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LEZIONE #1 CITOLOGIA
Prof. F. Klinger– 29/03/2021 (14.00 - 16.00) – Sbobinatore: Luana Vangjeli, Revisore: Mariagrazia Venditti
LA CELLULA
Da una parte abbiamo i procarioti, mentre le cellule che andremo a trattare sono cellule eucariotiche. I procarioti hanno diverse forme e diverse dimensioni, ma sono anche delle cellule relativamente semplici in quanto hanno una parete che li riveste formata da una membrana e da una capsula, un materiale genetico sparso dentro uno spazio all’interno del batterio e poi anche delle protrusioni esterne come per esempio i flagelli. Questo fa da contrasto alla complessità delle cellule eucariotiche, le quali presentano un nucleo che racchiude il materiale genetico; abbiamo una serie di organuli come ad esempio lisosomi, mitocondri che medieranno delle funzioni cellulari; un sistema interno di membrane fatto da reticolo endoplasmatico, complesso del golgi, i mitocondri che sono degli organelli deputati alla sintesi di energia che fa funzionare la cellula e un citoscheletro ovvero una parte dello scheletro che mantiene la struttura cellulare. Infine tutto ciò non è un’entità assestante, isolata dall’ambiente esterno ma continuerà ad interagire con l’ambiente esterno attraverso vari meccanismi, in particolare meccanismi di eso ed endocitosi. CELLULA EUCARIOTICA Ci sono diverse teorie evolutive che spiegano la formazione di una cellula eucariotica, per esempio per quanto riguarda come si è formato il nucleo e come si è formato il sistema di membrane all’interno della cellula possiamo vederlo in questa immagine. Noi abbiamo una cellula procariotica che contiene un suo DNA e i ribosomi che sono delle particelle che permettono la trascrizione da parte del DNA ad RNA messaggero e a proteina. Si può immaginare l’evento di una invaginazione della membrana che è andata quindi a racchiudere il materiale genetico formando un nucleo, rimanendo poi con delle porzioni sempre di questa invaginazione che hanno creato il reticolo endoplasmatico. Questo avviene perché effettivamente c’è un continuo flusso in entrata e in uscita di vescicole dal sistema di membrane quindi nel reticolo endoplasmatico e l’apparato di golgi verso l’esterno e così come il materiale viene scambiato dall’esterno verso l’interno mantenendo quindi un continuo flusso che potrebbe equivalere ad avere un materiale abbastanza simile da una parte e dall’altra. Per quanto riguarda invece i mitocondri si pensa di più a una teoria evolutiva di endosimbiosi, cioè il mitocondrio in realtà si pensa sia stato un batterio che poi è stato fagocitato, inglobato all’interno di una cellula eucariotica che si stava sviluppando e da quel momento in poi è rimasto all’interno della cellula portando in questo modo ad un vantaggio sia per la cellula che per il mitocondrio.
METODI PER STUDIARE LE CELLULE E I TESSUTI
I viologi si dividono in diverse categorie a seconda della tecnica elettiva che sfrutteranno e gli istologi utilizzano di preferenza il microscopio. Quindi noi pensiamo di poter utilizzare dei metodi morfologici e dei metodi biochimici/biomolecolari. I metodi morfologici si avvalgono della visione delle cellule e dei tessuti utilizzando per esempio il microscopio e le tecniche di diagnostica per immagine. Per quanto riguarda il microscopio, il primo microscopio costruito e che ha permesso di descrivere un tipo cellulare risale al 1665 utilizzato da Robert Hooke. Ovviamente nel corso della storia il microscopio si è evoluto. Il secondo microscopio sembra più complesso perché in realtà è dotato di braccia meccaniche che permettono la lavorazione delle cellule direttamente sotto al microscopio. Da un punto di vista funzionale possiamo distinguere due tipi di microscopi:
- Microscopio ottico (MO)
- Microscopio elettronico (TEM) Per quanto riguarda il microscopio ottico, il principio per cui andremo ad osservare le cellule e i tessuti si basa sull'utilizzo di una luce nello spettro del visibile prodotta da una lampadina che illuminerà il campione e ci permetterà la sua osservazione al microscopio. Il microscopio elettronico ha una base fondamentalmente simile, ma la luce che viene sfruttata è invece fornita dagli elettroni, quindi non si ha una lampadina ma degli elettroni che andranno a colpire il campione. Perchè ho bisogno del microscopio e non posso guardare direttamente con gli occhi cellule e tessuti?
