MICROSCOPIA
Dal punto di vista strutturale, un microscopio ci permette di analizzare determinati caratteri morfologici di
cellule e tessuti vegetali, perché ci permette di aumentare l'ingrandimento per apprezzare le
organizzazioni, la morfologia e le caratteristiche delle cellule. Per scendere invece in termini
ultrastrutturali, entra in gioco la microscopia elettronica.
Il microscopio ottico, a seconda di come viene illuminato il campione, si suddivide in:
-campo chiaro (bright field), se il campione è retroilluminato
-campo scuro (dark field), il campione è illuminato lateralmente
-a fluorescenza, il campione o autofluoresce o fluoresce grazie a dei coloranti specifici
I tre elementi fondamentali della microscopia sono:
ingrandimento, è la capacità di ingrandire un'immagine, dato dagli obiettivi e dall'oculare [(ha un
ingrandimento fisso di 10x), quindi l'ingrandimento tot sarà dato da ingrandimento obbiettivo x
10];
potere di risoluzione, capacità di distinguere de punti vicini come due immagini distinte;
contrasto, dovuto al passaggio dei fotoni attraverso il preparato. Nella maggior parte dei
componenti cellulari e tessutali (sopratutto vegetali), il contrasto è basso perchésono molto
idratati, quindi possono essere usati dei coloranti selettivi che permettono di aumentare il
contrasto.
Nel microscopio ottico la sorgente luminosa raggiune il campione dal basso, e i fotoni che la
costituiscono devono attraversare il campione per poterlo osservare. L'immagine che viene restituita dal
microscopio è RIBALTATA!
Manopole del microscopio:
-macrometrica, regola avvicinamento del tavolino all'obiettivo, per una messa a fuoco grossolana;
-micrometrica, messa a fuoco più precisa, con movimenti più fini;
-coassiale, per il movimento del vetrino e del preparato.
Preparato istologico
I preparati si suddividono in preparati a fresco (permette analisi morfologica in condizioni "native") e
permanenti (analisi morfologica e strutturale idi tessuti fissati in condizioni non native). La scelta tra i
due dipende da quando viene effettuata l'osservazione del preparato (degradazione ossidativa dei tessuti
e necrosi del campione) e dalla capacità di fare sezioni sottili.
I preparati permanenti permettono di ovviare a queste problematiche, mentre con le preparazioni a fresco
si può ovviare alla colorazione, per i campioni vegetali.
Per un preparato bisogna seguire dei passaggi precisi:
1)prelievo: asportazione di un frammento di tessuto da un tessuto vivo, con questo passaggio hanno
inizio i processi degradativi e autlitici, si dovrà quindi intervenire subito con la fissazione.
2) fissazione: blocca il campione allo stadio durante il quale viene prelevato. Deve essere rapida (evita
danneggiamenti del campione), garantire il blocco degli enzimi litici, non deve interferire con la
colorazione e deve avere una durata.
Può essere effettuata per via
fisica
, attraverso il congelamento, che tuttavia può creare stress da
congelamento (dato dall'aumento di volume dell'acqua), quindi vengono utilizzate sostanze come le AFP
(anti-freezing protein) o l'azoto liquido che congela rapiamentepermetendo la formazione di piccoli
cristalli che evitano il danneggiamento dei tessuti. In questo caso viene utilizzato il CRIOTROMO,
un'affettatrice che lavora a -20, o il VIBRATOMO, capace di tagliare sezioni senza dover includere il
campione.
