Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Przygotuj się do egzaminów
Studiuj dzięki licznym zasobom udostępnionym na Docsity
Otrzymaj punkty, aby pobrać
Zdobywaj punkty, pomagając innym studentom lub wykup je w ramach planu Premium
Społeczność
Odkryj najlepsze uniwersytety w twoim kraju, według użytkowników Docsity
Bezpłatne poradniki
Pobierz bezpłatnie nasze przewodniki na temat technik studiowania, metod panowania nad stresem, wskazówki do przygotowania do prac magisterskich opracowane przez wykładowców Docsity
fosfatazy alkalicznej oznaczana w świeżej plazmie nasienia psa może pełnić rolę ... płciowego – prostaty jest oznaczanie zawartości białka ogólnego w pełnej ...
Typologia: Schematy
1 / 39
Ta strona nie jest widoczna w podglądzie
Nie przegap ważnych części!
Olsztyn 2015
1. Imię i nazwisko Rafał Strzeżek 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe/ artystyczne – z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej
1999 - tytuł: lekarz weterynarii, Wydział Medycyny Weterynaryjnej, Akademia Rolniczo- Techniczna w Olsztynie
2003 - stopień naukowy: doktor nauk weterynaryjnych, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, tytuł rozprawy doktorskiej: Wpływ finasterydu na funkcję prostaty i jakość nasienia u psów, promotor: prof. dr hab. Tomasz Janowski
2003 - tytuł specjalisty z zakresu: Rozród zwierząt, Komisja do Spraw Specjalizacji Lekarzy Weterynarii, Puławy
2012 - tytuł specjalisty z zakresu: Choroby psów i kotów, Komisja do Spraw Specjalizacji Lekarzy Weterynarii, Puławy
3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych/artystycznych
01.10.1999 – 30.03.2003 - Katedra Rozrodu Zwierząt z Kliniką, Wydział Medycyny Weterynaryjnej w Olsztynie, doktorant
15.03.2002 - Katedra Biochemii i Biotechnologii Zwierząt, Wydział Bioinżynierii Zwierząt, asystent-doktorant
01.04.2003 - Katedra Biochemii i Biotechnologii Zwierząt, Wydział Bioinżynierii Zwierząt, asystent
01.12.2003 - do chwili obecnej, Katedra Biochemii i Biotechnologii Zwierząt, Wydział Bioinżynierii Zwierząt, adiunkt
Wkład Wnioskodawcy w wyżej wymienione prace przestawiono w załączniku nr. 3, natomiast oświadczenia współautorów w załączniku nr. 7.
4.3. Omówienie celu naukowego/artystycznego ww. pracy/prac i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania.
4.3.1. Wstęp
Powszechnie stosowane klasyczne metody badania nasienia, wykorzystywane do tej pory, oparte są o mikroskopową ocenę koncentracji, ruchliwości i morfologii plemników oraz określenie odsetka plemników martwych i żywych (Bukowska i in., 2011). Chociaż część tych analiz może być pomocna w prognozowaniu płodności samców czy przydatności nasienia do konserwacji, to jednak często nie są one w pełni wiarygodne (Payan-Carreira i in., 2013). Spowodowane jest to odmiennym sposobem przygotowania materiału do badań, użyciem różnych technik barwienia oraz stosowaniem odpowiedniej jakości aparatury laboratoryjnej. Stąd mimo, że plemniki w ocenie mikroskopowej (przeprowadzonej klasycznymi metodami) mogą wykazywać podobne właściwości to niezbędne są jednak bardziej specjalistyczne metody umożliwiające identyfikację różnych subpopulacji plemników o odrębnych cechach biochemicznych i fizjologicznych. Wiadomo bowiem, że połączenie różnych kompetencji funkcjonalnych plemników decyduje w dużej mierze o potencjalnej płodności określonego samca (Payan-Carreira i in., 2013). Kompleksowa analiza wymagana jest także odnośnie monitorowania zmian zachodzących podczas poszczególnych etapów konserwacji, co jest niezmiernie istotne podczas wdrażania nowych procedur technologicznych. W poszukiwaniu komplementarnych metod oceny jakości nasienia podejmuje się próby wprowadzenia do pakietu badań laboratoryjnych szeregu analiz specjalistycznych opartych o wyznaczniki funkcjonalne i molekularne. Omawiane analizy obejmują przede wszystkim: komputerowo wspomaganą analizę nasienia (CASA), badania strukturalne i funkcjonalne plemników z zastosowaniem barwników fluorescencyjnych (z wykorzystaniem cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej), analizy funkcjonalne oparte na mechanizmach interakcji plemnik-oocyt (Bukowska i in., 2011; Niżański i in., 2012). Ponadto istotny element oceny jakości nasienia stanowią analizy wskaźników biochemicznych, które pozwalają na określenie zdolności zapładniającej populacji plemników poprzez oznaczanie aktywności enzymów zlokalizowanych w ultrastrukturach plemników oraz oznaczanie specyficznych wyznaczników metabolizmu plemnikowego (Strzeżek, 2013).
