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Tecnica che permette l’osservazione al
microscopio di preparati cellulari o tissutali
Ricavare dal campione sezioni di pochi Ricavare dal campione sezioni di pochi
micrometri di spessore che possano essere micrometri di spessore che possano essere
attraversate dalla luce del microscopio attraversate dalla luce del microscopio
ottico (osservazione in trasparenza) senza ottico (osservazione in trasparenza) senza
sovrapposizione di piani visivi sovrapposizione di piani visivi
MICROSCOPIA OTTICA
Allestimento
di
campioni
istologici
- Rendere il preparato stabile nel tempo,
prevenendo fenomeni di autolisi o diputrefazione (fissazione).
- Includerlo in un materiale di
compattezza adeguata, in modo dapermetterne il sezionamento(inclusione).
- Ricavarne sezioni di 5-
m di
spessore (taglio).
- Applicare colorazioni in grado di
differenziare i diversi componenti erendere possibile l’osservazione
al
M.O
(colorazione).
SCOPO DELLA FISSAZIONE
Immobilizzare i costituenti cellulari del campione inuno stato più
possibile simile a quello dei tessuti in
vivo
Conservare i tessuti evitando l’attacco di batteri emuffe, che distruggerebbero le strutture cellulari
Consentire al preparato di sopportare gli stress fisicie chimici delle fasi successive
Mantenere il più
possibile la reattività
enzimatica
della cellula (possibile solo in parte)
FISSAZIONE
CHIMICA
FISSAZIONE
FISICA
- Evita il rigonfiamento e ilcollassamento dei tessuti -
Soluzioni isotoniche
pH fisiologico
- Evita fissazione ed inclusionenelle preparazioni estemporanee -
Calore
Disseccamento
Congelamento
TIPI DI FISSATIVI CHIMICI
Fissativi primari coagulanti:
Etanolo,Cloruro di
mercurio, Triossido di cromo, Acido picrico**
Fissativi primari non coagulanti:
Formalina,Tetrossido di Osmio,Bicromato dipotassio, Acido acetico*
Miscele:
Fissativo di Bouin, fissativo di Carnoy
*** Fissativi additivi**
MISCELE DI FISSAZIONE
Liquido di Bouin -
miscela più
utilizzata
acido picrico 15p, formalina 5p, acido acetico 1p
molto penetrante
usato anche per pezzi voluminosi
Liquido di Carnoy -
usato per fissare cellule isolate
etanolo 6p, cloroformio 3p, acido acetico 1p
DISIDRATAZIONE ED
INCLUSIONE IN PARAFFINA
INCLUSIONE:
consiste
nell'inglobare
ed impregnare il tessuto in paraffina, oin una qualunque resina sintetica. Occorre
interporre
una
fase
di
disidratazione
(scala
ascendente
di
alcoli) seguita da un procedimento disostituzione
del
disidratante
con
un
agente chimico (xilolo) compatibile conil
mezzo
di
inclusione
(paraffina),
procedimento
che
rende
anche
il
campione trasparente (diafanizzazione). Il
tessuto
viene
quindi
immerso
in
paraffina fusa, fino a quando questaavrà sostituito completamente lo xilolo(inclusione). Raffreddando
infine
la
paraffina,
il
tessuto
risulterà
inglobato
e
completamente
impregnato
dalla
paraffina stessa.
Paraffina
Blocchetti pronti
per essere
tagliati in
sezioni
Il microtomo
Taglio del preparato incluso e posizionamento delle sezioni
sul vetrino
Pulire accuratamente dei vetrini porta oggetti e strisciarci una
piccola quantità
di albumina glicerinata
(50% albume d’uovo e 50% glicerinata).
Fissare il preparato incluso in paraffina su una basetta di legno o sulleapposite formine scaldando la parte inferiore del preparato
.
Togliere con la lametta l’eccesso di paraffina che circonda il preparato inclusoregolarizzandone la forma che dovrà
essere a sezione trapezioidale.
Inserire la basetta con il preparato nella morsa porta oggetto del microtomo
.
Sezionare con il microtomo il preparato incluso, in fette (possibilmente)seriate, di spessore variabile (normalmente 8-
m).
Portare a 37°C il bagnetto stendifette.
Tagliare le fette che dovranno presentarsi come un nastro (4-5 fette
seriate). Separare con l’aiuto di una lametta le fette da fissare su un singolovetrino. Raccogliere le sezioni con una pinzetta ed adagiarle su
una vaschetta
contenente H
2
O distillata a 37 °C. Raccogliere le sezioni con il vetrino porta-
oggetti e po
sizio
narle bene, aiutandosi con un pennellino morbido. Porre il
vetrino con le sezioni sopra una piastra riscaldata (37°C), per consentirel’evaporazine
dell’acqua e la perfetta adesione delle sezioni
al vetrino stesso.
In alternativa: Poggiare il vetrino porta oggetti su una piastra (37°C) e aggiungervi pochegocce di acqua.Tagliare
le fette che dovranno presentarsi come un nastro (4-
5 fette seriate). Raccogliere il nastro delicatamente con un pennellino morbidoe passarlo sul velo di acqua presente sul vetrino porta oggetti aspettando cheil velo d’acqua evapori.
Procedimento che aumenta il
contrasto tra le diverse strutture cellulari, tale da
permetterne il riconoscimento nelle sezioni istologiche.
COLORAZIONE
COLORANTI
Si classificano per la natura del cromoforo(anello chinonico, azo-gruppo -N=N-) e perla carica (+BASICI, - ACIDI, NEUTRI)
Basofilia ed Acidofilia delle struttureistologiche