dove: r sta per il potere di risoluzione λ lambda è la lunghezza d’onda della luce visibile. Si ricordi che il microscopio ottico si basa su una luce che va a colpire il campione. Questa luce è una luce visibile che ha una lunghezza d’onda che può variare dai circa 400 ai 700 nm. n è l’indice di rifrazione del mezzo α è l’apertura angolare della lente Cosa vuol dire indice di rifrazione del mezzo? Abbiamo il nostro campione e l’obiettivo che colpisce il campione. Tra l’obiettivo e il vetrino c’è uno spazio che ci sarà sempre perchè la lente dell’obiettivo non va a toccare il campione, sennò si rovina. Questo spazio è il mezzo e l’indice di rifrazione è quindi un valore che sarà 1 per l’aria. Questo spazio può essere riempito in laboratorio utilizzando dell’olio minerale, non vegetale che ha un indice di rifrazione leggermente diverso, pari a 1,5. Per cui posso anche descrivere tale equazione mettendo un valore dato appunto dall’indice di rifrazione e sen α come NA. Perché questi valori possono in qualche modo interferire con potere di risoluzione? Esempi: 0,61 è un numero fisso. La lunghezza d’onda della luce è 530; l’indice di rifrazione è l’aria e la lente ha come valore 0,94 come apertura angolare. Per cui il potere di risoluzione, cioè la distanza per cui due punti sono definiti come distinti è di 344 nm. Ci sono anche cellule abbastanza grandi che possono essere viste con l’occhio umano. Quando però parliamo della stragrande maggioranza delle cellule eucariotiche, abbiamo bisogno di un microscopio ottico. Alcuni organelli come il nucleo o i mitocondri sono visibili al microscopio ottico. Per tutto ciò che è più piccolo come proteine, lipidi, ribosomi, virus abbiamo bisogno di un altro tipo di microscopio che è il microscopio elettronico.
Il microscopio elettronico ha un potere di risoluzione che arriva fino a 0,4 nm quindi molto più piccolo del microscopio ottico. Esempio di differenza tra il potere di risoluzione e l’ingrandimento: Tra (a) e (b) è cambiato il potere di risoluzione. Mentre tra (b) e ( c) quello che cambia è semplicemente l’ingrandimento. Non sono stati aumentati i dettagli delle strutture, sono assolutamente identiche solo più grandi. PRINCIPIO DEL FUNZIONAMENTO SIA DEL MICROSCOPIO OTTICO CHE DEL MICROSCOPIO ELETTRONICO Nel microscopio ottico abbiamo una sorgente che è quella che emetterà la luce, normalmente fatta da una lampadina. Questo fascio di luce passerà attraverso delle lenti che lo fanno arrivare al campione. La luce oltrepassa il campione, viene raccolta da una serie di obiettivi fino a raggiungere l’occhio. Lo stesso principio è quello che sta alla base del microscopio elettronico, solo che invece della sorgente luminosa ci sarà un filamento di tungsteno. Questo filamento di tungsteno fa partire un fascio di elettroni condensati fino a colpire il campione e questi elettroni vengono poi convertiti dopo aver colpito il campione e raggiungeranno anche qui un computer, schermo fotografico o qualcosa di simile. Nella microscopia ottica abbiamo anche delle possibilità di osservare oggetti in maniera diversa. Il microscopio più utilizzato sarà questo: Microscopio con una lampadina che si accende con un interruttore normale e questa luce colpisce il campione posizionato sul piano nero. La luce poi passa attraverso un campione e l’immagine arriva agli obiettivi. Gli obiettivi hanno la possibilità di ingrandire l’immagine, quindi è una questione di ingrandimento ma non di aumentare il potere di risoluzione. Dopodichè l’immagine arriva ai nostri occhi tramite l’uso dell’oculare. La messa a fuoco viene fatta attraverso due manopole: la