Systemy CASA umożliwiają obiektywną ocenę odsetka plemników ruchliwych (MOT), odsetka plemników o ruchu postępowym (PMOT), określenie populacji plemników o ruchu szybkim, umiarkowanym czy wolnym. Ponadto dają możliwość wizualizacji toru ruchu indywidualnych gamet co umożliwia szczegółowy opis parametrów związanych z prędkością i rodzajem ruchu plemników. Nowoczesne analizy CASA pozwalają obecnie także na ocenę morfologiczną i morfometryczną plemników (Antończyk i in., 2010). Istotnym rozwiązaniem wprowadzonym w ostatnich latach jest możliwość przeprowadzania bardziej wiarygodnej oceny ruchliwości plemników poddanych konserwacji w rozcieńczalnikach zawierających komponenty żółtka jaja ptaków, które mogą być rozpoznawane przez analizator jako plemniki. Zasygnalizowana niedoskonałość systemów CASA eliminuje się poprzez zastosowanie metody barwienia fluorescencyjnego opartego o barwnik Hoechst 33342 wykazujący silne powinowactwo do ultrastruktury DNA plemników i fluorescencję w świetle UV (Antończyk i in., 2010). Taka procedura powoduje nieuwzględnianie w analizie ruchu biernego innych elementów komórkowych nasienia wykazujących słabą fluorescencję (nabłonki, komórki krwi) a także ziarnistości komponentów żółtka jaja (brak DNA) (Niżański i Klimowicz, 2005). Należy dodać, że systemy CASA są powszechnie wykorzystywane w badaniach nad optymalizacją procedur konserwacji nasienia psów zarówno w stanie płynnym jak i poddawanego kriokonserwacji (Rijsselaere i in., 2012). Kolejnym istotnym elementem oceny jakości nasienia są badania strukturalne i funkcjonalne plemników z zastosowaniem barwników fluorescencyjnych i wykorzystaniem cytometrii przepływowej lub mikroskopii fluorescencyjnej. Jak wskazuje Rijsselaere i in. (2012) omawiane badania wraz komputerową analizą jakości nasienia (CASA) stanowią obecnie „złoty standard” w laboratoryjnej ocenie płodności samców i przydatności ich nasienia do konserwacji. Ocena jakości nasienia z wykorzystaniem barwników fluorescencyjnych ma obecnie szerokie spektrum zastosowań. Ocena integralności błon plazmatycznych plemników psa może być przeprowadzona z zastosowaniem kombinacji różnych barwników, między innymi: dioctanu karboksyfluoresceiny (CFDA) z jodkiem propydyny (PI) (Kim i in. 2010), Carboxy-SNARF i PI (Peña i in., 1999), kalceiny AM z homodimerem etydyny (EthD-1) (Sirivaidyapong i in., 2000) czy SYBR-14 z PI (Niżański i Klimowicz, 2005). To ostatnie zestawienie kombinacji barwników (SYBR-14 / PI) jest obecnie najczęściej stosowane w ocenie ciągłości plazmolemy plemników psa. Barwnik SYBR-14 wykazuje bowiem powinowactwo do DNA komórkowego i przenika przez nieuszkodzoną błonę komórkową plemników żywych wyzwalając zieloną fluorescencję.
