Aislamiento y Purificación de Ácidos Nucleicos: DNA y RNA | Study notes Genetics

Aislamiento de material genico (genético)

Extracción y purificación de ácidos nucleicos

Un detalle importante es que en el titulo de la clase no se puso extracción y purificación de ADN (o

DNA) y tampoco se puso extracción y purificación de RNA. La razón es que los métodos que se

revisaran básicamente coextraen ambos acidos nucleicos. Los principios por los que se separan los

ácidos nucleicos del resto de las macromoléculas y estructuras celulares no son capaces de poder

diferenciar el DNA del RNA, por lo tanto, es una constante siempre que se quiera extraer RNA o

DNA se debe esperar que exista un porcentaje de coextracción.

¿Por qué si extraemos DNA genómico aparece RNA? o ¿Por qué si se está extrayendo RNA total

aparece DNA genomico? La respuesta es por el principio que se esta utilizando para separar esas

macromoléculas del resto.

Siempre es una posibilidad que hay que verificar con una prueba específica para determinar si se

tiene el otro acido nucleico como contaminante y así nace el término que se ocupa en este

procedimiento en que se puede tener DNA genómico contaminante o RNA total contaminante.

Por ello después de la purificación hay un paso adicional en donde se degrada selectivamente el

acido nucleico que no nos interesa.

Hoy todo lo relacionado con técnicas de biología molecular clásicas (como extracción) es un

negocio donde muchas empresas han desarrollado soluciones comerciales para poder desarrollar

esta metodología. Esto es lo que llamamos kits. Simplificando el procedimiento y permitiendo

acceder a niveles de pureza que con métodos manuales sin kits no alcanzaríamos. Esto es

relevante para técnicas rio abajo que exigen una alta calidad del material genético que se utilizara.

Por ejemplo técnicas que requieren alto nivel de pureza y de integridad es RNA seq, esto es

porque cualquier contaminante puede servir de inhibidor de las enzimas que participan en la

secuenciación del transcriptomas.

Todos los kits comerciales fueron desarrollados y optimizados en especies modelos. Pero si uno

trabaja con una especie que no es un organismo modelo probablemente las matrices cambian y la

eficiencia de estos kits comienza a disminuir. El problema es que muchos de los componentes

claves de la manera que vienen los reactivos de los kits hacen imposible que se pueda estandarizar

o cambiar alguna variable para mejorar el rendimiento. No hay manera de arreglar el kit. Por ello

en algunas áreas de la biología moléculas los kits no son la primera opción, como por ejemplo fue

así con las plantas por muchos años.

Hoy eso ha ido cambiando, empresas han desarrollado kits par arroz, maíz, tomate, etc y no solo

has, sino que raíz, flores, e incluso frutos (los que son una matriz particularmente compleja para

extracción de ácidos nucleicos).

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Aislamiento de material genico (genético) Extracción y purificación de ácidos nucleicos Un detalle importante es que en el titulo de la clase no se puso extracción y purificación de ADN (o DNA) y tampoco se puso extracción y purificación de RNA. La razón es que los métodos que se revisaran básicamente coextraen ambos acidos nucleicos. Los principios por los que se separan los ácidos nucleicos del resto de las macromoléculas y estructuras celulares no son capaces de poder diferenciar el DNA del RNA, por lo tanto, es una constante siempre que se quiera extraer RNA o DNA se debe esperar que exista un porcentaje de coextracción. ¿Por qué si extraemos DNA genómico aparece RNA? o ¿Por qué si se está extrayendo RNA total aparece DNA genomico? La respuesta es por el principio que se esta utilizando para separar esas macromoléculas del resto. Siempre es una posibilidad que hay que verificar con una prueba específica para determinar si se tiene el otro acido nucleico como contaminante y así nace el término que se ocupa en este procedimiento en que se puede tener DNA genómico contaminante o RNA total contaminante. Por ello después de la purificación hay un paso adicional en donde se degrada selectivamente el acido nucleico que no nos interesa. Hoy todo lo relacionado con técnicas de biología molecular clásicas (como extracción) es un negocio donde muchas empresas han desarrollado soluciones comerciales para poder desarrollar esta metodología. Esto es lo que llamamos kits. Simplificando el procedimiento y permitiendo acceder a niveles de pureza que con métodos manuales sin kits no alcanzaríamos. Esto es relevante para técnicas rio abajo que exigen una alta calidad del material genético que se utilizara. Por ejemplo técnicas que requieren alto nivel de pureza y de integridad es RNA seq, esto es porque cualquier contaminante puede servir de inhibidor de las enzimas que participan en la secuenciación del transcriptomas. Todos los kits comerciales fueron desarrollados y optimizados en especies modelos. Pero si uno trabaja con una especie que no es un organismo modelo probablemente las matrices cambian y la eficiencia de estos kits comienza a disminuir. El problema es que muchos de los componentes claves de la manera que vienen los reactivos de los kits hacen imposible que se pueda estandarizar o cambiar alguna variable para mejorar el rendimiento. No hay manera de arreglar el kit. Por ello en algunas áreas de la biología moléculas los kits no son la primera opción, como por ejemplo fue así con las plantas por muchos años. Hoy eso ha ido cambiando, empresas han desarrollado kits par arroz, maíz, tomate, etc y no solo has, sino que raíz, flores, e incluso frutos (los que son una matriz particularmente compleja para extracción de ácidos nucleicos).

Tecnologias de purificacion de DNA Existen distintos tipos de soluciones comerciales o kits que utilizan distintos principios para la extracción y purificación de acidos nucleicos.

Extracción organica: Tenemos una primera generación de kits que se basan en la disponibilidad de un reactivo que tiene mezcla de solventes organicos que permiten romper las células y purificar el material genético. Su eficiencia dependía del tipo de muestra a analizar. Diseñados para muestras como células en cultivo, tejidos, sangre y muestras vegetales (muy poco eficiente hace unos años). Utilizan un reactivo, el nivel de pureza es medio porque al utilizar solventes organicos es fácil que queden remanentes del solvente en la solución final (fuente interferente de actividad enzimática). La cantidad de muestra que se puede utilizar es baja. Las ventajas es la efectiva lisis que hace. Es útil para muestras con muchos compuestos fenólicos e interferentes como enzimas. Su gran ventaja es el ahorro de tiempo. Sus dificultades es la manipulación de los solventes organicos, ya que la mayoría son irritantes, por lo que necesitamos una campana de extracción de vapores. En general se recomienda el uso de muestras animales.
Columna: Una segunda mejora a las soluciones comerciales fue la incorporación de columnas, las que tienen una matriz capaz de unir acidos nucleicos de manera selectiva y separar del resto de la matriz, purificando. Nivel amplio de muestras porque la columna interactua con el lisado del tejido. Se requiere equipamiento como centrifuga, si se trabaja con RNA se necesita refigerador, tambien se recomienda a veces una bomba de vacio para mejorar el desempeño de la columna. La puerza es alta (porque esa es la función de la columna). La cantidad es de media a alta dependiendo de la capacidad de carga de la columna, recordemos que la columna tiene un sustrato, que puede ser una membrana o una silica. Si se excede ese limite se pierde el material porque al saturar la membrana no podrá retener mas acido nucleico y el remanente se perderá con el resto del debris celular. Ventajas es que es muy fácil de utilizar, procesa muestras DNA y RNA con alta pureza. La cantidad es relativa, no tiene un rendimiento con muy alta cantidad. Dificultades es que las columnas se pueden tapar debido a impurezas especialmente y la capacidad de carga es limitada.
Esferas magnéticas: Una de las ultimas mejoras tiene que ver con el uso de esferas magneticas que están cubiertas con silica y permiten no depender de una columna y nos permite tener mayores niveles de cantidad de acidos nucleicos purificados y un nivel de purificación alto. Tiene restricciones, como comprar una gadrilla que permita atrapar las esferas para que queden en una de las paredes del tubo y poder eluir el resto de debris celular. Es la técnica mas moderna. Sus ventajas es que no se tapa, tiene la mayor eficiencia, mayor cantidad de material purificado, rápido para recolectar el material, susceptible a ser automatizado. Se recomienda para muestras que provengan de matrices difíciles de extraer y para muestras que requieren una gran cantidad de material genético

c) Los enlaces glicosidicos de las bases purinas (Adenina y guanina) se hidrolizan de pH 3 y menos.

Temperatura a) Se debe considerar la temperatura de estabilidad de los puentes de hidrogeno de la doble hebra, el DNA pierde su forma en doble hebra en un rango de 80-90°C (denaturación). b) Los enlaces fosfodiéster y los enlaces glicosídicos se rompen de 100°C para arriba (lo que se evita).
Fuerza ionica La concentración de iones en la solución se relaciona con la concentración salina, y si se tiene concentraciones de baja fuerza ionica, menores a 0,05M, los enlaces de hidrogeno se empiezan a debilitar. Entonces, se necesita un ambiente relativamente polar para que los enlaces H se mantengan estables entre las hebras complementarias. Por ello se agrega una cantidad superior a 0,05M en el medio para mantener la doble hebra.
Condiciones celulares a) Muchas veces se nos olvida que todas las células son diferentes, y para romperlas hay un gran conjunto de células que no tiene dificultad para producir su lisis, pero hay otras células con estructuras que dificultan el acceso a los ácidos nucleicos. Por ejemplo, las células vegetales (ej. Bacillus subtilis) y las levaduras. Esas son células muy utilizadas, romper la pared celular no es algo tan trivial, sino que se agrega un paso adicional para ello. Hay métodos mecánicos (pueden comprometer la integridad del material genético) y métodos enzimáticos (más caros) para ello. Las levaduras tienen una pared mucho mas rígida, por ello hay metodología específica para romper levadura. b) Por efecto de la ruptura de la celula se liberan nucleasas que degradan el material genético (RNAasa como DNAasa). Entonces se deben tomar precauciones para evitar que estas enzimas degraden nuestra muestra, por ello nunca se debe olvidar agregar inhibidores enzimáticos de ribonucleasa y desoxirribonucleica. c) Las histonas deben ser disociadas del ADN durante el proceso de extraccion. Pero los protocolos tienen detergentes que denaturan todas las proteínas eficientemente.
Estrés mecanico en el DNA (manipulación del material genético) Hay distintos pasos en el protocolo de extracción, donde se mezlcan reactivos, se rompen las células, se agita la muestra, y estos procedimientos pueden escisiones a las cadenas de DNA. Esto usualmente no daña la estructura secundaria del DNA, pero reduce el largo de las moléculas (fragmentación, perdida de integridad del material genético). Esto se llama grado de degradación. También, la viabilidad de la integridad del DNA tiene límite, con el tiempo se fragmenta sola una muestra de DNA almacenadas. Por ello el estudio de genomas ancestrales rescatados de momias por ejemplo es considerado todo un arte, ya que se reconstruyen fragmentos de genomas a partir de DNA que por definición esta fragmentado. La manipulación debe ser lo mas sutil posible.

El RNA al ser de hebra simple es tremendamente lábil (inestable), por ello con el se deben tomar todas las precauciones necesarias, ya que el RNA se degrada fácilmente. Hay reactivos que evitan que se rompa y prolongan su vida. En la biología molecular se trata de no almacenar RNA extraído y purificado porque se sabe que se degradará en pocas semanas, por ello lo que se hace es extraerlo y convertirlo en cDNA inmediatamente (con transcriptasa reversa). cDNA alarga la expectativa de vida por meses, la autodegradación es mas lenta. Etapas de la extraccion de DNA

Rompimiento celular o homogenización de la célula: los tejidos son matrices heterogéneas donde se pueden distintos tipos de células y matrices extracelulares. Muchos de estos protocolos inician con rompimiento en frio, especialmente cuando se busca un nivel de integridad mayor. Se congela el tejido y se rompe, disminuyendo la posibilidad que las nucleasas se activen.
Lisis celular, detergentes/lisosomas: generalmente va acompañado con un conjunto de reactivos químicos que estimulan la lisis, permitiendo que los lípidos y proteinas sean precipitadas y aglomeradas, separándolas del resto de la matriz dejando en solución a los ácidos nucleicos.
Agentes quelantes EDTA/citrato: Por las nucleasas que se activan por la ruptura masiva el agregar reactivos que sean capaces de quelar cationes divalentes es una estrategia muy importante. La mayoría de las nucleasas tienen cationes divalentes como cofactores, por lo tanto si se secuestran esos iones las enzimas son menos activas o dejan de ser activas. El citrato se agrega a veces para contribuir al pH del medio.
Agentes proteasas, proteasa K (o proteinasa k): las proteínas son abundantes en las células, por ello especialmente en extraccion de DNA existe el uso de proteasas. La proteasa K rompe cualquier tipo de proteína, por ello esta formulada en la mayoría de kits de extraccion de ADN.
Extracción con fenol, fenol/cloroformo: se separan los acidos nucleicos de todo el resto de debris celular. Para eso se utiliza una mezcla 1:1 de fenol/cloroformo con respecto a la regio acuosa y esta mezcla agua-fenol-cloroforma formara 2 fase: una fase apolar donde quedan retenidos los lípidos y proteínas fuertemente denaturadas; y en fase acuosa quedaran los ácidos nucleicos preferentemente.

integridad y la pureza del DNA. Y dependiendo de cuanto DNA genomico obtuve y cuanto RNA contaminante se diseña un paso de degradación selectivo de degradación selectivo del RNA total con el uso de ARNasas. Método de extraccion usando un kit Esta es la alternativa comercial, la diferencia con una estrategia manual es que en un mismo tuvo de hace la optimización de la muestra, se precipita el DNA, se lava el DNA y se estabiliza con un reactivo final o con agua el DNA. Se usan solo 3 pasos para la extraccion, ahorrando tiempo. Purificación del DNA usando columnas con sílica (silica)

La segunda generación de kits incorporó columnas, las que retienen el acido nucleicos selectivamente, separando eficientemente el acido nucleico siendo colectado en un tubo de elución. Luego se incorpora un reactivo especial que compita con la unión entre la membrana y el acido nucleico o la silica y el acido nucleico para liberarlo y resuspenderlo. Aquí se tiene un resultado de un kit comercial, donde se muestra la estandarización que han hecho en distintas matrices y/o tipos de tejidos y células para mostrar el nivel de rendimiento. En la imagen B, se ven los distintos carriles en gel de agarosa y se tiene la muestra de DN genomico extraidas con este kit. Los carriles 1 y dos bacterias, hay ausencia de degradación porque no hay otras bandas a menor peso molecular. Se ve la integridad del material genómica. En los carriles 3,4,5,6 y 7 son líneas de cultivo celular (humano y rata). Si se usa raíz de ortiga puede que ese resultado no sea la realidad, por ello cuando nos ofrecen un kit se debe pedir una muestra para probar la eficiencia del kit en nuestra muestra experimental. Aquí muestran la integridad de nuestro material genico se visualiza en electroforesis de gel de agarosa. Recordar que como el DNA genomico es una molecula de alto peso molecular, el gel de agarosa no es el mismo que se usa para ver producto de PCR, es un gel con un porcentaje de agarosa (0,5% o 0,6%) para geles donde se quiere ver DNA genomico. Extraccion de RNA total Es similar, se tiene los mismos tipos de kit: basado en solvente orgánico; columnas; esferas magnéticas y adicionalmente un tipo particular de matriz para un tipo de aplicación en particular (Lisado crudo, no muy común, máximo nivel de tecnología). El lisado crudo tiene que ver con que se puede hacer la extraccion y el PCR inmediatamente sin pasos intermedios, el buffer de lisis no tiene inhibidores respecto a la transcriptasa reversa y al PCR (se puede hacer PCR inmediatamente

Tiene más pasos y puede haber variables que no estén controladas, pudiendo perder cantidad o integridad de material genético.

Antes de empezar se agrega un paso en donde se tratan todos los reactivos y materiales que tendrán contacto con el RNA con agua con DEPC, de manera que se inhiben las RNasa. Y luego se empieza con la metodología que tiene las mismas etapas que las de DNA
Homogenizar el tejido: max 4°C, se ocupa nitrógeno liquido para enfriar al máximo, inhibiendo la activación de nucleasas y otras enzimas que puedan degradar el material genico.
Lisis celular
Proteasas para romper proteinas y algunos solventes caotropicos como el tiocianato de guanidinio para precipitar el RNA.
Limpieza de extraccion con fenol /cloroformo (tambien puede ser con alcohol isoamílico)
Precipitación y lavados con alcohol al 70%. Luego de eso se vuelve a precipitar.
Se resuspende el RNA en agua ultrapura si se quiere ocupar inmediatamente o con buffer estabilizador para almacenar. Purificación de mRNAs usando columnas de afinidad En las columnas de purificación de acidos nucleicos genérica se hace simplemente la capturacion del acido nucleico con un tema de cargas eléctricas, por lo tanto no se discrimina entre DNA y RNA. Pero en este caso se puede hacer un cambio si se quiere solo los RNA mensajeros, para eso

hay columnas especificas que tienen oligo dT (poly dT) en sus paredes y por ello son complementarias a las colas de poliadenilacion (estructura especifica del mRNA maduro eucariótico), secuestrando todo el mRNA en la columna. Luego se eluye todo el resto de debris para ser eliminado. Despues se libera el RNA mensajero y se resuspende en agua o un buffer especial. Los mRNAs son una pequeña fracción del RNA total Por ello hay kits específicos para purificar mRNA. Hay dos tipos de columnas útiles para este procedimiento (silica o membrana de fibra de vidrio de purificación), pero la anterior comentada es realmente especifica (oligo dT). Electroforesis en gel de agarosa para visualizar los productos purificados El RNA es de menor peso molecular que el DNA, por lo que se ve diferente. Dependiendo del tamaño de las moléculas de ácidos nucleicos a separar es la concentración del gel a utilizar

Por espectrofotometría se mide la concentracion de acido nucleico, pero lo que mide en realidad el espectrofotómetro es la concentración a 260 nm, longitud de onda en que absorben los acidos nucleicos, pero no hay manera de saber si se tiene DNA, RNA o ambos. Lo que se ve es la absorbancia total que se traduce en concentracion. Otra información relevante obtenida por espectrofotometría es la posibilidad de tener contaminación por proteinas o carbohidratos, la relación de la absorbancia 260/280 da la contaminación por proteínas de mi muestra y carbohidratos. En plantas es común que se contamine la muestra con carbohidratos porque la pared celular esta hecha de ellos y muchos tejidos vegetales los acumulan. Y la relación de abs 260/230 dara la contaminación de por carbohidrato. ¿Cuándo esta contaminado? Cuando el valor de abs 260/ es menor a 1.8. Cuando se quiere obtener especialmente RNA para aplicaciones que se requieren a muy precisa determinación de concentración de mi RNA en la muestra, porque por espectrofotometría hay mucha evidencia que sugiere que el espectrofotómetro tiende a sobre estimar la cantidad de acido nucleico en la muestra. Por lo que para una determinación precisa de concentración se usa el Fluorómetro. Los que detectan emisión de fluorescencia de reactivos que fueron diseñados para unirse al RNA o al DNA. Por lo tanto, aunque este RNA y DNA presencia no habrá interferencia y habrá una cuantificación absoluta. Para obtener la integridad con una alta resolución se recomienda electroforesis capilar La electroforesis capilar es el estándar para estimar el grado de integridad del RNA que se extrajo y purificó. Aquí se muestra el resultado de un kit, donde se tiene la interfase de equipo comercial de electroforesis capilar que funciona con unos chips específicos que son capaces de obtener la integridad de RNA de manera específica. Ahí se comparan 3 kits de una empresa particular, y se ve la relación 2:1. El resultado de TRIzol Plus mantiene los niveles de cantidad que se obtiene y no tiene una banda al final de RNA degradado, mostrando que la integridad esta optima para este tipo de muestra (mejor que con los otros kits).

Podemos usar kits modernos para seleccionar distintos tipos de RNAs de la muestra biológica La columna central muestra un kit de asilamiento de micro ARNs. Eso significa que la relevancia de este tipo de RNA es alta, por ello se le diseño un kit comercial. Para el estudio de mRNAS poco abundantes es recomendable eliminar los rRNAs Al estudiar RNAs poco abundantes y genes que no tienen cambios de expresión muy importantes, es relevante sacar el ruido experimental posible para hacer visibles esas pocas moléculas de esos RNAs que tendremos en la muestra. Una de las estrategias usadas especialmente en la confección de transcriptomas o RNA seq es hacer una depleción del RNA ribosomal. Entonces, antes de transformar el RNA a cDNA se remueve el RNA ribosomal selectivamente de la mezcla y luego aplicar la transcriptasa reversa. Se ha evidenciado un grado de interferencia por exceso de RNA ribosomal en la eficiencia de la transcriptasa reversa, y para poder un transcriptoma de alta calidad se recomienda este tipo de técnica que genera una depleción del RNA ribosomal de manera selectiva.

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