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MICROSCOPIO ELETTRONICO MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE (SEM)
Tipologia: Appunti
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ANALISI MICROSCOPICHE-Biggiogera 29.10.
MICROSCOPIO ELETTRONICO
Quello che abbiamo visto sino ad ora ha riguardato la microscopia ottica. Per aumentare la risoluzione dobbiamo sfruttare un altro tipo di fonte luminosa. Se passiamo dal visibile/uv ad una lunghezza d'onda più piccola utilizzeremo la microscopia elettronica, che sfrutta un fascio elettroni, i quali hanno lambda(lunghezza d’onda) estremamente ridotta. Otteniamo una risoluzione atomica.
La microscopia elettronica è nata nel '32. Un dottorando inventò un modo per condurre e controllare un fascio di elettroni e ottenere una risoluzione maggiore. Il microscopio elettronico è molto grande e pesante. Perché pesa così tanto? Basandosi su fasci di elettroni, le componenti del microscopio sono specifiche per condurre tali elettroni senza che essi perdano energia. Ogni microscopio ha una sorgente di energia, lenti per ingrandire e un oculare/schermo per visualizzare l’immagine. Nel microscopio ottico c’è lampadina/led, un condensatore per avere un fascio riunito di fotoni, poi il nostro campione, l’obiettivo, e l’immagine finale.
Il microscopio elettronico a trasmissione è analogo. “Trasmissione” significa che la mia immagine si forma perché io guardo per trasparenza la mia sezione. Comunque anche qui c’è una sorgente di energia, il campione, uno schermo; tuttavia ci sono anche delle differenze. Partiamo dalla generazione del fascio di elettroni. (Vedi disegno). Si usa un filamento di tungsteno che viene surriscaldato (viene portato al calor rosso), infatti così è pronto per emettere elettroniÈ un catodo. Sotto viene messo un disco con un buco che funge da anodo e poi si applica differenza di potenziale di 60-80 mila Volt, o più; si ottiene così un fascio di elettroni che vengono “sparati” fuori dall’apertura. Gli elettroni devono quindi essere "controllati". [I vecchi monitor dei pc e televisori erano proprio dei cannoni elettronici come questo sistema]. Questi elettroni creano qualche costrizione: 1.Nel loro percorso nell’aria essi perdono energia e alla fine non sono più efficacidevo togliere l’aria.
Questo sistema di microscopia elettronica gioca sulla lambda(λ) per le analisi ad alta risoluzione: d=λ/2n sinα
Dallo schema potete notare gli avvolgimenti metallici. Per evitare la perdita energetica si deve creare un sottovuoto grazie a sistemi di pompe collegate direttamente alla colonna che evacuano costantemente l’aria( anche fino a 90 litri al minuto). Bisogna continuare a togliere aria per tutto il tempo perché c'è il campione da analizzare, e questo se viene attraversato dal fascio di elettroni si surriscaldaalcune particelle si carbonizzano e volatilizzano, risalgono fino a depositarsi sul filamento di tungsteno danneggiandolo. Quindi c'è bisogno di pompe esterne, e già questo rende il microscopio ingombrante. Gli avvolgimenti sono in metallogrande e pesante, e costoso.
Ci sono sistemi di sicurezza come la camicia d'acqua che ha il compito di disperdere il calore generato. Tra l’altro, non è neanche molto distante dalla zona in cui viene generata la differenza di potenziale, perciò bisogna stare sempre molto attenti ad eventuali danni. Comunque, con la microscopia elettronica si ottiene una risoluzione di 0,2 nm. Il filamento di tungsteno dura minimo 40 ore, fino a qualche mese. Più stabili sono i cristalli di esaboruro di lantanio, estremamente brillanti e che durano un paio d'anni. Altri sistemi sono ad emissione di campo. Il voltaggio normale è attorno ai 100kV, l’alto voltaggio arriva fino a 300kV per permettere agli elettroni di penetrare di più. Noi sappiamo che i fotoni(luce) viaggiano in linea retta. Gli elettroni no, viaggiano a spirale, per cui la focalizzazione del fascio di elettroni è più complessa. Inoltre devono attraversare il nostro campione, per cui questo deve essere estremamente sottile, nell'ambito dei nanometri(sezioni tradizionali sono di 60-80 nm). È uno spessore standard che si può ottenere solo se il campione è in grado di essere sezionato in maniera così sottile. Il materiale deve essere reso elastico( le strutture cellulari devono poter tornare alla loro forma originaria), e infatti si usano resine plastiche ed elastiche, solitamente le epossidiche e le acriliche. Immaginiamo di avere una resina epossidica( molto viscosa e appiccicosa). Quando riesce a penetrare nel tessuto contrae dei legami covalenti per esempio con le proteine, così quando io seziono il campione si riesce ad evitare malformazioni, ottenendo una superficie liscia. Invece le resine acriliche semplicemente avvolgono le strutture cellulari e la sezione ottenuta non ha una superficie sempre liscia. (Vedi disegno). Perché usarle entrambe? Hanno effettivamente due utilizzi molto differenti, per esempio gli elettroni passeranno molto più facilmente attraverso la sezione che ha la superficie più liscia, perciò le resine epossidiche sono ottimali per studi sulla morfologia. La resina deve anche essere molto resistente, considerando che l’energia potenziale che si sviluppa sul campione con soli 60kV equivale ad una piccola bomba nucleare. Cosa succede se si ha interazione del campione con un fascio di elettroni? 