I dizigoti condividono infatti il 50 % del patrimonio genetico. Se invece considerassimo un carattere che dipende esclusivamente dall’ambiente ci aspetteremmo un coefficiente di correlazione pari a 1 sia nei monozigoti che nei dizigoti. Essi condividono infatti l’ambiente sia intrauterino (dalla fecondazione al parto) sia postnatale (perlomeno generalmente). Ci potremmo aspettare anche coefficienti leggermente più bassi, ma comunque simili tra gemelli monozigoti e gemelli dizigoti. Nel caso in cui il carattere è invece dipendesse sia dalla componente genetica che dalla componente ambientale ci sarebbero variazioni di coefficiente tra i gemelli monozigoti e i gemelli dizigoti. In questo caso se la differenza tra i due coefficienti è molto alta e i gemelli monozigoti presentano un coefficiente molto più grande è possibile che ci sia una componente genetica preponderante.
EREDITARIETÁ DELLE MALATTIE COMPLESSE E ASPETTI PRATICI
Consideriamo ad esempio una coppia con un figlio affetto da labioschisi. Talvolta la mancata chiusura delle labbra può in realtà essere estesa anche al palato: si parlerà allora di palatoschisi. Questo difetto embriologico può essere spesso associato ad altre sindromi più complesse. Questo difetto può anche essere riscontrato in condizioni “isolate” o non sindromiche. In questi casi è necessaria la sola operazione. È un difetto multifattoriale piuttosto frequente (1/1000). Come dobbiamo procedere?
- Si tratta di una labioschisi sindromica o non sindromica? Attraverso un RCTH o attraverso cariotipo
- Qual è il rischio di ricorrenza? Non lo possiamo sapere. La malattia non si trasmette secondo modelli di trasmissione mendeliana. Anche andando a studiare effettivamente il genoma non riusciremo a individuare i geni.
- Valutazione del rischio empirico di ricorrenza (specifico per ogni malattia). Il rischio empirico si riduce per parenti di grado superiore al I. Analizziamo la tabella. Se i genitori sono sani la probabilità che il primo figlio abbia la palatoschisi è pari all’1% (rischio di popolazione) Se il primo figlio è nato con labioschisi, il rischio che anche il secondo figlio ne sia affetto è del 40%. Se uno dei genitori è affetto, il figlio avrà il 40% di possibilità di nascere con labioschisi. Il rischio empirico è condizionato da numerosi fattori:
- numero di parenti affetti
- Gravità della malattia nei parenti affetti
- Sesso degli affetti (nel caso di malattie con incidenze diverse nei 2 sessi)
Consideriamo ad esempio la stenosi pilorica che colpisce maggiormente i soggetti di sesso maschile. In questo caso il massimo del rischio empirico sarà riscontrabile nei soggetti di sesso femminile consanguinee di malate femmine (aumento di 100 volte). Nel caso della stenosi pilorica il rischio delle parenti femmine di malate femmine aumenterà di 100 volte rispetto alla popolazione generale. Un altro esempio potrebbe essere il tumore alla mammella: è molto più diffusa nelle donne, se un uomo dovesse ammalarsi di tumore alla mammella sarebbe probabile che i parenti di questo paziente siano a rischio. STIMA COMPONENTE GENETICA La presenza di fattori genetici è dimostrata da:
- aggregazione familiare
- dati di concordanza tra gemelli MZ e DZ
- diversa frequenza in diverse popolazioni
- In numerose malattie multifattoriali il rapporto tra frequenza dei fratelli e frequenza della popolazione osserviamo che questo rapporto (λs) è sempre superiore a
- Si ha aggregazione famigliare. NB nelle malattie monogeniche come la fibrosi cistica l’aggregazione familiare è di gran lunga maggiore rispetto a quella delle malattie multifattoriali. L’aggregazione familiare è dovuta alla condivisione di geni e non dell’ambiente intrafamiliare. Nel 1995 è stato condotto uno studio su 15000 pazienti affetti da sclerosi multipla e rispettivi parenti (genitori, figli, parenti) adottivi o biologici. Fratelli adottivi di pazienti affetti da SM mantengono un rischio di ammalarsi pari a quello della popolazione generale (0,1%) e non acquisiscono quello dei fratelli biologici dei pazienti (2%).
