Pobierz Metody Biofizyczne: Analiza Błędów Pomiarowych i Wyznaczanie Krzywej Standardowej i więcej Streszczenia w PDF z Biofizyka tylko na Docsity!
Laboratorium z biochemii
DLA STUDENTÓW BIOLOGII, BIOTECHNOLOGII I OCHRONY
ŚRODOWISKA
Praca zbiorowa pod redakcją Antoniego Polanowskiego
Poprawki do wydania III wprowadzone pod redakcją
Justyny Ciuraszkiewicz i Elżbiety Gocek
10. Metody biofizyczne
Autorzy: Rafał Bartoszewski, Wojciech Białek, Beata Gubernator, Jarosław Króliczewski,
Janusz Piechota (ed. Justyna Ciuraszkiewicz)
10.1 Wstęp do opracowania wyników eksperymentalnych 2
10.2 Pipetowanie 12 10.2.1 Nauka prawidłowego i dokładnego pipetowania 13
10.2.2 Sprawdzanie kalibracji pipety automatycznej 14
10.2.3 Pomiar gęstości roztworu sacharozy 14
10.2.4 Wyznaczanie krzywej standardowej związku barwnego metoda najmniejszych
kwadratów
10.2.5 Wykorzystanie metody najmniejszych kwadratów do sporządzenia krzywej
wzorcowej do oznaczania ilości białka metodą Bradforda
10.2.6 Rozkład normalny wysokości pedów i ilości siewek grochu 18
10.3 Wirowanie 19
10.3.1 Izolacja chloroplastów 19 10.3.2 Otrzymanie preparatu tylakoidów z materiału roślinnego metodą wirowania
róznicowego
10.3.3 Skokowy gradient gestosci sacharozy 22
10.3.4 Ciągły gradient gestosci sacharozy 22
10.3.5 Ciągły gradient gestosci perkolu 23 10.3.6 Rozdział preparatu chloroplastów metodą wirowania w gradiencie gęstosci 23
10.3.7 Rozdział preparatu tylakoidów metodą wirowania w skokowym gradiencie
gęstosci
10.4 Potencjometria 25
10.4.1 Charakterystyka elektrody szklanej 25 10.4.2 Miareczkowanie potencjometryczne aminokwasów 26
10.4.3 Wyznaczanie pojemności buforowej buforu octanowego 27
10.4.4 Wyznaczanie pojemności buforowej dla buforów o różnym pH 28
10.4.5 Wyznaczanie pojemności buforowej dla buforów o różnym stężeniu 29
10.5 Spektroskopia i spektrofluorymetria 31 10.5.1 Wyznaczanie molowego współczynnika absorpcji 31
10.5.2 Wyznaczanie stężenia roztworu na podstawie prawa Lamberta-Beera 32
10.5.3 Wpływ^ pH^ oraz^ potencjału^ redoks^ na^ parametry^ spektralne^ związków chemicznych
10.5.3.1 Wpływ potencjału redoks na parametry spektralne związków chemicznych 33
10.5.3.2 Wpływ stopnia utlenienia na własności spektralne związków chemicznych 35
Wpływ pH na parametry spektralne związków chemicznych 36 10.5.4 Spektrofotometryczna analiza jakościowa 38
10.5.5 Spektrofluorymetria 39
10.1. WSTĘP DO OPRACOWANIA WYNIKÓW EKSPERYMENTALNYCH
Niepewność pomiarów i rodzaje błędów popełnianych podczas pomiarów
Każdy eksperyment naukowy składa się z szeregu czynności laboratoryjnych, które powinno się wykonać z należytą starannością. Bardzo często czynnością laboratoryjną jest pomiar określonej wielkości fizycznej, np. ważenie odczynnika, odmierzanie określonej objętości cieczy, pomiar pH, absorbancji itp. Pomiarem określa się zbiór czynności wykonanych w celu ustalenia wartości określonej wielkości fizycznej. Zazwyczaj dokonuje się tego poprzez porównanie mierzonej wartości z ustalonym wzorcem. Podczas wykonywania pomiaru może dojść do popełnienia różnego rodzaju błędów, które sprawiają, że zmierzona wartość x wielkości fizycznej różni się od prawdziwej miary x 0. Różnicę:
(1)
nazywamy błędem bezwzględnym zmierzonej wielkości fizycznej lub też błędem (niepewnością) pomiaru. Błąd pomiaru można też wyrazić w postaci błędu względnego:
lub błędu procentowego:
× %
Błędy popełniane podczas pomiaru wielkości mają różne przyczyny. Mogą one wynikać z niedoskonałości stosowanych przyrządów, niewłaściwego ich skalibrowania lub obsługi, niedoskonałości zmysłów eksperymentatora, czynników losowych (np. skoki napięcia w sieci elektrycznej). Na odczytywaną wartość mogą mieć wpływ czynniki zewnętrzne, np. temperatura, wilgotność powietrza, jakość stosowanych wzorów itp. Wszystko to sprawia, że uzyskiwane wyniki oscylują (są rozrzucone) wokół pewnej wartości. Na błąd pomiaru mogą się złożyć trzy rodzaje błędów: błędy przypadkowe , błędy systematyczne i błędy grube :
= + + (^)
(2)
Błędy przypadkowe wynikają z wpływu czynników losowych, niekontrolowanych przez eksperymentatora, np. sków napięcia w sieci elektrycznej, dokładności odczytu wartości przez eksperymentatora, drgania podłoża itp. Błędy te nie muszą się pojawiać podczas każdego pomiaru, lub mogą pojawiać się z różną siłą. Błędy przypadkowe mogą mieć różny znak, czyli raz powodować zawyżenie a innym razem zaniżenie mierzonej wielkości fizycznej. Aby zmniejszyć wpływ błędów przypadkowych na wynik pomiaru określonej wielkości fizycznej nie wykonuje się pojedynczego pomiaru lecz wykonuje się serię kilku pomiarów uzyskując serię wyników stanowiących tzw. próbę x 1 , x 2 , ..., xn (gdzie n to ilość pomiarów). Następnie z uzyskanych wyników oblicza się średnią arytmetyczną, której wartość jest najbardziej zbliżona do wartości prawdziwej.
Wykrywanie wyników wątpliwych – test Q Dixona
Czasami się zdarza, że w uzyskanej serii pomiarów jest jeden lub dwa wyniki, których wartości znacznie odbiegają od pozostałych wyników. Takie wartości mogły się pojawić w wyniku zaistnienia błędów grubych i powinny zostać odrzucone z dalszych obliczeń, jako wyniki wątpliwe. Dlatego też jedną z pierwszych czynności wykonywanych podczas analizy danych eksperymentalnych jest zastosowanie testu statystycznego pozwalającego wykryć i wyeliminować wyniki wątpliwe. Do tego celu służy test Q Dixona, który sprawdza, czy wynik skrajny (najmniejszy lub największy) jest wynikiem wątpliwym. W pierwszej kolejności należy uzyskane wyniki uporządkować rosnąco, a następnie policzyć odpowiednie statystyki (tzw. liczby Q):
oraz:
(6) gdzie R to tzw. rozstęp (różnica pomiędzy wartością największą i najmniejszą):
= !" − ! x 1 – wynik najmniejszy (skrajny) x 2 – wynik drugi w kolejności xn – wynik największy (skrajny) xn-1 – wynik przedostatni.
Wynik uznaje się za wątpliwy z określonym prawdopodobieństwem i odrzuca, jeżeli wartość statystyk Ql i Qp jest większa od tabelarycznej tzw. wartości krytycznej. Poniżej w tabeli są podane wartości krytyczne pozwalające odrzucać wyniki wątpliwe na poziomie istotności α = 5%. Taki poziom istotności pozwala stwierdzić, że jeżeli wartość statystyki Q jest większa od wartości krytycznej to z prawdopodobieństwem 95% wynik skrajny jest wynikiem wątpliwym i powinien być wykluczony z dalszych analiz.