però di vivo dentro la cellula, sono spesso degli artefatti, delle polveri che vanno a finire sul vetrino per cui invece si usano delle tecniche più fini dove si utilizza un fluorocromo chimico o naturale che va a legarsi ad una molecola che vogliamo studiare e una volta avvenuto il legame renderla fluorescente. Per far sì che avvenga questo legame in istologia ma anche in molte tecniche di laboratorio si utilizza un concetto di base di immunologia, perchè con questo principio di immunologia ho un riconoscimento quindi un legame preciso di una cosa verso l’altra, cioè di un anticorpo contro un sito antigenico che sarà unico. Non avrò possibilità di confondere il fatto che quindi quella molecola fluorescente sia andata a legarsi a qualcosa di sbagliato. Se io ho un anticorpo, questo anticorpo ha la capacità di riconoscere un sito antigenico e solo quello, presente su una molecola che io voglio identificare. Questa è la base per la tecnica di immuno-fluorescenza dove a questo anticorpo lego una molecola fluorescente e nel momento in cui l’anticorpo riconosce il sito antigenico della mia molecola da identificare, anche tutto questo complesso diventa fluorescente quindi lo posso vedere con un microscopio a fluorescenza. All’anticorpo oltre che al fluorocromo io posso anche legare una molecola colorabile. Succede che l’anticorpo lega il sito antigenico e tutto il complesso anticorpo anticorpo sostanza e il nostro sito antigenico diventano tutti dello stesso colore, diverso da tutto il resto della cellula. In questo caso quindi posso aumentare anche la tecnica dell’immuno-fluorescenza, renderla ancora più fine utilizzando un anticorpo primario che legherà un certo antigene e un anticorpo secondario che presenta il fluorocromo. Quando questo legame avviene tutto il complesso diventa fluorescente ed è visibile al microscopio elettronico. Questo è un pò il risultato: Come prima è stato utilizzato un fluorocromo per identificare il nucleo, un anticorpo che va a riconoscere delle proteine del citoscheletro e con la tecnica della immuno-fluorescenza si è riusciti ad
identificare tutte queste strutture filamentose in verde che sono tipiche del citoscheletro. Con il fluorocromo rosso, perchè si possono usare vari colori, si va a riconoscere un’altra classe di molecole presenti sempre nel citoscheletro che hanno una forma e localizzazione diversa rispetto a quelle verdi. Se uso un fluorocromo dovrò usare un microscopio a fluorescenza, se invece uso una molecola colorata ma non fluorescente utilizzerò poi per la visione un microscopio in campo chiaro. Posso anche usare la tecnica basata sull’anticorpo e l’antigene nella microscopia elettronica a trasmissione. Questa è un’altra cellula dove in blu viene identificato il nucleo dove sta avvenendo una divisione cellulare e quindi sono localizzati i cromosomi. Tutto il citoscheletro, in particolare i microtubuli del citoscheletro sono impegnati nella divisione cellulare e sono localizzati in questa struttura che va a formare il fuso mitotico. Ovviamente non guardo solo il nucleo e il citoscheletro ma posso andare a vedere il reticolo endoplasmatico, l’apparato di Golgi, i lisosomi, i centrioli, i mitocondri. Quindi a seconda della proteina che io voglio vedere utilizzerò anticorpi diversi che mi vanno a indicare dove è localizzata nel citoplasma la mia molecola. Andiamo a vedere il tipo di immagine che viene fuori quando si guardano le cose al microscopio. Questo è come appare un microscopio a contrasto di fase e il contrasto di fase permette in realtà di studiare cellule vive, quindi dove potrò andare a vedere il nucleo (la palletta centrale) vedo il bordo
