Microscopia: Tipi e Tecniche | Schemi e mappe concettuali di Biologia

Microscopia

Lo scopo della microscopia è quello di ingrandire campioni di tessu4 per analizzarli sia dal punto di vista

morfologico/stru9urale che dal punto di vista biochimico/funzionale.

Per eﬀe9uare un’analisi morfologica vengono u4lizza4 microscopi ele9ronici, microscopi oAci e

citoﬂuorimetri.

Il microscopio o-co composto

L’obieAvo viene messo a corta distanza focale e l’obieAvo viene posto appena al di là del fuoco, ciò fa si che

tra i due gruppi dio9rici (lente dell’oculare e lente dell’obieAvo) venga a formarsi un’immagine reale

ingrandita e capovolta, de9a immagine intermedia (IR).

Se l’oculare viene posto in modo che l’IR cada all’interno della sua distanza focale, si oAene un’immagine

secondaria de9a virtuale ancora ingrandita ma capovolta rispe9o al campione.

Il rapporto tra le dimensioni dell’immagine ﬁnale e quelle dell’ogge9o ci dice di quanto è stato ingrandito.

Il potere di risoluzione, ossia la capacità di dis4nguere separatamente due pun4 molto vicini, ad un certo

punto sme9e di crescere, secondo la legge di Abbe, che indica il limite di risoluzione (R=lambda/2n*sen

alfa) dove lambda è la lunghezza d’onda della luce, n è l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra ogge9o

e lente e alfa è il semiangolo di apertura della lente obieAvo.

Qualsiasi sistema di len4 venga usato non si possono dis4nguere come separa4 due pun4 che distano tra

loro meno di 0.2 micrometri quindi l’ingrandimento u4le forrnito da un microscopio oAco è di circa mille

volte (1000x) e il suo potere risolu4vo è di 0.2 micrometri.

Per poter aumentare il limite di risoluzione bisogna, non potendo intervenire su alfa, interporre tra lente

dell’obieAvo e campione una goccia d’olio con n simile a quello del vetro (circa 1.5) facendo così

un’osservazione microscopica ad immersione che aumenta il limite di risoluzione a 0.1micrometri, in

alterna4va si può agire su lambda andando a lunghezze d’onda minori u4lizzando la radiazione ultraviole9a

che comunque raggiunge un limite di risoluzione di 0.1 micrometri, valore che rappresenta il limite estremo

della microscopia oAca.

Microscopio a contrasto di fase

Viene usato per evitare di alterare la morfologia del campione mediante coloran4, e si basa sul fenomeno

dell’interferenza luminosa.

Si basa sull’u4lizzo di diaframmi per deviare le onde della fonte luminosa andando a creare un anello di

fase.

Su questo l slide di papa sono meglio del libro, guardatelo li che capite meglio.7

Microscopio interferenziale di Normaski

U4lizza la luce polarizzata e, tramite il prisma di Wollaston, questa viene divisa in due raggi luminosi

divergen4 tra loro di una piccola distanza compresa tra 1 e 0.1 micrometri, in questo modo un raggio

colpisce un punto del campione e l’altro un punto vicino.

Successivamente tramite un second prima di Wollaston i due raggi vengono faA interferire creando cosi

un’immagine simile a quella del microscopio a contrasto di fase ma con un eﬀe9o tridimensionale

aumentato.