Tab. 10.1. Wartości krytyczne Qt dla testu Dixona. n – ilość pomiarów (wielkość próby)
N QT N QT N QT 3 0,941 11 0,392 21 0, 4 0,765 12 0,376 22 0, 5 0,642 13 0,361 23 0, 6 0,560 14 0,349 24 0, 7 0,507 15 0,338 25 0, 8 0,468 16 0,329 26 0, 9 0,437 17 0,320 27 0, 10 0,412 18 0,313 28 0, 19 0,306 29 0, 20 0,300 30 0,
Test t Studenta dla jednej średniej
Test t Studenta jest jednym z podstawowych testów statystycznych. Stosowany jest on w celu sprawdzenia, czy pomiędzy dwie średnie arytmetyczne różnią się między sobą w sposób istotny statystycznie. Istnieje kilka odmian testu t Studenta. Poniżej zostanie przedstawiony dwustronny test t Studenta o średniej arytmetycznej , który służy do sprawdzenia, czy obliczona na podstawie próby ( zbioru uzyskanych wyników ) średnia arytmetyczna istotnie różni się od wartości teoretycznej. Zdając sobie sprawę, że studenci nie posiadają jeszcze odpowiedniej wiedzy teoretycznej z zakresu statystyki do pełnego zrozumienia idei, założeń testów statystycznych, test t Studenta zostanie przedstawiony w dużym uproszczeniu pozwalającym jednak na jego prawidłowe zastosowanie i wyciągnięcie odpowiedniego wniosku. Test t-Studenta o średniej arytmetycznej testuje następującą tzw. hipotezę zerową i hipotezę alternatywną :
#: % = %
#&: % ≠ % gdzie μ jest wartością średnią z tzw. badanej populacji (w tym przypadku będzie to zbiór wszystkich możliwych do uzyskania wyników). Wartość μ jest nieznana i jest reprezentowana przez średnią z próby wywodzącej się z populacji (w tym przypadku próbą jest zbiór wyników uzyskanych w trakcie eksperymentu). Natomiast μ 0 jest spodziewaną wartością teoretyczną. W uproszczeniu, test t Studenta o średniej arytmetycznej sprawdza, czy prawdziwa jest hipoteza zerowa (brak istotnej różnicy pomiędzy uzyskaną wartością średniej a wartością teoretyczną), czy alternatywna (uzyskana wartość średniej istotnie różni się od wartości teoretycznej). Postępowanie jest następujące:
- Obliczyć średnią i odchylenie standardowe s z uzyskanych wyników według wzorów zamieszczonych powyżej.
- Obliczyć statystykę testu td:
(7)
- Odczytać wartością krytyczną z poniższej tabeli. Do odczytania wartości krytycznej konieczna jest znajomość tzw. liczby stopni swobody df. W przypadku testu t Studenta o średniej arytmetycznej wartość df oblicza się ze wzoru: + = −
- Porównać uzyskaną wartość statystyki z odczytaną wartością krytyczną. Jeżeli wartość td jest mniejsza od wartości krytycznej uznaje się, że uzyskana średnia nie różni się w sposób istotny od wartości teoretycznej (prawdziwa jest hipoteza zerowa). Jeżeli wartość statystyki td jest większa od wartości krytycznej uznaje się, że z prawdopodobieństwem 100%-α (gdzie α to poziom istotności testu ) hipoteza zerowa jest nieprawdziwa i przyjmuje się hipotezę alternatywną, co jest równe ze stwierdzeniem, że uzyskana średnia istotnie różni się od wartości teoretycznej. Zazwyczaj ustala się wartość α na 5%.
Wykres 10.1. Zależność absorbancji od stężenia białka
Po sporządzeniu wykresu można zobaczyć, jaki charakter zależności występuje pomiędzy dwiema zmiennymi zaznaczonymi na osiach X i Y. W przyrodzie są znane różne typy zależności (korelacji), które ogólnie można podzielić na zależności liniowe i nieliniowe. Znając typ zależności pomiędzy dwiema zmiennymi można dopasować odpowiedni model matematyczny, który umożliwi przewidywanie wartości jednej zmiennej na podstawie wartości drugiej zmiennej. W tym przypadku, na podstawie zmierzonej wartości fizycznej (absorbancji) można obliczyć stężenie analitu (białka) w badanej próbce. Proces ustalania zależności pomiędzy badanymi zmiennymi mający na celu przewidywanie wartości jednej zmiennej na podstawie wartości innych zmiennych określa się mianem regresji. Należy pamiętać, aby danej metody analitycznej używać do pomiaru stężeń analitu tylko w takim zakresie stężeń, dla jakiego została przygotowana krzywa kalibracyjna. Nie wiadomo bowiem, czy ten sam model matematyczny opisuje zależność pomiędzy zmiennymi w zakresie stężeń, który nie został przebadany. Na przykład, często powyżej określonych stężeń zależność pomiędzy stężeniem a mierzoną wielkością fizyczną przestaje być liniowa. Z kolei poniżej dolnej granicy może się okazać, że stężenie analitu jest zbyt niskie, aby było możliwe do wykrycia daną metodą. Roztwory wzorcowe powinny być przygotowane w taki sam sposób, jak badana próbka (tzn. przy zastosowaniu tych samych rozpuszczalników, lub ich mieszanek, tych samych stężeń buforów i innych związków pomocniczych), gdyż otoczenie badanej substancji może mieć wpływ na wartość mierzonej wielkości fizycznej. Na przykład, absorbancja danego związku może zależeć od rodzaju rozpuszczalnika, pH roztworu, warunków oksydoredukcyjnych itp. To samo dotyczy tzw. ślepej próby lub próby odniesienia , czyli próby w której stężenie analitu wynosi 0. Stworzenie takiego samego środowiska dla badanych próbek, roztworów wzorcowych i próby odniesienia jest niezbędnym warunkiem tego, alby uzyskane wyniki były wiarygodne. Należy mieć również na uwadze, że na mierzoną wartość wielkości fizycznej mogą mieć wpływ inne związki występujące w próbce, co może prowadzić do zafałszowania uzyskiwanych wyników. Na przykład, obecność detergentów, lub związków redukujących w próbce silnie zakłóca lub wręcz uniemożliwia pomiar stężenia białka przy użyciu większości metod kolorymetrycznych (np. metody Bradforda).
Zależności liniowe i równanie regresji liniowej
W przyrodzie bardzo często wartości różnych wielkości fizycznych są ze sobą powiązane, czyli skorelowane. Na przykład, absorbancja roztworu zależy od jego stężenia, szybkość fotosyntezy zależy od natężenia światła itp. Istnienie tych korelacji wynika z działania określonych praw fizyki. Zależności pomiędzy różnymi wielkościami fizycznymi często mają bardzo złożony charakter. Jednak w wielu przypadkach w pewnych zakresach wartości zależności złożone (nieliniowe) można przybliżyć (dokonać aproksymacji ) zależnościami prostszymi. Jedną z najczęściej stosowanych aproksymacji jest aproksymacja do zależności liniowej. O zależnościach liniowych mówi się wtedy, gdy wartości dwóch zmiennych (np. absorbancja i stężenie związku) są do siebie proporcjonalne. Zależność liniowa jest opisywana równaniem liniowym:
(8)
gdzie a i b to współczynniki równania liniowego nazywane odpowiednio współczynnikiem kierunkowym i wyrazem wolnym. Równanie prostej liniowej i regresja liniowa (sporządzenie modelu liniowego) są bardzo często wykorzystywane przy sporządzaniu krzywych kalibracyjnych. Jest to związane z tym, że zazwyczaj w pewnym zakresie stężeń mierzona wartość fizyczna jest proporcjonalna do stężenia badanego związku. Innymi słowy, pomiędzy tymi dwiema zmiennymi istnieje zależność liniowa. W przypadku metody analitycznej wartość współczynnika b określa wartość mierzonej wielkości fizycznej dla tzw. próby odniesienia. W wielu przypadkach wartość współczynnika b powinna wynosić 0. Przykładowo, absorbancja dla próby odniesienia przy dobrze wyzerowanym spektrofotometrze powinna wynosić 0. Współczynnik kierunkowy a opisujący nachylenie krzywej wzorcowej jest jednocześnie miarą czułości metody – im metoda jest czulsza, tym większa wartość współczynnika a. Znając współczynniki a i b można na podstawie zmierzonej wartości fizycznej (np. absorbacji) obliczyć stężenie określonego związku (np. białka) w badanej próbce. Współczynniki a i b można obliczyć stosując metodę najmniejszych kwadratów. Poniżej przedstawione są odpowiednie wzory:
/^ − /^ /^
/^ ^ −/^ ^
(9)
/^ − /^
(10) gdzie n – ilość sporządzonych wzorców xi – stężenie kolejnego wzorca yi – zmierzona wartość wielkości fizycznej
Po obliczeniu współczynników a i b można w łatwy sposób przewidywać wartość jednej zmiennej znając wartość drugiej zmiennej. Przykładowo, po pomiarze absorbancji A stężenie analitu c można policzy ze wzoru:
Współczynnik korelacji liniowej R, w jakim stopniu wartości dwóch cech lub wielkości fizycznych są ze sobą zależne w sposób liniowy. Zawiera się on w przedziale (-1;1), przy czym wartość 0 oznacza całkowity brak zależności, wartość 1 oznacza pełną zależność prostą, a wartość -1 oznacza zależność odwrotną (korelację ujemną lub antykorelację). Współczynnik determinacji wyrażony w procentach jest miarą dopasowania danych eksperymentalnych do modelu regresji liniowej. Jego wartość określa, jaka część zmienności jednej zmiennej (np. absorbancji) może być wyjaśniona zmiennością drugiej zmiennej (np. stężenia analitu). Przykładowo, wartość R 2 = 0,99 oznacza, że 99% zmienności jednej zmiennej może być wyjaśnione zmiennością drugiej zmiennej. 1% to wpływ innych czynników. W tym przypadku będą to głównie błędy popełnione podczas sporządzania krzywej kalibracyjnej. Dla dobrej jakości krzywej wartość R 2 powinna wynosić przynajmniej 0,999. Innym parametrem określającym jakość krzywej kalibracyjnej jest odchylenie resztkowe (nazywane również średnim odchyleniem od prostej), które miarą niepewności wyników w krzywej wzorcowej. Średnie odchylenie jest tym większe im większa jest odległość eksperymentalnie wyznaczonych punktów na wykresie od punktów teoretycznych wyznaczonych przez równanie regresji liniowej. Oblicza się je ze wzoru:
= ^
(13)
gdzie: 67 = (^) − " −.
Im większa wartość średniego odchylenia od prostej tym gorsza jakość sporządzonej krzywej kalibracyjnej. Stosowanie średniego odchylenia od prostej do szacowania jakości krzywej wzorcowej jest dużo mniej intuicyjne i jest ono używane w głównej mierze do obliczania niepewności (błędów) współczynników a i b równania liniowego:
" =^ 1 8^
1 /^ ^ − /^
. = 1 8^
1 /^ ^ − /^
(14)
Wartości sa i sb wykorzystuje sie do sprawdzenia, czy wartości współczynników a i b istotnie różnią się od zakładanych wartości teoretycznych (jeśli takie istnieją). Najczęściej sprawdza się, czy współczynnik b istotnie różni się od 0. Błąd przypadkowy dla wartości zmiennej x (tj. stężenia analitu) odczytywanej przy użyciu krzywej kalibracyjnej jest określony wzorem:
"^ 1 /^ − 1 ś^
(15) gdzie n – ilość wzorców;
m – ilość pomiarów dla każdego wzorca; yśr – średnia wartość zmierzonej wielkości fizycznej (np. absorbancji) dla wzorców; yśr – średnia wartość stężenia wzorców; yk – średnia wartość zmierzonej wielkości fizycznej (np. absorbancji) dla badanej próbki.
Ze wzoru (15) wynika, że błąd popełniany przy odczycie stężenia analitu jest: − proporcjonalny do średniego odchylenia od prostej regresji. Zatem, im dokładniej sporządzona krzywa, tym mniejszy błąd wartości stężenia analiltu odczytywanego przy jej wykorzystaniu; − odwrotnie proporcjonalny do współczynnika a. Zatem, im czulsza metoda, tym dokładniej można zmierzyć stężenie analitu; − tym mniejszy im więcej wzorców użyto do sporządzenia krzywej kalibracyjnej; − tym mniejszy im więcej razy była odczytywana wartość wielkości fizycznej (np. absorbancji) dla danego stężenia wzorca. − błąd odczytywanej wartości stężenia analitu zależy od doboru stężeń wzorcowych. Stężenia wzorcowe powinny być dobrane tak, aby możliwie równomiernie pokrywać dany zakres krzywej wzorcowej; − przy równomiernie rozłożonych stężeniach wzorcowych najmniejszy błąd odczytu z krzywej kalibracyjnej jest dla wartości yk leżącej pośrodku krzywej kalibracyjnej. Im wartość mierzonej wartości fizycznej dla badanej próbki jest bliższa jednemu z końców krzywej, tym większy błąd odczytywanej wartość stężenia analitu.
− Podczas pipetowania pipeta powinna być trzymana pionowo; − Ciecz pobieraj powolnym, płynnym ruchem tłoczka. Gwałtowne puszczenie tłoczka może spowodować zassanie cieczy do wnętrza pipety i jej nieodwracalne uszkodzenie lub konieczność czyszczenia i kalibracji! − Nigdy nie kładź pipety z nabraną cieczą poziomo. Ciecz może wlać się do wnętrza pipety! − Nigdy nie odkładaj pipety na brzegu stołu, tak aby wystawała poza obręb stołu. Taką pipetę można przypadkowo strącić na ziemię, co może doprowadzić do jej nieodwracalnego uszkodzenia! − Nie trzymaj pipety w ręce bez potrzeby. Powoduje to jej niepotrzebne ogrzewanie. Poza tym taka pipeta może przypadkowo wypaść z rąk. − Nigdy nie nastawiaj objętości poza wyznaczoną skalę, gdyż może to doprowadzić do rozkalibrowania pipety lub jej uszkodzenia. − W przypadku pipetowania lepkich cieczy końcówkę z zewnątrz można delikatnie wytrzeć ręcznikiem papierowym (usunięcie nadmiaru cieczy). − Nie zanurzaj pipety głęboko w pipetowanej cieczy, gdyż na zewnętrznych ściankach może gromadzić się dodatkowa porcja cieczy, co zwiększa niedokładność pipetowania. − Pamiętaj o zmianie końcówek przy pipetowaniu różnych odczynników, aby nie spowodować ich zanieczyszczenia. − Pamiętaj, aby podczas dozowania cieczy nie zanurzać końcówki (nie dotyczy pipetowania małych objętości). W przypadku dozowania małych objętości (kilkadziesiąt mikrolitrów i mniej) można końcówką pipety dotknąć powierzchni cieczy (ale nie zanurzać końcówki głęboko pod powierzchnię).
10.2.1. Nauka prawidłowego i dokładnego pipetowania
Celem ćwiczenia jest nauka prawidłowego korzystania z nastawnej pipety automatycznej.
Postępowanie Do 5 ependrofek odpipetować następujące ilości poszczególnych barwników:
nr próby oranż G [μl] błękit bromofenolowy [μl] ksylenocyjanol [μl] 1 20 100 30 2 50 40 60 3 50 100 — 4 90 — 60 5 80 70 —
W każdej ependorfce powinno być 150 μl cieczy. Ustaw pipetę na taką objętość i pobierz zawartość ependorfki. Sprawdź, czy w ependorfce pozostała ciecz, czy też jej zabrakło (w końcówce pipety pojawił się bąbel powietrza). Swoje obserwacje skonsultuj z prowadzącym ćwiczenia. W przypadku dużych błędów w pipetowaniu powtórz ćwiczenie.
Materiały i odczynniki − Pipeta automatyczna w zakresie 20-200 μl − Probówki typu Eppendorf 1,5 ml (ependorfki) − Końcówki do pipet − Roztwory barwników: 0,25% Oranż G, 0,25% błękit bromofenolowy oraz 0,25% ksylencyjanol
10.2.2. Sprawdzanie kalibracji pipety automatycznej
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się ze sposobem sprawdzania kalibracji pipety nastawnej.
Postępowanie
- Ustaw pipetę na 100 μl.
- Dziesięć razy dozuj wodę destylowaną do zlewki umieszczonej na wadze za każdym razem zapisując masę wody.
- Powtórz to samo dla objętości 500 μl i 1000 μl.
Opracowanie wyników
- Przelicz masę wody na jej objętość (gęstość wody w temp 20°C wynosi 0,9982 g/cm 3 ).
- Dla każdej serii danych zastosuj test Q-Dixona, aby wyeliminować ewentualne błędy grube.
- Dla każdego zakresu oblicz:
- Maksymalny rozrzut
- Średnią;
- Odchylenie standardowe (niepewność pojedynczego pomiaru) i błąd standardowy (niepewność średniej 10 pomiarów);
- Testem t-Studenta sprawdź, czy uzyskane średnie istotnie różnią się od wartości oczekiwanych (ustawionych wartości pipety).
- Porównaj uzyskane wyniki (maksymalny rozrzut, średnia i odchylenie standardowe) z wynikami uzyskanymi przez inne grupy i wyciągnij wnioski.
Materiały − Pipeta automatyczna w zakresie 100-1000 μl − Końcówki do pipet − Woda − Naczynie wagowe − Waga
10.2.3. Pomiar gęstości roztworu sacharozy
Celem ćwiczenia jest nauka pipetowania roztworów o dużej gęstości.
Postępowanie
- Sporządź 50 g 40% roztworu sacharozy.
- Ustaw pipetę na 1000 μl.
- Dziesięć razy dozuj roztwór sacharozy do zlewki umieszczonej na wadze za każdym razem zapisując masę roztworu. Do dozowania zastosuj pipetowanie odwrotne. Pamiętaj, aby przez dozowaniem wytrzeć z zewnątrz końcówkę pipety.
Opracowanie wyników
- Dla każdego wyniku oblicz gęstość roztworu sacharozy.
- Zastosuj test Q-Dixona, aby wyeliminować ewentualne błędy grube.
- Oblicz:
- Średnią gęstość;
- Odchylenie standardowe (niepewność pojedynczego wyniku) i błąd standardowy (niepewność średniej 10 pomiarów);
- Testem t-Studenta sprawdź, czy uzyskana średnia wartość istotnie różni się od wartości oczekiwanej (gęstość 40% roztworu sacharozy w 20°C wynosi 1176,48 kg/m 3 ).
Opracowanie wyników
- Wyniki pomiarów należy umieścić w tabeli, wiedząc że ε dla DCIP przy λ = 600 nm wynosi 16 100 dm 3 /mol cm. końcowe teoretyczne stężenie DCIP [ μμμμ M]
A 600
końcowe stężenie DCIP wyznaczone na podstawie A 600 A 1 A 2 A 3 A 4 A 5 Aśrednia^ [ μμμμ M]
5 10 15 20 25 35 45 50 60 70
- Na podstawie tabeli wykreślić, na papierze milimetrowym, krzywą dla zależności średniej absorpcji przy λ = 600 nm ( y ) od stężenia DCIP ( x ).
- Wyznaczyć metodą najmniejszych kwadratów prostą (krzywą standardową), podać równanie prostej regresji oraz współczynnik korelacji dla zależności A600nm = f (mM DCIP). Umieścić wyznaczoną krzywą standardową na wykresie przygotowanym w podpunkcie 2. Obliczenia załączyć do sprawozdania.
- Obliczyć odchylenie standardowe dla wyznaczonej krzywej wzorcowej.
Materiały i odczynniki
- 100 μM wodny roztwór DCIP (dichlorofenyloindofenol)
- 10 probówek szklanych
- pipeta automatyczna o zakresie od 100 do 1 000 μl
- pipeta automatyczna o zakresie od 1 do 5 ml
- plastikowe kuwety spektrofotometryczne o pojemności 1,5 ml
- spektrofotometr VIS
10.2.5. Wykorzystanie metody najmniejszych kwadratów do sporządzenia krzywej wzorcowej do oznaczania ilości białka metodą Bradforda Bradford M.M (1976) Anal. Biochem. 72, 248-
Postępowanie
- W probówkach, na podstawie tabeli, sporządzić po 9 ml roztworów, zawierających różne ilości BSA z odczynnikiem Bradforda.
nr próby
ilość roztworu BSA [μl]
H 2 O
[μl]
odczynnik Bradforda [ml]
1 0 300 2, 2 15 285
- Przed przystąpieniem do pomiarów należy dodać do kuwety 3 ml roztworu z probówki 1 (próba zerowa) i przy długości fali 595 nm ustawić wartość absorpcji, wskazywaną przez spektrofotometr, na 0.
- Z każdej probówki pobrać kolejno do kuwety spektrofotometrycznej po 3 ml roztworu (od probówki nr 2 do nr 6) i zmierzyć, za pomocą spektrofotometru, absorpcję przy długości fali 595 nm. Pomiar wartości absorpcji należy powtórzyć trzykrotnie, po każdym odczycie kuwetę należy opłukać wodą i dokładnie osuszyć.
Opracowanie wyników
- Wyniki pomiarów należy umieścić w poniższej tabeli.
μg BSA
A 595
A 1 A 2 A 3 Aśrednia 5 10 15 20 40
- Na podstawie tabeli wykreślić, na papierze milimetrowym, krzywą dla zależności średniej absorpcji przy λ = 595 nm ( y ) od ilości BSA ( x ). Uwzględnić, że gdy w mierzonej próbie nie ma białka, w warunkach naszego doświadczenia wartość A595nm = 0.
- Wyznaczyć metodą najmniejszych kwadratów prostą (krzywą standardową), podać równane prostej regresji oraz współczynnik korelacji dla zależności A595nm= f (μg BSA). Umieścić wyznaczoną krzywą standardową na wykresie przygotowanym w podpunkcie 2. Obliczenia załączyć do sprawozdania.
- Obliczyć odchylenie standardowe dla wyznaczonej krzywej wzorcowej.
- Na podstawie krzywej wzorcowej wyznaczonej metodą najmniejszych kwadratów wyznaczyć stężenie białka i wyrazić je w mg/ml dla roztworu, którego absorpcja przy λ = 595 nm wynosi 0,42. Porównać tą wartość z wartością wyznaczoną graficznie na podstawie krzywej z punktu 2.
10.3. WIROWANIE
10.3.1. Izolacja chloroplastów
Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z podstawowymi metodami frakcjonowania komórki przy użyciu homogenizacji, wirowania oraz wirowania w gradiencie sacharozy. Podczas ćwiczenia studenci wyizolują chloroplasty z liści groszku i sprawdzą ich aktywność.