1 .Il campione si scalda(baking superficiale); 2 .Alcuni elettroni semplicemente attraversano la sezione senza interferenze, e si vedranno come punto luminoso sullo schermo( microscopia a trasmissione); 3 .altri elettroni vengono bloccati da atomi di metalli pesanti e riflessi da un altro lato nel fondo dello schermo (punto scuro); 4 .altri elettroni vengono assorbiti dal campione, per cui spariscono; 5 .altri ancora passano e vengono deviati senza perdere energia ( in maniera elastica) o con perdita di energia (non elastica). 6. ci sono elettroni secondari che vengono colpiti da altri elettroni e vengono spostati; 7 .altri elettroni colpiscono il campione e tornano indietro; 8 .catodoluminescenza;
Riassumendo per la microscopia a trasmissione: 1.risoluzione fino a 0.2nm; 2.rivelazione di singole molecole; 3.possibilità di effettuare colocalizzazione( posso vedere due cose allo stesso momento); 4.ingrandimenti fino a 100000x
In questa immagine si può notare l’RNA nascente dal DNA.
Quindi in conclusione la microscopia a trasmissione è un sistema diretto che ci permette di ottenere un’indagine morfologica o citochimica di ciò che c’è dentro il campione.
Però con un’altra tecnica si può vedere la scansione di una superficie: microscopia elettronica a scansione ( SEM , non più TEM). Si usa il fascio di elettroni che si fa vibrare lungo una superficie e si lavora con quelli che vengono riflessi. Qui noi prendiamo la risposta degli elettroni che vengono riflessi, non si vede attraverso. Il campione deve essere reso “a specchio”. Il campione non necessariamente deve essere sottilissimo, si possono prendere anche insetti interi per esempio. Dopo la fissazione viene fatta evaporare una nuvola di metallo pesante (normalmente oro) che riesca a ricoprirlo. La risoluzione comunque non è eccezionale come l'altro, è minore. I campioni devono essere fissati assolutamente asciutti, e devono essere appunto coperti con metalli pesanti. Com’è fatto un microscopio di questo tipo? Presenta una colonna molto più grande e infatti si possono usare oggetti più grandi. Il vuoto è anche minore, ci possono essere alcuni microscopi elettronici più piccoli che lavorano a pressione quasi normale, che permettono osservazioni dirette, a fresco. C'è un detector secondario degli elettroni. Un avvolgimento(scanning magnet) permette di far muovere il fascio di elettroni “a scansione”, copre tutto il campione linea per linea in modo da ottenere un’immagine puntiforme.
Che immagini danno? Informazioni di superficie, praticamente 3D. Profondità di fuoco notevole: è tutto messo a fuoco. Cosa ricaviamo quindi? La superficie di un oggetto, infatti noi non vediamo dentro (!).
È usata spesso in scienze dei materiali per vedere per esempio se ci sono difetti nelle leghe metalliche.
Sia in trasmissione che in scansione può esserci un tipo di interazione degli elettroni che genera raggi X. E’ un fenomeno analogo alla fluorescenza. Ricorda che in microscopia a fluorescenza se si eccita una molecola con legami insaturi un elettrone passa all’orbitale successivo e poi torna a quello fondamentale rilasciando energia ad una diversa lunghezza d’onda. Nel caso di questa microscopia un elettrone ad altissima energia può colpire un atomo,fargli aumentare energia, e poi fargli emettere raggi X. La lunghezza d’onda emessa è dipendente dall’elemento chimico che sto osservando. Per esempio il calcio emette a 300, il magnesio a 320; se ho un analizzatore di raggi X si può capire cosa c'è e dove. E’ sia un’analisi quantitativa che qualitativa. Si ottengono degli spettri di emissione.
Il detector di questo sistema è una finestrella di berillio, che riesce a riconoscere solo elementi più pesanti di sé, cioè da sodio in poi. E’ un sistema piuttosto efficace, però per queste analisi bisogna avere degli accorgimenti, perché se per esempio volessimo valutare il rame, non dovremmo usare come portacampione le reticelle fatte in rame perché darebbe dei risultati errati; un'opzione sono le reticelle fatte di nylon, che invece contengono molto alluminio.