- Anche per i caratteri discontinui facciamo riferimento ai gemelli monozigoti e dizigoti. Andiamo a confrontare i dati. Nei caratteri continui andavamo a misurare il coefficiente di correlazione. Nel caso dei caratteri discontinui andiamo a misurare la concordanza: perché la coppia sia concordante se un gemello è malato, anche l’altro deve essere malato. Se un gemello è malato e l’altro è sano, la coppia è discordante. Se la concordanza nei gemelli monozigoti è maggiore che nei dizigoti (il doppio idealmente) il carattere dipende anche da una componente genetica. Se la concordanza nei monozigoti è inferiore al 100% sono coinvolti anche fattori non genetici.
Sia per i caratteri continui che per i caratteri discontinui nelle malattie multifattoriali noi abbiamo a disposizione una serie di strumenti epidemiologici, ossia basati su studi, che ci fanno capire se i geni e i fattori genetici sono importanti e quale sia il loro peso. Una volta che abbiamo stabilito che i fattori genetici hanno un certo ruolo in una condizione multifattoriale possiamo provare a identificarli. Come si fanno a identificare? Si utilizzano dei metodi che dal punto di vista dell’analisi statistica sono molto semplici e sono rimasti invariati nei decenni, nonostante gli avanzamenti tecnologici. Il concetto di base è rimasto costante. Si esegue una metodica che si definisce analisi di associazione caso-controllo. Qual è il concetto di base quando si cerca un fattore genetico di una malattia multifattoriale? Quali sono le differenze con le malattie monogeniche e cromosomiche? Innanzitutto, presentano una differenza in termini di frequenza. Le malattie monogeniche e le malattie cromosomiche (ad esempio un riarrangiamento cromosomico) non sono malattie molto comuni, anzi, vengono considerate rare. Quindi, per capire se mi trovo davvero davanti ad una di queste due malattie cerco delle mutazioni rare perché, se queste sono molto frequenti, non possono essere responsabili della mia malattia, proprio perché è rara. Le malattie complesse, invece, presentano frequenza di 1/1000 o 1/500. Molto più alta. In più vengono caratterizzate dal fatto che la singola mutazione non sia sufficiente perché la malattia si manifesti, come invece accade nelle monogeniche/cromosomiche. Questo concetto ci permette di comprendere come uno di quei fattori (i “diavoli” citati in precedenza), che va a sbilanciare la malattia per effetto soglia, potrebbe essere ad esempio un polimorfismo comune, che, anche se di per sé non causa la malattia, avrà il suo ruolo funzionale (cambia magari leggermente la conformazione o l’espressione di un gene). Se sono presenti tanti polimorfismi posso superare l’effetto soglia e causare la malattia. Per identificare i geni causa di malattie multifattoriali si è utilizzata l’ipotesi del common diseases for common genes. La malattia è comune (molto frequente)? Si, lo è. Allora posso pensare che varianti comuni possano avere un ruolo che giustifica proprio il fatto che la malattia è comune (la variante non può essere rara, altrimenti la malattia sarebbe rara). Seguendo il concetto di common deseases common genes si è andato a studiare l’effetto di queste varianti comuni che possiamo definire polimorfismi genetici, ossia quelle varianti genetiche che sono presenti nella popolazione generale (l’AB0, ad esempio; noi inoltre sappiamo che non esiste solo l’AB0 ma che ci sono una serie di varianti comuni, i cosiddetti SNP, che nel nostro genoma sono presenti in grande quantità). Nella prima idea di applicazione il concetto di polimorfismo comune è stato applicato andando a studiare un gene alla volta. Ossia si è analizzata l’associazione caso-controllo di un gene candidato (ossia di un singolo gene). APPROFONDIMENTO. Come faccio a capire qual è un gene candidato? Per rispondere a questo quesito prendiamo come esempio ciò che accadeva negli anni 70. Il meccanismo del caso-controllo per il singolo gene ebbe molto successo per una macrocategoria di malattie multifattoriali, le autoimmuni (ossia per le quali il sistema immunitario aggredisce le cellule del proprio organismo: il self). Le cellule aggredite possono essere diverse: quelle che costituiscono la mielina (sclerosi multipla) oppure le cellule beta pancreatiche (il paziente sviluppa iperglicemia perché non produce più insulina; quindi, si va incontro al diabete di tipo 1). Può poi aggredire l’epitelio intestinale con conseguente sviluppo del morbo celiaco. Come è possibile apprezzare, i tessuti target possono essere molto distinti ma alla fine la condizione è sempre di tipo autoimmune. Se la malattia fosse autoimmune quali sarebbero, quindi, dei geni candidati? Dei geni che codificano per proteine che sono coinvolte nella risposta immunitaria.
Negli anni 70 i geni che facevano parte del processo maggiore di istocompatibilità venivano molto studiati, questo perché si studiava già a quel tempo la compatibilità dei trapianti. Questi geni, infatti, regolano la risposta immunitaria per difenderci dai patogeni ma hanno anche la capacità di riconoscere le nostre cellule qualora ci fosse un trapianto. Per questo motivo questo sistema genetico è stato tra i primi ad essere studiato. Tali geni si trovano sul braccio corto del cromosoma 6 e appartengono alla classe 1, alla classe 2 e alla 3. Codificano per proteine espresse sulle superfici di linfociti o altre cellule del sistema immunitario e interagiscono presentando il peptide antigenico ai recettori dei linfociti. Quindi hanno un ruolo chiave nella risposta immunitaria. All’epoca, quindi, per gli studi che abbiamo definito precedentemente, si aveva la fortuna di conoscerne in parte la base del polimorfismo genetico. Per questo motivo furono utilizzate le malattie autoimmuni per studiare il caso-controllo. Esempio: Nel Diabete di tipo 1 si è studiato proprio il gene del processo maggiore di istocompatibilità (HLA) DRBETA e in particolare l’allele DR3. Possiamo definirlo in maniera semplificata HLADR3. Si è condotto quindi lo studio caso-controllo con questo gene come candidato, noto per avere una risposta del sistema immunitario. I casi sono i malati e il controllo sono individui della popolazione che non hanno il diabete. Successivamente analizzo il polimorfismo, ossia l’allele DR3 e vado a vedere chi ha la presenza dell’allele (identificato con bandierina rossa) e chi presenta altri alleli, identificati con bandierina bianca. A questo punto vado a confrontare quanto l’allele DR sia presente nei casi rispetto ai sani (controllo). Faccio un semplice confronto, vedendo che la bandierina rossa è molto più presente nei malati rispetto ai controlli. A questo punto effettuo il calcolo della frequenza e ottengo: 72% nei pazienti e 39% nei controlli. Esiste una certa differenza. Devo però capire se questa differenza sia o meno statisticamente significativa. Potrebbe essere casuale oppure determinata da un fattore biologico. Quindi applico un test statistico, uno dei più semplici, il chi quadrato. Costruisco la tabella. Ossia prendo la presenza o assenza del polimorfismo DR3, presenza/assenza della malattia e costruisco una tabella che si chiama tabella di contingenza 2x2. Nella categoria A ci sono i malati positivi per il DR3, nella C ci sono i malati negativi per il polimorfismo. Poi, nella B, ci sono i soggetti positivi per il polimorfismo e negativi per la malattia (sani) e infine i soggetti negativi per il polimorfismo e negativi per la malattia (D). Combinando le quattro cellette (non chiede la formula) calcoliamo il chi quadrato e grazie a quello stabiliamo la significatività statistica (P-value). Il chi quadrato ha una sua distribuzione, la tabella fa riferimento ad un grado di libertà e la soglia di significatività è 0.005, che corrisponde ad un chi quadrato uguale o superiore a 3,84.
Cos’è successo? Si è passati dallo studio “gene candidato” ad uno studio con disegno sperimentale che prendesse in considerazione l’associazione caso-controllo di tutti i geni del nostro genoma. Immaginate la difficoltà, fino a quel momento, di azzeccare i geni associati ad una malattia con una disponibilità di 20000-25000, utilizzando un gene alla volta. Perché solo dal 2007 in avanti? Prima non era possibile dal punto di vista tecnico, perché per studiare tanti geni contemporaneamente si è dovuti passare attraverso il sistema tecnico miniaturizzato, cioè quel sistema che permette di mettere sul vetrino tanti oligonucleotidi. Questi poi li posso utilizzare mettendo una sonda perfettamente complementare ad un allele (il DR3, ad esempio) e un’altra sonda perfettamente complementare ad un altro allele (con differenze anche di un solo nucleotide in un gene). Questo sistema permette di trovare il profilo genetico di migliaia di polimorfismi in un unico esperimento, con una precisione molto accurata (mi permette di capire se un paziente ha un solo nucleotide differente rispetto ad un altro, in una determinata posizione). Di fatto i polimorfismi presenti in questi studi sono a singolo nucleotide (SNP). Noi abbiamo un miliardo di SNP, che compongono la variabilità interindividuale (0,008%). Questi sono presenti su tutti i geni in maniera abbastanza spaziata nel nostro genoma e quindi ciascun gene presenta un certo numero di SNP e sappiamo dove mappano e quali sono le sequenze alleliche. Per cui siamo in grado di creare delle sonde e per uno SNP che ha un certo numero e si trova in un certo gene (SNP x, polimorfismo ad esempio A-C) io posso disegnare una sonda che riconosca l’allele A o l’allele C e con il DNA del mio paziente sul vetrino posso determinare il suo genotipo, se AA se CC o se AC. Sul vetrino posso mettere anche un milione di sonde per vedere un milione di SNP. In questo modo ho una rappresentatività di tutti i geni del nostro genoma; quindi, non analizzo tutte le possibili varianti di ogni gene, ma ho una buona rappresentatività (di circa 1 milione) che è in grado di catturare tutta la variabilità genica del nostro genoma. Per ciascuno di questi SNP faccio esattamente quello che abbiamo visto prima, cioè una tabella di contingenza 2x2 e vedo se è presente la differenza di un allele, poi calcolo chi quadrato, P-value e odds ratio. Questo studio viene anche definito Genome wide association studies (GWAS) Risulta essere sempre uno studio caso- controllo, con la differenza che è effettuato su tutto il genoma. Funzionamento. Prendo una popolazione di pazienti, una di controlli, estraggo il DNA e lo deposito sui vetrini, dove sono depositate le sonde. Poi faccio le procedure di laboratorio, ottengo dei segnali fluorescenti che mi permettono di capire qual è il genotipo di ciascun SNP e faccio la tabella di contingenza con l’aiuto di software. Poi vado a vedere per quali polimorfismi vi è una variazione di frequenza tra pazienti e controlli.
Come faccio a vedere i risultati? Utilizzo dei grafici che si chiamano Manhattan plot. I puntini rappresentano il P-value di uno SNP. Quindi ognuno dei puntini rappresenta il confronto caso- controllo di uno degli SNP e mi indica la sua significatività statistica. Se ho una differenza significativa tra pazienti e controlli vuol dire che quel polimorfismo (quindi il gene) ha un ruolo nella suscettibilità alla malattia. I puntini sono posizionati in ordine di cromosoma, quindi sono tutti i polimorfismi su ogni cromosoma fino al 22 e i cromosomi sessuali e sull’asse delle Y c’è la significatività statistica (-log base 10 del P-value, ciò significa che se ho 7 zeri, ho il segno sul 7). Il trattino orizzontale è la soglia di significatività statistica. Gli statistici ci dicono che se noi facciamo solo un confronto, il chi quadrato di 3.84 che corrisponde a un p di 0.005 ci permette di pubblicare (perché ho significatività statistica), ma se facciamo un milione di confronti possiamo trovare un P-value di 0.005 tante volte per puro caso. Quindi se facciamo tanti controlli dobbiamo essere più esigenti e spostare l’asticella della significatività statistica. Noi possiamo pubblicare se la differenza tra pazienti e controlli ha un P- value di 8 zeri (corrisponde a 5x10^-8). Quindi, se la differenza supera questa soglia, in uno studio GWAS, i valori ottenuti ci permettono di qualificare dei polimorfismi e quindi dei geni che hanno suscettibilità nello sviluppo della malattia. Vediamo ora un esempio. Questo è il Manhattan plot del diabete di tipo
In cui possiamo vedere un picco di puntini sulla regione HLA e questo ci conforta perché vuol dire che DR3 viene fuori anche attraverso questo studio. La significatività statistica è elevata, 10^-15. Emergono, però, anche altri puntini non emersi prima degli studi di questo tipo. Ad esempio, vediamo il polimorfismo nel gene PTPN22 che codifica per una proteina tirosin- fosfatasi con polimorfismo biallelico, che è stato poi associato a moltissime malattie autoimmuni. Questa proteina ha un ruolo di regolatore negativo nell’attivazione dei linfociti T, facendo in modo che siano meno auto reattivi e che non abbiano una reazione auto immune. Le due varianti amminoacidiche cambiano leggermente la produzione di questa proteina (odds ratio 6), e questa piccola variazione ci permette di mettere questo polimorfismo tra i fattori associabili al diabete di tipo 1 e a tutta un’altra serie di patologie autoimmuni. Prima dello studio GWAS non si conosceva bene questa proteina. È stato possibile effettuare lo studio GWAS per tutta un’altra serie di malattie. Alcuni esempi sono: l’ipertensione, la malattia cardiaca, la malattia coronarica, l’altezza, ecc. A destra dell’immagine è possibile apprezzare uno studio di 5 milioni di soggetti, per cui sono stati identificati 12 mila SNP con suscettibilità in questo tratto continuo quantitativo che è l’altezza. Manhattan plot della pressione.
Noi siamo abituati a mettere a frutto le conoscenze delle malattie genetiche non soltanto per conoscere i meccanismi patogenetico, ma anche per usufruire di strumenti volti alla diagnosi della malattia(test di predizione della malattia: test di screening) In questo ultimo aspetto di screening non andiamo troppo bene: perché, mentre noi siamo abituati per le malattie monogeniche(es. corea di Hungtiton), dove se viene fatto un test genetico e questo fosse positivo la probabilità che il soggetto sviluppi la malattia è del 100%, e questo è un aspetto fondamentale dal punto di vista diagnostico. Se però prendiamo un singolo snp, ed è presente lo snp associato dei Manhattan plot che supera la soglia g-wide sui quali non si discute, poiché non sono degli snp non riprodotti ma sicuramente importanti nella malattia e se la persona ha quella variante il rischio di sviluppare la malattia è dello 0.1% se negativo è uguale. Ovvero sono varianti comuni nella popolazione generale, a basso peso, e quindi si dice che il potere preventivo è molto basso; questo è vero per la maggior parte dei polimorfismi che abbiamo identificato. Quindi al momento, parlando di polimorfismi, l’utilità clinica è estremamente limitata. Esistono un paio di esempi, fra le malattie autoimmuni (es. diabete, celiachia) che sono le uniche riguardo la pratica clinica dove possiamo usufruire delle nostre conoscenze genetiche. DIABETE TIPO I Es: ci troviamo in una famiglia dove il bambino ha già il diabete di tipo I, il fratello ha un rischio del 6% contro lo 0,4% della popolazione generale. Cosa possiamo fare in questo caso? Si può fare un’analisi degli R3 e si vede che se il fratello del bambino malato non ha gli r3 hla diverso : il rischio diventa molto più basso avvicinandosi a quello della popolazione generale, mentre se presenta gli r3 allora il rischio diventa ancora più elevata. Dunque, un paziente fratello di un bambino malato di diabete tipo I va incontro ad una serie di visite allo scopo di identificare i primi segni di malattia il prima possibile. Ovviamente per incominciare preventivamente con la terapia a base di insulina e dieta regolata. Se un soggetto è negativo per gli r3 il suo rischio è pari a quello della popolazione generale, perciò noi possiamo fare dei follow up molto più diradati nel tempo.
CELIACHIA
Es. per la celiachia questo test è ancora più utile: infatti è pure entrato, secondo le linee internazionali, nell’iter diagnostico. Nella malattia celiaca c’è associazione con HLA e l’allele si chiama DQ-2 o DQ-8, il pazienta ha un’enteropatia sensibile al glutine: ovvero se il paziente ha un allele di predisposizione HLA-DQ2 e assume glutine sviluppa dei dolori intestinali, malassorbimento e diarrea che lo portano a un ritardo di crescita (soggetto pediatrico) o perdita di peso (se adulto) e deficit metabolici o disturbi anche diversi da quelli attesi come Neurologici o Immuno- deficienza. Questa malattia che ha una frequenza molto elevata, 1%, presenta una terapia molto chiar, semplice (non per il soggetto affetto) e risolutiva: l’eliminazione drastica e totale del glutine dalla dieta. Questo porta alla remissione completa della malattia e l’epitelio torna ad essere in funzione. Analizzando una famiglia vediamo che il fratello o figlio di un soggetto con la celiachia ha un rischio del 10% mentre nella popolazione è dello 0,5%. Ma se il parente non ha l’allele in questione il suo rischio si azzera, perciò si può completamente evitare il follow up. Concetto del valore predittivo negativo: ovvero se il soggetto è positivo il rischio di sviluppare la malattia è del 2% perciò dovremo continuare a monitorare il paziente, MA se il paziente è negativo il rischio è dello 0%. Dunque, io posso usare il test per il suo valore predittivo negativo escludendo con una buona certezza la malattia. Per altre malattie come la Corea di Huntington invece si può usare il valore predittivo positivo. Questi valori si usano nei parenti di soggetti affetti o soggetti che iniziano a manifestare sintomi, poiché se il soggetto fosse negativo evito esami più invasivi. Nei bambini si usa anche esami immunologici con anticorpi. POLYGENIC RISK SCORE Per tutti gli altri polimorfismi si è pensato di mettere insieme tutte le informazioni dei singoli SNP, e creo uno spot di rischio genetico: cioè si va a valutare se le cento varianti per un determinato plot un soggetto quante ne ha ereditate. Per esempio, analizzando uno studio caso-controllo vediamo che i paziente hanno ereditato un numero maggiore di snp rispetto i controlli, perché calcolo i punteggi sommando le presenze delle varianti. Si può inoltre osservare come anche alcuni controlli presentano degli snp ma in numero estremamente minore rispetto i casi. Non posso usare lo score di rischio genetico poiché ha un potere predittivo basso e non si può usare in diagnosi. Queste informazioni rimangono utili per stratificare la popolazione a rischio. Con le persone ad alto rischio possiamo offrire degli strumenti preventivi (es, malattie cardiometaboliche e tumori) cioè noi possiamo classificare le persone a basso e ad alto rischio, e a quest’ultime offriamo tecniche di follow up e misure preventive come visite frequenti e/o radiografie. Se dovesse esistere una terapia preventiva sperimentale si potrebbe pensare di offrirla ai soggetti ad alto rischio. Da un punto di vista pratico ci sono vari esempi in cui possono essere applicati ma soprattutto i risultati ottenuti sono importanti perché permettono di avere informazioni su meccanismi di malattia, i bersagli terapeutici e stratificazione dei malati a fasce ad alto rischio e basso rischio genetico.