Questo è lo stesso tipo cellulare, un ovocita visto con il contrasto di fase e con il microscopio ad interferenza. Sicuramente tutte e due danno informazioni, a seconda poi del tipo cellulare di che cosa voglio vedere preferirò un microscopio rispetto ad un altro. Questo è un altro tipo di cellula, di nuovo dove fa vedere la differenza tra una cellula in campo chiaro o con il contrasto di fase oppure con il microscopio ad interferenza di fase. Questo microscopio guardando l’immagine è sempre più o meno come quello che abbiamo visto all’inizio, c’è la lampadina, il campione, gli obiettivi, l’oculare. Sicuramente può sembrare più moderno e nuovo, ma questa è la telecamera (in alto) con cui si fanno le foto, mentre a destra in nero è probabilmente un’altra fonte di luce che si può aggiungere al microscopio senza dover per forza avere microscopi tutti separati. Infatti per esempio il microscopio a fluorescenza presenta sempre la lampadina, gli obiettivi e l’oculare, telecamera collegata al computer e questo apparecchio qua dietro (in nero) è invece proprio la lampada a fluorescenza perchè io in fluorescenza devo emettere delle lunghezze d’onda leggermente diverse da quelle del visibile della lampadina normale. Quindi ho bisogno di una
lampadina che emetterà quindi delle lunghezze d’onda che vanno a colpire sempre il campione e io poi le osservo. esempi di immuno-fluorescenza: Posso variare con i colori, posso usare fluorocromi diversi insieme o più comunemente si usa sempre un fluorocromo per il nucleo e poi quello che voglio studiare. MICROSCOPIO CONFOCALE Infine l’ultimo tipo di microscopio che è un pò più sofisticato rispetto agli altri, perchè ha una differenza rispetto a tutto quello che abbiamo visto fino adesso. Il microscopio confocale diciamo che produce delle sezioni ottiche per cui una volta che ho acquisito queste sezioni io posso tramite il computer fare una ricostruzione tridimensionale, quindi ricostruire la cellula, il nucleo, il mitocondrio e orientarmi di più nello spazio. Quindi che cosa fa? Supponiamo che questa sia la nostra cellula (pallina verde) il microscopio confocale ha la possibilità di acquisire immagini nell’asse della Z, cioè prende un’immagine sopra l’inizio della cellula, poi un pò più sotto e più sotto ancora al centro, fino ad arrivare nella porzione terminale. Il computer prende tutte queste immagini e ci fornisce una ricostruzione tridimensionale della nostra cellula o del nostro organello. Quindi da sicuramente un’informazione maggiore rispetto a un'immagine piatta bidimensionale che vediamo sempre e solo con i vari microscopi, sia che sia a fluorescenza che sia a contrasto di fase, comunque è bidimensionale. MICROSCOPIO ELETTRONICO A TRASMISSIONE
Con il microscopio elettronico posso però andare a vedere molecole molto più piccole di una cellula. Quindi per esempio posso vedere dei Proteoglicani, cioè una asse proteica a cui sono legati tutte queste specie di cose che sbucano fuori che sono degli zuccheri. Oppure questa è la Laminina, un’altra proteina abbastanza grande però le dimensioni sono nell’ordine dei nm. MICROSCOPIO ELETTRONICO A SCANSIONE Il microscopio elettronico a scansione è simile al microscopio elettronico a trasmissione, abbiamo il fascio di elettroni che entra e l’immagine analizzata poi dal computer. La differenza è che il campione è lì sotto, il fascio di elettroni arriva e non passa attraverso il campione, si vede che questo fascio di elettroni viene rimbalzato dal campione e quindi noi avremo un campione che non viene sezionato. Da qui la differenza detta prima della morfologia interna e della morfologia esterna e infatti il linfocita di prima che io vedo con il microscopio a scansione è questo:
Una cellula con una serie di protusioni sulla membrana e una serie di filamenti che gli permettono il movimento. Questo è un capello al microscopio elettronico a scansione: Questa è un’immagine quasi tridimensionale dell’esterno delle cellule, non riesco a capire come sono fatte dentro, le vedo solo da fuori. Questa è una cellula uovo circondata da cellule follicolari. Posso vedere anche oggetti un pò più grandi come in questo caso una formica Vediamo nelle immagini seguenti il paragone fra microscopio elettronico a trasmissione e a scansione dell’immagine di un mitocondrio:
