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Ch.7 Carbohydrates and glycobiology
- Carbohydrates 의 역할과 활용 o Carbohydrate 는 에너지원, 바이오연료, 치료제, 진단 분야 등 다양한 분야에서 중요한 역할 수행 o 에너지 및 영양 (Energy & Nutrition) ▪ 인체의 주요 에너지원, 특히 뇌의 주요 에너지원 ▪ 식이섬유 (Dietary fiber, e.g., 𝛽-glucan): 심혈관 건강 및 혈당 조절 지원 o 바이오연료 (Biofuels) ▪ Starch 와 Cellulose 를 이용해 Bioethanol 생산 ▪ 옥수수(corn) 또는 사탕수수(sugarcane) 유래 Carbohydrate 발효 o 치료제 (Therapeutics) ▪ Glycoengineering: 치료용 단백질 기능 강화 (e.g., mAb 의 ADCC 증진) ▪ EPO glycosylation: 반감기(half-life) 연장, 주사 빈도 감소 o 진단 (Diagnostics) ▪ Glycan marker (e.g., 암의 Tn antigen): 질병 진단에 활용 ▪ Glycan array: Carbohydrate–protein 상호작용 프로파일링
- 탄수화물의 역사적 배경 연도/기간 인물/개념 주요 업적 1747 Marggraf 건포도에서 Glucose 분리 Late 18th C. Lavoisier 설탕이 C, H, O 로 구성됨 확인 , 1844 Schmidt (^) Carbohydrate 용어 정의 (C𝑛(H 2 O)𝑛) 1880 – 1890s Fischer 설탕의 Stereochemistry 해명 (1902 년 노벨상) 1930s Haworth (^) Cyclic sugars 정의 및 Vitamin C 합성 (1937 년 노벨상) 1947 Cori & Cori Glycogen–Glucose cycle 규명 (1947 년 노벨상) 1980s–1990s (^) Glycobiology 학문 분야 등장 2000s–현재 Fc-glycan engineering 및 Glycan profiling 발전
- Carbohydrate 정의 및 분류 o 정의 (Definition) ▪ Carbohydrates: 최소 2 개 이상의 hydroxyl (OH) 그룹을 가진 Aldehydes 또는 Ketones, 혹은 가수분해 시 이 러한 단위를 생성하는 화합물 ▪ 대부분의 경우 실험식 (CH 2 O)𝑛 을 따름 o 분류(Classes) Classes (^) 단위수 Example (^) 특징 Monosaccharides 1 D-glucose 가장 단순한 단위 Disaccharides 2 Sucrose (^) Glycoside 결합 Oligosaccharides 3 - 10 Maltotriose (^) 중간 길이 Polysaccharides 10 Celluose, Glycogen 긴 중합체
- Monosaccharides: 구조 및 입체화학 (Stereochemistry) o Monosaccharide 는 Di-, Oligo-, Polysaccharide 의 기본 구성 요소 o 구조 ▪ 하나의 Carbonyl group (Aldehyde 또는 Ketone)과 다수의 Hydroxyl groups 를 가진 비분지형 사슬 구조. ▪ Aldoses: Carbonyl 그룹이 말단 탄소에 위치 (e.g., Glucose) ▪ Ketoses: Carbonyl 그룹이 내부에 위치 (e.g., Fructose) ▪ 탄소 수에 따른 분류: - Trioses (3C): Glyceraldehyde - Pentoses (5C): Ribose (RNA), 2-deoxy-D-ribose (DNA) - Hexoses (6C): Glucose, Fructose o 입체화학 (Stereochemistry) ▪ Monosaccharide 는 여러 개의 Chiral centers (비대칭 탄소)를 가짐. ▪ Chirality 는 2 𝑛개의 입체 이성질체를 생성 (𝑛 = chiral center 수). o D/L 이성질체 ▪ D/L 시스템은 Carbonyl 그룹에서 가장 먼 Chiral carbon 의 OH 위치를 기준으로 결정. - D-isomer: OH가 오른쪽에 위치 (e.g., D-glucose) - L-isomer: OH가 왼쪽에 위치 (e.g., L-glucose) ▪ 대부분의 천연당은 D-isomer ▪ 효소의 입체 특이성 (Stereospecificity): 인체 효소는 D-glucose 의 3D 형태에 맞게 진화하여 D-glucose 만 인식하고 대사 ,. o Epimers ▪ Epimers 는 단 하나의 Chiral carbon 에서만 입체 구조가 다른 이성질체. - 예시: D-glucose 와 D-galactose 는 C4 에서 Epimer 관계. o 감미 수용체 (Sweet Receptors) ▪ TAS1R2 / TAS1R3 GPCR 이 혀에 존재하며 단맛 화합물 감지. ▪ 수용체 포켓에 정확히 맞는 3D 구조(e.g., L,L-Aspartame)만이 활성화 가능.
- Monosaccharide 의 고리화 (Cyclization) o 선형 vs. 고리형 ▪ 수용액에서 Monosaccharide 는 >99%가 Cyclic form 으로 존재. ▪ 고리형은 Carbonyl 과 Hydroxyl 그룹 간의 분자 내 반응으로 형성. ▪ Aldose (e.g., Glucose)는 Hemiacetal 을, Ketose (e.g., Fructose)는 Hemiketal 을 형성. o Anomers 와 Anomeric Carbon ▪ 고리화 과정에서 Carbonyl carbon 은 새로운 Chiral center 인 Anomeric carbon 이 됨 ,. - Aldose 의 경우 C1, Ketose 의 경우 C2. ▪ Anomers: Anomeric carbon 의 OH 위치에 따라 나뉨. - 𝛼-anomer: OH가 CH 2 OH와 trans 위치 (아래 방향) - 𝛽-anomer: OH가 CH 2 OH와 cis 위치 (위 방향) ▪ 용액 내에서 𝛼와 𝛽 형태는 Mutarotation (고리 열림 필요)을 통해 상호 전환. o Pyranose vs. Furanose ▪ Pyranose: 6 원자 고리 (e.g., Glucopyranose). ▪ Furanose: 5 원자 고리 (e.g., Fructofuranose). o Haworth Projection ▪ 고리형 설탕 구조를 단순화한 2D 표현. ▪ Fischer Projection 의 오른쪽 그룹은 Haworth 에서 아래로, 왼쪽 그룹은 위로 배치. ▪ D-당에서 C5 의 CH 2 OH는 위로 향함.
o Polysaccharides 로 Glucose 를 저장하는 이유 ▪ No Genetic Template: 단백질과 달리 핵산 주형에서 합성되지 않음.
- 효소가 monomer 유형, linkage, branching 을 제어
- 사슬 길이와 구조가 분자마다 다양 o Functional Advantages: ▪ 구조적 다양성 (Structurally diversity) → 넓은 생물학적 기능 (broad biological functions) ▪ Osmolarity 감소: 중합(Polymerization)을 통해 용질 입자의 수 감소 → 삼투압(osmolarity) 저하
- 저장 다당류 (Storage Polysaccharides)의 구조와 역할 o Starch (식물 저장 다당류) ▪ 구성: Amylose 와 Amylopectin 의 혼합
- Amylose: Linear, 𝛼( 1 → 4 ) linkage
- Amylopectin: Branched, 𝛼( 1 → 4 ) linkage 주 사슬, 𝛼( 1 → 6 ) linkage (24–30 residue 마다)로 가 지 형성 o Glycogen (동물 저장 다당류) ▪ 구조: Amylopectin 과 유사하나, 더 고도로 분지됨 (highly branched) ▪ 𝛼( 1 → 6 ) linkage 가 8 – 12 residue 마다 존재 ▪ 특징: More nonreducing ends 와 compact packing → 필요 시 rapid enzymatic access 및 fast glucose release 가능 o 주요 저장 다당류 비교 Polymer (^) 구성 단위 및 결합 분지 정도 주요 기능 및 위치 Amylose α( 1 → 4 ) Glc (선형) 없음 (Linear) 식물의 에너지 저장 (전분) Amylopectin (^) α( 1 → 4 ) 및 α( 1 → 6 ) 중간 (24– 30 단위마다) 식물의 주요 에너지 저장 (전분) Glycogen (^) α( 1 → 4 ) 및 α( 1 → 6 ) 높음 (8– 12 단위마다) 동물의 에너지 저장 (간, 근육)
- 구조적 다당류 (Structural Polysaccharides) o Cellulose ▪ 역할 : 식물 세포벽의 주요 구조 다당류. 구조적 강성(rigidity)과 불용성 제공 ▪ 구조 :
- Monomer: D-glucose
- Linkage: 𝛽( 1 → 4 ) glycosidic bonds 로 연결된 Linear polymer
- 특징: 각 glucose 가 180 ∘^ 회전, unbranched, extended chains 형성.
- 인접 사슬 간 광범위한 intermolecular H-bonding → rigid microfibrils 형성 ▪ 소화 : Water-insoluble, 효소 가수분해에 저항성. 인간은 𝛽-glucosidase 부족으로 소화 불가 o Chitin ▪ 역할 : 곰팡이 세포벽과 절지동물 외골격의 주요 구조 성분. 강도, 유연성, 내구성 제공
- 구조 : ▪ Monomer: N-acetylglucosamine (GlcNAc)
- Linkage: 𝛽( 1 → 4 ) glycosidic bonds 로 연결된 Linear polymer
- 특징: C2 에 acetamido group (-NHCOCH 3 ) 보유 (Cellulose 와 유사하나 C2 치환기 차이)
- Inter- 및 intrachain 수소 결합 → 강한 섬유(strong fibers) 형성 ▪ 소화 : 인간은 chitinase 부족으로 소화 불가
o Cellulose 와 Chitin 비교 특징 Cellulose Chitin 단량체 D-Glucose^ N-Acetylglucosamine^ (GlcNAc) 결합 β( 1 → 4 ) glycoside 결합 β( 1 → 4 ) glycoside 결합 C2 치환기 Hydroxyl group^ (–OH)^ Acetamido group^ (–NHCOCH 3 ) 구조 비분지형, 확장된 선형 사슬 비분지형, 확장된 선형 사슬 사슬 간 결합 수소 결합 Acetamido group 을 통한 더 강한 수소 결합 기능 식물 세포벽의 구조적 지지 균류 세포벽 및 절지동물 외골격의 구조적 지지 인간 소화 불가능 ( β-glucosidase 부족) 불가능 (chitinase 부족) o Cellulose 와 Chitin 비교
- GGlycosaminoglycans (GAGs) o GAGs 구조와 기능 ▪ Definition: ECM 및 세포 표면에서 발견되는, 반복되는 이당류(repeating disaccharides)로 구성된 길고 unbranched polysaccharides. ▪ 구조: Amino sugars 와 uronic acids 로 구성. 종종 sulfated → 단백질 상호작용 ▪ 기능: Hydrated → gel-like ECM 형성 (mechanical support, hydration, signaling). 약물 전달, 조직 공학, 항 응고제 등으로 응용 o GAGs 유형 o Hyaluronan vs. Hyaluronic Acid (HA) ▪ Hyaluronan : 과학/생화학 용어. ▪ Hyaluronic Acid : 임상/화장품 용어. ▪ 구조 : GlcA(𝛽 1 → 3 )GlcNAc(𝛽 1 → 4 )의 Linear polymer. ▪ 기능 : ECM 구조 성분, 조직 쿠션, 상처 치유. 피부 보습, 관절 윤활에 사용. o Heparin vs. Heparan Sulfate Feature Heparin Heparan Sulfate Location Mast cells 의 Secretory granules (간, 폐) 세포 표면 및 ECM 전반에 걸쳐 발현 Degree of Sulfation (^) Very high (이당류당 최대 3 개 sulfate) Lower (이당류당 1 개 이하 sulfate) Biological Function Anticoagulant (antithrombin III 활성화) 세포 신호 전달, 성장 인자 결합 조절, 세포 부착 Clinical Use (^) 주사형 항응고제 약물로 널리 사용 직접적인 약물로 사용되지 않음 o Heparin 의 항응고 메커니즘 ▪ Heparin : 고도로 sulfated 된 GAG 로 antithrombin 및 thrombin 에 결합 ▪ 작용: Basic residues (Arg, Lys)와 음전하 sulfate 그룹 간의 Electrostatic interaction ▪ 결과 : Antithrombin–thrombin inhibitory complex 형성을 촉진, antithrombin 활성을 수백~수천 배 강 화 → Thrombin 억제 가속화
- 당접합체 (Glycoconjugates) o 분류 및 역할 ▪ Glycoconjugates: 탄수화물(Carbohydrates)이 단백질이나 지질과 공유 결합된 형태 - Glycoproteins: 단백질에 Oligosaccharides 결합 - Proteoglycans: Core proteins 에 GAG chains 결합 - Glycolipids: 지질에 Carbohydrate head groups 결합 ▪ 위치: 세포 표면, ECM, 세포 내 소기관 ▪ 기능: Cell–ECM adhesion, signal transduction, molecular recognition
Hyaluronic Acid (^) Glucurinic acid 및 N-acetylglucosamine 반복 ECM 핵심 성분, 관절 윤활 Heparan Sulfate (^) Glucosamine 및 glucuronic/iduronic acid 반복 세포 표면, 세포 신호 조절 Chondroitin Sulfate N-acetylgalactosamine 및 glucuronic acid 반복 연골의 구조적 지지 Keratan Sulfate (^) Galactose 및 N-acetylglucosamine 반복 각막, 연골, 뼈에서 발견