Postępowanie
Sporządzanie roztworów
Bufor do homogenizacji (250 ml) Do 200 ml dejonizowanej wody dodaj: 0,35 M Sorbitol 15,95 g 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) 12,5 ml 1 M Tris-HCl 5 mM EDTA 2,5 ml 0,5 M EDTA 0.1% BSA 250 mg Po rozpuszczeniu wszystkich składników uzupełnij dejonizowaną wodą do 250 ml. Przed użyciem dodaj 250 μl β-merkaptoetanolu.
Bufor do płukania (150 ml) Do 80 ml dejonizowanej wody dodaj: 0,35 M Sorbitol 9,57 g 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) 7,5 ml 1 M Tris-HCl 2,5 mM EDTA 0,75 ml 0,5 M EDTA Po rozpuszczeniu wszystkich składników uzupełnij wodą do 150 ml.
52% roztwór sacharozy (100 ml) Do 50 ml dejonizowanej wody dodaj: Sacharoza 52 g 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) 5 ml 1 M Tris-HCl 2,5 mM EDTA 0,5 ml 0,5 M EDTA Po rozpuszczeniu wszystkich składników uzupełnij wodą do 100 ml. W przypadku niecałkowitego rozpuszczenia sacharozy zlewkę lekko podgrzej.
30% roztwór sacharozy (100 ml) Do 50 ml dejonizowanej wody dodaj: Sacharoza 30 g 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) 5 ml 1 M Tris-HCl 2,5 mM EDTA 0,5 ml 0,5 M EDTA Po rozpuszczeniu wszystkich składników uzupełnij wodą do 100 ml.
Wszystkie roztwory po sporządzeniu należy schłodzić w lodzie.
Przygotowanie gradientu sacharozy Do próbówki wirówkowej 28 ml nanieś na dno 10 ml 52% roztworu sacharozy. Następnie ostrożnie nanieś 10 ml 30% roztworu sacharozy. Przygotowane gradienty trzymaj w lodzie do czasu ich użycia.
Preparacja chloroplastów
- Z siewek grochu zbierz 50 g młodych zdrowych liści.
- Liście umieść w schłodzonym homogenizatorze.
- Dodaj 250 ml buforu do homogenizacji i homogenizuj 30s.
- Homogenizat przefiltruj przez tetrową pieluchę.
- Homogenizat przenieś do czterech probówek wirówkowych 60 ml.
- Wiruj przez 5 minut przy 1000g w 4°C.
- Zlej supernatant, a osad delikatnie zawieś pędzelkiem w 5 ml buforu do płukania.
- Zawiesinę ostrożnie nanieś na przygotowany gradient sacharozy.
- Wiruj przez 45 minut przy 5500g w 4°C w rotorze horyzontalnym.
- Przyjrzyj się rozmieszczeniu zielonych prążków na uzyskanym gradiencie. Używając pipetki pasterowskiej delikatnie zbierz chloroplasty z granicy faz 52%/30% i przenieś do nowej probówki wirówkowej.
- Dodaj 15 ml buforu płuczącego. Zawartość probówki delikatnie wymieszaj i wiruj przez 15 minut przy 1500g w 4°C.
- Ostrożnie usuń supernatant.
- Preparat zawieś w 0,5 ml wody destylowanej.
Wyznaczanie widma chlorofilu
- Do probówki wlej 6 ml 80% acetonu i zawieś w nim 30 μl uzyskanego preparatu chloroplastów.
- Po 5 minutach inkubacji zawartość probówki przefiltruj przez krążek z bibuły filtracyjnej.
- Zmierz widmo przygotowanego preparatu w zakresie światła widzialnego.
Opracowanie wyników
- Narysuj schemat gradientu sacharozy po wirowaniu. Opisz, jakie składniki komórki znajdują się na poszczególnych poziomach gradientu.
- Narysuj widmo chlorofilu i podaj długości fal, przy których występują maksima absorpcji.
- Napisz, jaką rolę pełnią poszczególne składniki buforów i roztworów używanych podczas preparacji chloroplastów.
- Napisz, jakie procesy zachodzą w kolejnych etapach preparacji chloroplastów.
Materiały i odczynniki − Pipety automatyczne − Pipety pasterowskie − Zlewki − Cylindry miarowe − Lejek − Bibuła filtracyjna − Kuwety szklane lub kwarcowe − Mieszadła magnetyczne − Końcówki do pipet − Sacharoza − Dwutygodniowe siewki groszku. − Sacharoza − Sorbitol − 1 M Tris-HCl, pH 8, − 0,5 M EDTA, pH 8, − Bufor DCIP (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM sacharoza, 50 mM KCl, 0,5 mM DCIP) − 80% aceton