etapach apoptozy dochodzi do translokacji reszt fosfatydyloseryny z wewnętrznej części błony komórkowej na zewnętrzną a tym samym jej ekspozycję na powierzchni plemnika (Peña i in., 2003). Do detekcji omawianego zjawiska wykorzystuje się białko aneksynę V skoniugowaną z barwnikiem fluorescencyjnym (FITC lub Alexa Fluor). Wykazano, iż proces kriokonserwacji indukuje przemieszczenie reszt fosfatydyloseryny w plemnikach m in. buhaja (Martin i in. 2004), knura (Peña i in., 2003) czy psa (Yu i in., 2014). Z kolei zastosowanie kombinacji dwóch fluorochromów YO-PRO-1 i EthD-1 pozwala na rozróżnienie czterech populacji plemników: żywych (YO-PRO-1-, EtD-1-), wykazujących apoptozę (YO-PRO-1+, EtD-1-), będących w we wczesnej (YO-PRO-1+, EtD-1+) lub późnej nekrozie (YO-PRO-1-, EtD-1+) (Neagu i in., 2010). Nasilenie procesów peroksydacji lipidów (LPO) w plemnikach spowodowane nadmierną produkcją reaktywnych form tlenu (RFT), zwłaszcza podczas procedur kriokonserwacji, jest możliwe do identyfikacji przy zastosowaniu specyficznego barwnika fluorescencyjnego C 11 -BODIPY 581/591 (Neagu i in., 2011; Niżański i in., 2012). Przy zastosowaniu omawianego barwnika wzrost odsetka plemników ogiera wykazujących LPO po rozmrożeniu stwierdzili Ortega Ferrusola i in. (2009). Z kolei Negau i in. (2011) wykazali obniżenie peroksydacji lipidów plemnikowych psa po rozmrożeniu nasienia w porównaniu do prób nasienia świeżego. Autorzy tłumaczą to faktem zaburzenia funkcji mitochondriów, które są głównym źródłem RFT indukujących peroksydację lipidów w plemnikach. Ocena struktury chromatyny i integralności DNA plemników psa jest dokonywana najczęściej przy pomocy testu SCSA oraz metody TUNEL. W teście SCSA (ang. sperm chromatin structure assay) przeprowadzanym w cytometrze przepływowym wykorzystuje się barwnik oranż akrydyny (AO). W przypadku plemników z prawidłową strukturą chromatyny, poddanych denaturacji w kwaśnym środowisku, oranż akrydyny łączy się z dwuniciowym DNA emitując zieloną fluorescencję. Z kolei w plemnikach z uszkodzoną chromatyną omawiany barwnik łączy się z fragmentowanym DNA emitując czerwone światło (Evenson i in. 1994, 2002). Wskaźnik DFI (ang. DNA fragmentation index) jest istotnym parametrem określającym stopień fragmentacji DNA w plemnikach (Niżański i in., 2012). Wykazano przydatność testu SCSA do określenia stopnia fragmentacji DNA w plemnikach psa poddanych zamrożeniu- rozmrożeniu (Koderle i in., 2009; Kim i in., 2010). Metoda TUNEL (ang. terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated nick end labelling), polegająca na wbudowywaniu nukleotydów znakowanych fluoresceiną do pęknięć w łańcuchu DNA także znalazła zastosowanie, chociaż w ograniczonym zakresie, w ocenie jakości nasienia psów (Lange- Consiglio i in., 2010).
W grupie analiz funkcjonalnych opartych na mechanizmach interakcji plemnik-oocyt należy wymienić testy określające w warunkach in vitro wiązanie osłony przejrzystej oocytów (ang. ZP-zona binding assay, ZBA) lub wiązania osłony przejrzystej oocytów poddanych bisekcji (Hemizona binding assay, HZA) oraz penetracji pozbawionych osłony przejrzystej oocytów chomika (ang. Hamster zona-free oocyte penetration assay, SPA Sperm Penetration Assay) (Bukowska i in., 2011; Partyka i in., 2012). Omawiane testy mogą dostarczyć istotnych informacji dotyczących potencjalnej płodności samców a także o żywotności plemników pochodzących z danej próby nasienia lub mogą być wykorzystywane do oceny skuteczności nowych procedur konserwacji nasienia (Martinez, 2004). W dostępnym piśmiennictwie wskazuje się na zastosowanie tych metod w badaniach poznawczych dotyczących przebiegu procesu zapłodnienia u psów (Mahi i Yanagimachi, 1978; Hewitt i England, 2001), ocenie płodności psów (Mayenco-Aguirre i Pérez-Cortés, 1998) a także ocenie wpływu konserwacji na zdolności zapładniające plemników psa (Hay i in., 1997; Ivanova i in., 1999). Do wyznaczników biochemicznych jakości nasienia psa należy zaliczyć enzymy plemników i plazmy nasienia. Spośród licznych enzymów hydrolitycznych akrosomu plemników, trypsynopodobna proteinaza serynowa - akrosyna (EC 3.4.21.10) pełni wiodącą rolę w procesie zapłodnienia jaja. Enzym ten wraz z naturalnymi inhibitorami oraz formą zymogenową – proakrosyną stanowi tzw. system akrosynowy plemników (Glogowski i in., 1998). W nieuszkodzonych ejakulowanych plemnikach, aktywna akrosyna stanowi zaledwie kilka procent ogólnej puli tego enzymu, natomiast znaczna jej część występuje w formie nieaktywnego zymogenu – proakrosyny. Wskazuje się, że zawartość proakrosyny i akrosyny całkowitej w plemnikach jest wyznacznikiem stabilności akrosomów i może być wykorzystywana jako biochemiczny test w ocenie jakości konserwowanego nasienia (Borkowski i Strzeżek, 1994). Kolejnym enzymem wskaźnikowym jest aminotransferaza asparaginianowa (AspAT, EC 2.6.1.1), która ma wieloźródłowe pochodzenie (Ciereszko i Strzeżek, 1989). Obok aktywności w plazmie nasienia, uwarunkowanej syntezą w gruczołach dodatkowych, omawiany enzym jest także trwale związany ze wstawką plemnika (Borkowski i Strzeżek, 1994). Wzrost aktywności AspAT w płynie zewnątrzkomórkowym podczas kolejnych etapów konserwacji nasienia (rozrzedzania, schładzania i ekwilibracji) świadczyć może o „wycieku” omawianego enzymu spowodowanego uszkodzeniami błon plazmatycznych plemników. Niżański (2004) wykazał, że podczas zamrażania nasienia psa stopień nasilenia uwalniania AspAT do środowiska zewnątrzkomórkowego, uwarunkowany m in. stopniem
wyższą zawartość białka stwierdza się w plazmie nasienia pochodzącej z frakcji plemnikowej (Bartlett, 1962; England i Allen., 1989). Wśród wyznaczników biochemicznych jakości nasienia, obok aktywności określonych enzymów, w ostatnich latach zwraca się uwagę na zdolność komponentów nasienia, a zwłaszcza plemników, do prowadzenia reakcji redukcyjnych. Aktywność redukcyjna plemników jest określana przy pomocy testów z barwnikami resazuryną (RRT) lub błękitem metylenowym (MTT). Omawiane testy znalazły zastosowanie w ocenie jakości nasienia buhaja, knura czy tryka (Chandler i in., 2000; Aziz i in., 2005; Zrimsek i in., 2004). Wyznacznikiem funkcjonalności mitochondriów, oprócz omawianych uprzednio wskaźników fluorescencyjnych, jest także zawartość adenozynotrifosforanu (ATP) w plemnikach. Wskazuje się, że ATP w plemnikach powstaje w wyniku zarówno utleniania mitochondrialnego ale także w reakcjach glikolizy fosforylującej (Mukai i Okuno, 2004). Dlatego też uszkodzenia mitochondriów plemników, występujące zwłaszcza podczas kriokonserwacji nasienia, powodują spadek ilości wytwarzanego ATP, a tym samym i ruchliwości plemników (Thomas i in., 1998). Podsumowując, w ostatnich latach opracowano szereg metod opartych o mechanizmy reakcji molekularnych, które umożliwiają ocenę właściwości biologicznych plemników i plazmy nasienia różnych gatunków zwierząt, w tym również psa. Nie mniej stosowanie kombinacji omawianych metod może przyczyniać się do uzyskiwania coraz bardziej wiarygodnych wyników określających płodność samców jak i przydatność ich nasienia do konserwacji w różnych temperaturach.
4.3.2. Omówienie wyników prac wskazanych jako szczególne osiągnięcie naukowe
1. Strzeżek R., Filipowicz K., Stańczak M., Kordan W. 2013. Spectrophotometric analysis of the resazurin reduction test as a tool for assessing canine semen quality. Bulletin of the Veterinary Institute in Pulawy, 57: 281-285.
Cel pracy i uzasadnienie potrzeby badań Celem pracy było określenie przydatności spektrofotometrycznego testu redukcji resazuryny (RRT) do oceny jakości nasienia psa. Test ten oparty jest na zasadzie, iż barwnik resazuryna pod wpływem enzymów z klasy oksydoreduktaz, zawartych w aktywnych metabolicznie komórkach, ulega redukcji do trwałej resorufiny (barwa różowa) a następnie do hydroresorufiny (bezbarwna) (Dart i in., 1994; O’Brien i in., 2000). Pomiar stopnia redukcji resazuryny umożliwia identyfikację metabolicznie aktywnych plemników (Zalata i in., 1998). Test redukcji resazuryny znalazł dotychczas zastosowanie w ocenie jakości nasienia m in. mężczyzn (Mahmoud i in., 1994; Reddy i Bordekar, 1999), buhaja (Dart i in, 1994), tryka (Wang i in., 1998), ogiera (Carter i in., 1998) oraz knura (Zrimsek i in., 2004). Pierwotnie test redukcji resazuryny prowadzono poprzez wizualną ocenę zmiany koloru próby nasienia poddanej inkubacji z omawianym barwnikiem (Carter i in., 1998). Jednakże w celu wyeliminowania subiektywnej oceny rezultatów testu, często obarczonej ludzkim błędem przeprowadzającego badanie, wprowadzono jego modyfikację opierającą się na zastosowaniu spektrofotometrii (Zalata i in., 1998, Zrimsek i in., 2004). W naszych badaniach zastosowaliśmy po raz pierwszy w odniesieniu do nasienia psa zmodyfikowaną metodę spektrofotometryczną. Materiał i metody Materiał do badań stanowiły ejakulaty pozyskane od 4 psów mieszańców. Każdorazowo nasienie rozdzielano na próby zawierające plemniki oraz plazmę nasienia Wdrożenie spektrofotometrycznego testu redukcji resazuryny do oceny jakości nasienia psa obejmowało:
omawianych enzymów w reakcji redukcji resazuryny może być fakt identyfikacji ich aktywności w plemnikach mężczyzn oraz wielu gatunków zwierząt, zwłaszcza w ich regionie wstawkowym (Zalata i in., 1998). Ponadto badania prowadzone przez Zalata i in. (1998) wskazują, iż dodatek NADH do zawiesiny plemników lub plazmy nasienia powoduje istotny wzrost konwersji resazuryny w jej formę zredukowaną. Niewyjaśniony jest z kolei mechanizm zdolności redukującej plazmy nasienia. Wskazuje się, że źródłem zredukowanych nukleotydów i/lub enzymów od nich zależnych w plazmie nasienia mogą być plemniki zmienione morfologicznie (Zalata i in., 1998). Przykładowo, wykazano wysoką aktywność NAD(P)H - zależnych diaforaz w kroplach cytoplazmatycznych plemników ludzkich (Zini i in., 1998). Potwierdzeniem tego zjawiska w naszych badaniach może być fakt, iż ejakulaty osobnika u którego w plazmie nasienia wykazano najwyższą wartość indeksu RRTplasma, charakteryzowały się najniższym odsetkiem plemników prawidłowych morfologicznie oraz znacznym odsetkiem plemników z kroplą cytoplazmatyczną. Ponadto, dla indeksu RRTplasma stwierdziliśmy występowanie ujemnych korelacji z SPMI i plemników z prawidłową morfologią. Z kolei Mahmound i in. (1994) wskazują na obecność w plazmie nasienia szeregu substancji wykazujących zdolności redukcyjne, takich jak kwas L- askorbinowy czy L-glutation. W naszych wcześniejszych badaniach dotyczących charakterystyki systemów antyoksydacyjnych w nasieniu psa wykazano znaczną zawartość omawianych substancji w plazmie nasienia psa (Strzeżek i in., 2009). Podsumowując, spektrofotometryczy test redukcji resazuryny może stanowić dodatkowy wiarygodny wskaźnik sprawności metabolicznej w ocenie jakościowej nasienia psa.
2. Strzeżek R., Szemplińska K., Filipowicz K., Kordan W. 2015. Semen characteristics and selected biochemical markers of canine seminal plasma in various seasons of the year. Polish Journal of Veterinary Sciences, 18: 13 - 18. Cel pracy i uzasadnienie potrzeby badań Celem pracy było określenie wpływu pory roku na wybrane parametry jakościowe nasienia psów oraz biochemiczne wyznaczniki plazmy nasienia. Zasadniczą przesłankę do podjęcia badań dotyczących omawianego problemu stanowił brak dostatecznej wiedzy odnośnie zmian jakościowych nasienia psa w cyklu rocznym. Pomimo, że psy samce są zwierzętami wykazującymi aktywność płciową przez cały rok, w nielicznych badaniach podkreśla się występującą sezonową zmienność wybranych parametrów jakościowych nasienia (Kuroda i Hiroe 1972, Taha i in., 1981). Należy podkreślić, że są to badania pionierskie, przeprowadzone po raz pierwszy w kraju a także jedne z nielicznych w Europie.
Materiał i metody Materiał do badań stanowiły pełne ejakulaty pozyskiwane w odstępach 2-tygodniowych od 5 psów mieszańców w wieku 2-8 lat. W doświadczeniu wykorzystano szereg analiz bowiem każdorazowo po pobraniu, nasienie poddawano ocenie makro- i mikroskopowej (objętość nasienia, ogólna liczba plemników, ocena morfologiczna plemników). Ponadto przeprowadzano ocenę parametrów ruchliwości plemników (z wykorzystaniem systemu CASA), ocenę integralności plazmolemy plemników (SPMI), ocenę odsetka plemników z funkcjonalnymi mitochondriami (MMP) oraz oznaczano zawartość ATP w plemnikach. Badania biochemiczne plazmy nasienia obejmowały oznaczanie zawartości białka ogólnego (TCP) oraz aktywności fosfataz: alkalicznej (AP) i kwaśnej (AcP). Rezultaty badań i ich interpretacja W badaniach nie wykazano istotnych zmian objętości pełnego ejakulatu pomiędzy poszczególnymi porami roku. Jednakże ejakulaty pozyskiwane w okresie letnim i jesiennym charakteryzowały się najwyższą ogólną liczbą plemników. Mimo to, ocena integralności błon plazmatycznych plemników (SPMI) oraz form morfologicznych plemników, wskazały na brak wpływu czynników środowiskowych (w tym temperatury otoczenia) na omawiane parametry. W poszczególnych porach roku nie obserwowano bowiem drastycznych zmian w zakresie omawianych wyznaczników. Wykazano jednakże istotny wpływ pory roku na odsetek plemników z funkcjonalnymi mitochondriami (barwienie fluorescencyjne JC-1 / PI). Obserwowano bowiem obniżenie wartości omawianego wyznacznika w okresie letnim, chociaż nie stwierdzono zakłóceń w procesach fosforylacji oksydacyjnej i szlaku glikolizy identyfikowanych zawartością ATP w plemnikach. Wskazywać to może, że plemniki psa posiadają zdolność do prowadzenia przemian energetycznych na optymalnym poziomie we wszystkich porach roku. Nie wykazano również statystycznie istotnych różnic w zakresie odsetka plemników ruchliwych (MOT) przez cały okres pozyskiwania ejakulatów. Jednak najwyższym odsetkiem plemników o ruchu postępowym (PMOT) charakteryzowały się ejakulaty pozyskane jesienią i zimą. Analiza wyznaczników biochemicznych plazmy nasienia nie wykazała zmienności zawartości białka ogólnego uwarunkowanej sezonem. Mimo to najwyższą wartość tego wyznacznika stwierdzono w okresie zimowo-wiosennym, najniższą zaś w okresie jesiennym. Niewielkie wahania wartości tego parametru pomiędzy poszczególnymi sezonami mogą wskazywać na umiarkowane zmiany w sekrecji wydzielin najądrzy oraz prostaty. Z kolei wyższa zawartość białka w plazmie nasienia stwierdzona w okresie zimowo-wiosennym może
wymagają kontynuowania z uwzględnieniem większej populacji psów, także rasowych. Pozwoli to na właściwą selekcję ejakulatów przeznaczonych do inseminacji czy długotrwałej konserwacji nasienia.
3. Strzeżek R., Fraser L. 2009. Characteristics of spermatozoa of whole ejaculate and sperm-rich fraction of dog semen following exposure to media varying in osmolality. Reproductive Biology, 9: 113-126.
Cel pracy i uzasadnienie potrzeby badań Zarówno w warunkach fizjologicznych jak i podczas procedur konserwacji, plemniki poddawane są wpływowi zmiennego ciśnienia osmotycznego. W warunkach fizjologicznych, u wielu gatunków zwierząt ciśnienie osmotyczne płynu najądrzowego jest hiperosmotyczne w przeciwieństwie do plazmy nasienia czy płynu macicznego, które wykazują charakter ściśle izotoniczny (Cooper i Yeung, 2003). Z kolei podczas kriokonserwacji plemniki narażone są nie tylko na wpływ zmiennych temperatur ale także na zmiany ciśnienia osmotycznego (Meyers 2005). Na etapie zamrażania plemniki poddawane są bowiem wpływowi stresu spowodowanego zmianami w objętości wody wewnątrzkomórkowej podczas jej krystalizacji. Z kolei w procesie rozmrażania następuje zwiększenie objętości wody wewnątrz plemników (Mazur, 1984; Holt WV, 2000). Omawiane czynniki mogą prowadzić do zaburzeń struktury i funkcjonalności błon plazmatycznych, uszkodzeń aparatu ruchu a w konsekwencji do śmierci gamet (Pukazhenthi i in., 2002). Ograniczony jest również zakres informacji dotyczących wpływu białek plazmy nasienia na przeżywalność plemników psa poddawanych konserwacji. Wskazuje się między innymi, że komponenty plazmy nasienia u wielu gatunków zwierząt pełnić mogą podczas konserwacji funkcję ochronną wobec plemników narażonych na udar chłodowy i zmiany ciśnienia osmotycznego (Pursel i in., 1973; Graham 1994; Barrios i in. 2000; Moore i in., 2005). Jednakże brak jest dostatecznej wiedzy dotyczącej wpływu plazmy nasienia na plemniki psa podczas konserwacji w stanie płynnym oraz zamrażania-rozmrażania (Rota i in., 1995; Sirivaidyapong i in., 2001; Nöthling i in., 2007). Nieliczne publikacje (Songsasen 2002) dotyczące wpływu różnych ciśnień osmotycznych na właściwości plemników psa i ewentualnej funkcji ochronnej plazmy nasienia stanowiły zasadniczą przesłankę do podjęcia omawianych badań. Materiał i metody Materiał do badań stanowiły ejakulaty pochodzące od 4 psów. Pełne ejakulaty (WE) lub wyłącznie frakcje plemnikowe ejakulatów (SRF) poddawano inkubacji (10 minut, temperatura
pokojowa) w wariantach rozcieńczalnika Tris-cytrynian-fruktoza (TCF) o różnych ciśnieniach osmotycznych (150, 300, 350, 550, 800 i 1100 mOsm/kg). Po upływie czasu inkubacji próby nasienia poddawano ocenie ruchliwości plemników metodą mikroskopową. Dokonywano również oceny integralności plazmolemy plemników (SPMI) oraz odsetka plemników z funkcjonalnymi mitochondriami (MF). Rezultaty badań i ich interpretacja Rezultaty badań wykazały, że plemniki psa są podatne na zmiany ciśnienia osmotycznego. Należy jednak podkreślić, że stwierdzono osobniczo uwarunkowaną zmienność w zakresie wartości analizowanych wyznaczników w zależności od przedziałów stosowanego ciśnienia osmotycznego rozcieńczalnika. Podobnie jak w przypadku plemników innych gatunków zwierząt, aparat ruchu plemników wydaje się być bardziej wrażliwy na zmiany ciśnienia osmotycznego niż integralność plazmolemy (Curry i in., 1994; Liu i in., 1998; Fraser i in., 2001). Gwałtowne obniżenie ruchliwości plemników stwierdzono w warunkach hiperosmotycznych, zwłaszcza w roztworach powyżej 800 mOsm/kg. Zjawisko to korespondowało ze znacznym obniżeniem odsetka plemników z funkcjonalnymi mitochondriami (barwienie R123/PI), które stanowią źródło energii niezbędnej do poruszania się. Podobne zależności zaobserwowano w odniesieniu do plemników knura (Gilmore i in., 1998), buhaja (Liu i in., 1998) czy kota (Pukazhenthi i in., 2002). Natomiast obserwowano stopniowe obniżenie odsetka plemników z zachowaną integralnością błon plazmatycznych (barwienie CFDA/PI). Tendencja taka była słabiej wyrażona w próbach pochodzących z pełnych ejakulatów (WE). W warunkach hypoosmotycznych (150 mOsm/kg) spadkowi ruchliwości towarzyszyło obniżenie odsetka plemników z zachowaną integralnością plazmolemy i aktywnymi mitochondriami. Zjawisko to nie miało jednak charakteru gwałtownego, jak w przypadku inkubacji w roztworach hiperosmotycznych. Rezultaty badań wskazują, że istotny wpływ na zachowanie integralności plazmolemy plemników psa wywiera sposób kolekcjonowania ejakulatu. W próbach pochodzących bowiem z pełnych ejakulatów (WE), obecność białek plazmy nasienia, których głównym źródłem u psa jest wydzielina prostaty, zdaje się pełnić istotną funkcję ochronną w stosunku do plazmolemy plemników. W warunkach fizjologicznych, jedną z funkcji białek wydzieliny prostaty (PF) jest opłaszczanie błon plazmatycznych plemników, powodujące w ten sposób maskowanie receptorów progesteronowych i zapobieganie przedwczesnej kapacytacji w drogach rodnych suki (Rota i in., 2007).
Podsumowując wyniki powyższych badań, aparat koordynacji ruchu plemników psa wydaje się być bardziej wrażliwy na zmiany ciśnienia osmotycznego w porównaniu do integralności ich błon plazmatycznych. Plazmolema plemników pochodzących z pełnych ejakulatów (czyli zawierających komponenty plazmy nasienia) wykazuje większą tolerancję na zmiany ciśnienia osmotycznego. Nasze badania wskazują więc na potrzebę stosowania dodatku plazmy nasienia lub jej poszczególnych frakcji podczas konserwacji plemników tego gatunku. Jednakże mankamentem wprowadzenia takich zmian w technologii konserwacji jest zjawisko obniżenia ruchliwości plemników po ich inkubacji z pełną plazmą nasienia. Dlatego też niezbędne są kompleksowe badania mające na celu wybór odpowiedniej frakcji białkowej plazmy nasienia w konserwacji nasienia psa.
4. Strzeżek R., Koziorowska-Gilun M., Kiełczewski K., Kordan W. 2015. Effect of dialysis of dog semen on sperm characteristics and some biochemical components of seminal plasma. Pol J Vet Sci., 18: 367-368.