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Microscopia Lo scopo della microscopia è quello di ingrandire campioni di tessu4 per analizzarli sia dal punto di vista morfologico/stru9urale che dal punto di vista biochimico/funzionale. Per effe9uare un’analisi morfologica vengono u4lizza4 microscopi ele9ronici, microscopi oAci e citofluorimetri. Il microscopio o-co composto L’obieAvo viene messo a corta distanza focale e l’obieAvo viene posto appena al di là del fuoco, ciò fa si che tra i due gruppi dio9rici (lente dell’oculare e lente dell’obieAvo) venga a formarsi un’immagine reale ingrandita e capovolta, de9a immagine intermedia (IR). Se l’oculare viene posto in modo che l’IR cada all’interno della sua distanza focale, si oAene un’immagine secondaria de9a virtuale ancora ingrandita ma capovolta rispe9o al campione. Il rapporto tra le dimensioni dell’immagine finale e quelle dell’ogge9o ci dice di quanto è stato ingrandito. Il potere di risoluzione, ossia la capacità di dis4nguere separatamente due pun4 molto vicini, ad un certo punto sme9e di crescere, secondo la legge di Abbe, che indica il limite di risoluzione (R=lambda/2n*sen alfa) dove lambda è la lunghezza d’onda della luce, n è l’indice di rifrazione del mezzo interposto tra ogge9o e lente e alfa è il semiangolo di apertura della lente obieAvo. Qualsiasi sistema di len4 venga usato non si possono dis4nguere come separa4 due pun4 che distano tra loro meno di 0.2 micrometri quindi l’ingrandimento u4le forrnito da un microscopio oAco è di circa mille volte (1000x) e il suo potere risolu4vo è di 0.2 micrometri. Per poter aumentare il limite di risoluzione bisogna, non potendo intervenire su alfa, interporre tra lente dell’obieAvo e campione una goccia d’olio con n simile a quello del vetro (circa 1.5) facendo così un’osservazione microscopica ad immersione che aumenta il limite di risoluzione a 0.1micrometri, in alterna4va si può agire su lambda andando a lunghezze d’onda minori u4lizzando la radiazione ultraviole9a che comunque raggiunge un limite di risoluzione di 0.1 micrometri, valore che rappresenta il limite estremo della microscopia oAca. Microscopio a contrasto di fase Viene usato per evitare di alterare la morfologia del campione mediante coloran4, e si basa sul fenomeno dell’interferenza luminosa. Si basa sull’u4lizzo di diaframmi per deviare le onde della fonte luminosa andando a creare un anello di fase. Su questo l slide di papa sono meglio del libro, guardatelo li che capite meglio. Microscopio interferenziale di Normaski U4lizza la luce polarizzata e, tramite il prisma di Wollaston, questa viene divisa in due raggi luminosi divergen4 tra loro di una piccola distanza compresa tra 1 e 0.1 micrometri, in questo modo un raggio colpisce un punto del campione e l’altro un punto vicino. Successivamente tramite un second prima di Wollaston i due raggi vengono faA interferire creando cosi un’immagine simile a quella del microscopio a contrasto di fase ma con un effe9o tridimensionale aumentato.

Microscopio a fluorescenza La fluorescenza è il fenomeno per cui determinate sostanze colpite dalle radiazioni luminose eme9ono luce di lunghezza d’onda maggiore nello spe9ro del visibile. Si possono avere due 4pi di fluorescenza: naturale e secondaria Quella naturale anche de9a autofluorescenza è dire9amente prodo9a da sostanze presen4 nei tessu4 del campione, quella secondaria invece è indo9a da una colorazione (fluorcromizzazione) a9raverso coloran fluorescen4 deA fluorocromi. Esempi di fluorescenza naturale sono: la vitamina a, la riboflavina, le porfirine, le clorofille. I fluorocromi più u4lizza4 sono: l’arancio acridina affine per le nucleoproteine e gli acidi nucleici, lo ioduro di propidio che colora di rosso il DNA, il DAPI che dà un’intensa colorazione blu al DNA, la fluorescina is4ocianato (FITC) e la rodamina istocianato (TRITC) u4lizza4 per la marcatura di an4corpi. Un tempo si posizionava la lampada a vapori mercurio so9o il condensatore (ipofluorescenza) per far si che la luce ultraviole9a a9raversasse il preparato eccitandolo, ma per evitare danni alla vista lòa luce ultraviole9a veniva bloccata prima di arrivare all’oculare da apposi4 filtri di sbarramento. A9ualmente si preferisce il sistema denominato epifluorescenza che eccita il preparato dall’alto, mediante una lampada al mercurio, argon o xenon, di un filtro di eccitazione, un filtro di sbarramento e uno specchio dicroico. Gli obieAvi più adaA alle osservazioni in fluorescenza sono gli obieAvi a fluorite.

Microscopio confocale

Il preparato nella microscopia oAca tradizionale viene diviso in sezioni soAli, quanto più è soAle la sezione più è ni4da l’immagine, ma si perde così la tridimensionalità dell’immagine. Il microscopio confocale risolve questo problema andando ad analizzare le varie sezioni una alla volta anche se sovrapposte escludendo quelle so9o e sovra fuoco. Il sistema somiglia a quello del microscopio ad epifluorescenza: la fonte luminosa è un raggio luminoso concentrato in un foro confocale la cui immagine, riflessa da uno specchio dicroico viene focalizzata solo in un punto preciso dell’ogge9o. La qualità più importante del confocale è che perme9e di esaminare campioni in vivo, in quanto viene spesso u4lizzata la GFP (green fluorescent protein) che è una molecola fluorescente vitale al contrario dei fluorocromi che sono quasi sempre citotossici. Questo microscopio consente anche di studiare la mobilità delle molecole e le loro interazioni a9raverso le tecniche FRAP e FRET. La tecnica FRAP è u4lizzata per misurare la mobilità delle molecole; si avvale del photobleaching ossia il fotosbiancamento delle molecole fluorescen4 di una zona del campione tramite luce laser, che consente di capire come esse si muovono. La tecnica FRET perme9e invece di studiare le interazioni tra le molecole; u4lizza il quenching (smorzamento) che consiste nel trasferimento di energia da una molecola fluorescente donatrice ad una fluorescente acce9ore.

Colorazioni istologiche Bisogna fare una dis4nzione tra colorazioni dire9e e colorazioni indire9e. Nelle dire9e il campione prende il colore dire9amente dalla soluzione acquosa o alcolica che sia, in quelle indire9e invece viene u4lizzato un mordente per preparare il composto alla colorazione. Le colorazioni possono ulteriormente essere suddivise in semplici quando si usa un solo colorante o combinate quando se ne usano di più simultaneamente. I coloran4 a loro volta possono essere suddivisi in naturali ed ar4ficali. Un esempio di colorazione combinata è l’u4lizzo della coppia ematossilina-eosina che colora i nuclei in blu in quanto assorbono l’ematossilina e il resto si colora in rosa assorbendo l’eosina. I più rari metodi tricromici come quelli di mallory, galgano, azan o van gieson u4lizzano oltre all’ematossilina miscele contenen4 diversi coloran4 quali l’arancio G per il citoplasma e un altro colorante come il blu di anilina, il blu di me4le o il verde luce, che colorano solo le fibre collagene in blu o in verde. Microscopio ele?ronico a trasmissione Visto il basso limite risolu4vo del microscopio oAco, i limi4 della lunghezza d’onda dello spe9ro visibile della luce può essere superato solo andando oltre lo spe9ro del visibile specialmente nelle lunghezze d’onda minori (ultraviole9o). Lanciando un fascio di ele9roni ad alta velocità si riesce così ad o9enere una lunghezza d’onda pari a 0. nanometri, infinitamente più piccola dei 400-800 nanometri dello spe9ro visibile. InfaA il potere di risoluzione che o9eniamo con lamba così piccoli raggiunge circa gli 0.2 nanometri ossia circa 1000 volte in più della risoluzione del microscopio oAco. Gli ele9roni per essere usa4 come mezzo di analisi devono essere, appena lasciato il filamento metallico portato ad incandescenza, so9opos4 ad una forte differenza di potenziale e poi lancia4 lungo la colonna; ovviamente per percorrere la distanza che intercorre tra sorgente len4 e schermo non devono incontrare ostacoli materiali quindi la colonna del microscopio deve essere evacuata dall’aria fino a valori di vuoto pari a 10^-5 torr. Gli ele9roni liberi di passare a9raversano il campione e da esso vengono in parte devia4, in parte assorbi ed in parte trasmessi. Ques4 ul4mi vengono concentra4 dalle len4 a formare l’immagine che poi potrà essere analizzata sul monitor.

Microscopio ele?ronico ad alto voltaggio

Nei TEM convenzionali, gli ele9roni vengono accelera4 ad una differenza di potenziale compresa tra 50-100kV, essi assumono quindi una velocità pari a circa 4/5 di quella della luce, ed un energia sufficiente per a9raversare senza essere assorbi4 o dispersi completamente, campioni cos4tui4 da atomi ad alto peso atomico, come nel caso in cui si usino fissa4vi e coloran4 a base di metalli pesan4 quali osmio, piombo, argento, uranio, ferro, tungsteno e pla4no. Un microscopio ele9ronico a trasmissione il cui fascio ele9ronico viene accelerato a differenze di potenziale più elevate (500-2500 kV) viene definito ad alto voltaggio e ciò consente di osservare prepara4 deA whole mount ossia cos4tui4 da più cellule complete.

Microscopio ele?ronico a scansione

Se nel TEM il campione viene a9raversato da un fascio di ele9roni, nel SEM il preparato fissato con gluteraldeide o tetrossido di osmio, è rives4to poi da un soAle strato di metalli pesan4 quali oro o oro- palladio per consen4rne l’osservazione. Il campione viene inserito in una specifica camera del microscopio dove viene esplorato da un soAlissimo fascio di ele9roni deA primari che venendo deflessi da un disposi4vo formano una specie di pennello che analizza la superficie per pun4 successivi. Gli ele9roni primari eccitano così la superficie del campione che eme9e raggi x ed ele9roni secondari che vengono raccol4 da un rilevatore. L’immagine che si forma sul monitor riproduce il campione con effe9o tridimensionale rilevando ogni par4colare con una risoluzione di 20 nm, ma con sorgen4 ele9roniche par4colari come l’esaboruro di lantanio si possono o9enere risoluzioni di circa 3 nm.

Alles:mento dei campioni

Diversamente dalla preparazione del campione del microscopio oAco, nel microscopio ele9ronico si necessitano feAne molto più soAli, in quanto gli ele9roni hanno uno scarso potere di penetrazione. Primo step fondamentale come sempre è la fissazione, i fissa4vi più u4lizza4 sono la gliceraldeide e il tetrossido di osmio. Successivamente il campione viene so9oposto a disidratazione, in quanto al microscopio ele9ronico non possiamo analizzare in vivo, quindi possiamo tranquillamente disidratare tu9o tramite alcool e4lico o acetone. Il campione viene poi incluso in monomeri acrilici o resine epossidiche per dare spessore e successivamente sezionate allo spessore di 50-80 nm, ovviamente per o9enere delle sezioni così soAli non bastana più i microtomi del microscopio oAco, ma necessi4amo degli ultramicrotomi ad avanzamento termico o meccanico, che u4lizzano lame di vetro o di diamante. La colorazione del preparato avviene aumentando il contrasto con determina4 coloran4 ele9ronici ossia Sali di atomi pesan4 come l’acetato di uranile e il citrato di piombo. Altra tecnica importante è quella dell’ombreggiatura rota4va che consiste nel rives4re il campione con un soAlissimo strato di pla4no, questo viene poi stabilizzato con uno strato di carbone e recuperato dopo aver idrolizzato il campione. Lo strato di pla4no recuperato che fa da stampo viene poi analizzato. Un’ulteriore tecnica importante molto u4lizzata è quella della colorazione nega4va che consiste nell’impregnare il campione con una soluzione di Sali di metalli pesan4 quali acido fosfotungstenico e acetato di uranile che penetrano tra le macromolecole colorando gli spazi tra esse in nero e lasciando il resto in bianco, come in un nega4vo fotografico. Si può inoltre ricorrere all’u4lizzo di traccian4 che diventano visibili grazie alla loro opacità agli ele9roni. Ul4ma molto importante tecnica di analisi delle stru9ure di comunicazione fra cellule è quella del freeeze- fracture e del criodecappaggio. Il materiale viene congelato rapidamente a -150° trasferito nel vuoto e quidni fra9urato con una lama, la superficie di fra9ura viene quindi ombreggiata con carbone e pla4no e staccata dall’ogge9o in modo da o9enere uno stampo della superficie.

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