Cel pracy i uzasadnienie potrzeby badań Doskonalenie metod konserwacji nasienia psa jest ciągle aktualnym problemem, zwłaszcza w odniesieniu do sposobu przygotowania prób nasienia do dalszych etapów postępowania technologicznego. Występowanie w plazmie nasienia niskocząsteczkowych substancji niekorzystnie oddziaływujących na plemniki, stanowi główną przyczynę podejmowanych prób wprowadzania specyficznych technik laboratoryjnych pozwalających na wyrugowanie lub neutralizację omawianych substancji przed dalszymi etapami technologii konserwacji nasienia. Powszechnie stosowaną procedurą poprzedzającą kolejne etapy konserwacji nasienia jest obecnie pozyskanie od psa wyłącznie frakcji plemnikowej ejakulatu i usunięcie plazmy poprzez wirowanie (Rijsselaere i in., 2002). Jak zasygnalizowano wcześniej, omawiane postępowanie prowadzi jednak do usunięcia istotnych jej komponentów np. antyoksydantów, pełniących funkcję protekcyjną wobec plemników (Koderle i in., 2011). Inną z możliwości, zachowującą w pewnym stopniu właściwości protekcyjne komponentów plazmy nasienia wobec plemników a jednocześnie eliminującą szereg niekorzystnie oddziałujących na nie substancji, jest procedura dializy pełnego ejakulatu. Metoda dializy oparta jest o wykorzystanie specjalnych błon dializacyjnych działających jak sito molekularne. Stosując omawianą procedurą, w przypadku nasienia knura stwierdzono, że proces 5 godzinnej dializy powoduje wzrost odsetka plemników ruchliwych z zachowaną integralnością plazmolemy i funkcjonalnymi mitochondriami (Fraser i in., 2007). Bezpośrednim skutkiem omawianego zjawiska była redukcja stężenia niekorzystnych dla plemników substancji peptydowych oraz
wolnych jonów Zn2+, stanowiących przyczynę podatności plemników knura na udar chłodowy (Strzeżek i in., 2002). Pozytywny efekt dializy na jakość nasienia knura stał się przesłanką do podjęcia próby przeprowadzenia badań porównawczych odnośnie psa. Celem badań była próba oceny wpływu procesu dializy nasienia psa na wybrane wyznaczniki jakościowe nasienia oraz wybrane wskaźniki biochemiczne plazmy nasienia. Materiał i metody Materiał do badań stanowiły ejakulaty pozyskane od 6 psów (wiek 2-8 lat) metodą manualną. Każdy ejakulat dzielono na dwie równo objętościowo porcje. Jedna porcja nie została poddana żadnym procedurom technologicznym. Drugą porcję poddawano 5 godzinnej dializie w workach dializacyjnych o przepuszczalności dla substancji o masie cząsteczkowej 12-14 kDa (Visking® dialysis tubing 36/32, Serva) wobec rozcieńczalnika bazowego Tris-fruktoza- cytrynian. W próbach nasienia świeżego oraz nasienia poddanego procedurze dializy oceniano odsetek plemników ruchliwych metodą mikroskopową, odsetek plemników z zachowaną integralnością plazmolemy (PMI) oraz funkcjonalnymi mitochondriami (MF). Analizy plazmy nasienia obejmowały oznaczanie następujących wyznaczników biochemicznych: zawartość białka ogólnego (TPC), zawartość wolnych grup sulfhydrylowych (SH), zawartość jonów cynkowych (Zn2+) oraz zawartość antyoksydantów niskocząsteczkowych: L-glutationu (GSH+GSSH), L-ergotioneiny (ERG), L-askorbinianu (ASC). Rezultaty badań i ich interpretacja Proces dializy spowodował wyraźny spadek jakości nasienia psa, co przejawiało się zdecydowanym obniżeniem odsetka plemników ruchliwych oraz plemników z nieuszkodzoną plazmolemą i funkcjonalnymi mitochondriami. Wykazano wzrost odczynu pH ejakulatu w kierunku bardziej obojętnego (z 6.45 do 7.1). Stwierdzony istotny wzrost zawartości białka ogólnego (TPC) w plazmie nasienia mógł być spowodowany interferencją komponentów odczynnika biuretowego z występującymi w plazmie nasienia redukującymi czynnikami (SH, GSH+GSSH i ERG), których wzrost zawartości także wykazano po dializie (Buxbaum 2011). Ponadto wzrost TPC sugerować może, że po dializie ejakulatu psa następują zmiany konformacyjne w strukturze białek plazmowych. Stanowić to mogło przyczynę naruszenia stabilności kompleksów jonów Zn2+^ z białkowymi komponentami plazmy nasienia i uwolnienia omawianych jonów do środowiska płynu dializacyjnego. Należy podkreślić istotne znaczenie jonów Zn2+, pochodzących u psa głównie z wydzieliny prostaty, dla właściwości funkcjonalnych plemników tego gatunku (Mogielnicka-Brzozowska i in., 2012). Ponadto stwierdzony istotny spadek zawartości ASC mógł także stanowić przyczynę obserwowanych zmian funkcjonalnych