- Glycolipids 및 관련 개념 o Glycolipids ▪ Gangliosides: 신경 세포막에 풍부한 Glycosphingolipids, 세포 신호 전달 관여 ▪ Lipopolysaccharides (LPS): Gram-negative bacteria 에서 발견 → Host-pathogen 상호작용 및 면역 활성화 기여 o Endotoxins (LPS) ▪ 독성: Gram-negative bacteria 유래 LPS는 발열, 오한, 혈관 확장, 응고, 다발성 장기 부전 등을 유발 가능 ▪ 검출 방법: Rabbit Pyrogen Test, LAL Test (투구게 혈액 유래), recombinant Factor C assay (animal-free)
- Carbohydrates as Informational Molecules: The Sugar Code o Glycans 의 구조적 다양성과 정보 ▪ Glycans 은 세포 표면에서 정보가 풍부한 분자로 작용 ▪ DNA, 단백질보다 더 높은 복잡성 ▪ 기능: Cell–cell recognition, Immune modulation, Pathogen attachment o Glycan 다양성의 기원 ▪ Non-template-driven biosynthesis ▪ 효소 특이성: Glycosyltransferases, Glycosidases ▪ 구조적 변이: Monosaccharide identity, Linkage type/position, 𝛼/𝛽 anomers, branching o Lectins: Sugar Code 해독 ▪ Lectins: Non-enzymatic glycan-binding proteins. ▪ Glycan 패턴을 세포 반응으로 번역하여 면역, 신호 전달, 감염 조절 ▪ 주요 유형: - C-type lectins: Ca^2 +^ 의존적, mannose/fucose 결합 → Pathogen sensing - Galectins: 𝛽-galactosides 결합 → Cell adhesion, immune regulation - Siglecs: Sialylated glycans 결합 → Self-recognition, immune modulation o Selectins 및 면역 감시 , ▪ Selectins: 염증이 생긴 내피에 백혈구 부착을 매개하는 Lectins ▪ 인식: Sialylated and fucosylated glycans, 특히 Sialyl LewisX ▪ 발현: L-selectin (백혈구), E-selectin (활성화된 내피 세포), P-selectin (혈소판) ▪ 작용: Selectin–glycan 결합을 통한 Tethering and rolling → Integrin 을 통한 Firm adhesion → 염증 조직으로 Transmigration o 병원체의 Glycan 인식 ▪ 병원체는 숙주 glycans 를 침입 및 면역 회피에 이용 ▪ 예시: Influenza hemagglutinin (HA) - HA는 Sialic acid 에 결합 o Avian: 𝛼 2 → 3 선호 o Human: 𝛼 2 → 6 선호 - Oseltamivir (Tamiflu)는 Sialic acid 모방 → NA (neuraminidase) 차단 - HA–sialic acid 결합 → Entry → Replication → NA가 Sialic acid 절단 → Virus release
- Carbohydrate 연구 (Working with Carbohydrates) o 탄수화물 구조 분석 전략 및 어려움 ▪ 탄수화물은 단당류 서열, linkage 유형, branching 패턴의 다양성으로 인해 단백질/핵산보다 구조 분석이 더 복잡 ▪ 주요 분석 전략: - Monosaccharide composition analysis: Acid hydrolysis + chromatography - Linkage determination: Methylation mapping (free - OH만 methylation) - Sequence resolution: Enzymatic digestion + fragmentation - Structure elucidation: NMR and mass spectrometry o Oligosaccharide 합성의 어려움 ▪ 화학 합성의 어려움: - 엄격한 Protection/deprotection 및 Stereocontrol 필요 - 불완전한 커플링 또는 부반응으로 낮은 수율 - 복잡한 glycan (예: Lewis antigens, heparin motifs) 합성은 정밀도 요구 ▪ 필수적 이유: - 동질적인 glycan 표준물질 생산 - Glycan–protein 상호작용 연구 - Glycan 구조–기능 관계 정의
• DNA 와 RNA 의 비교 및 기능
o DNA vs. RNA 특징 DNA RNA 가닥 수 이중 가닥 (Double-stranded) 단일 가닥 (Single-stranded) 당 2′-Deoxyribose^ Ribose 염기 A, T, G, C A, U, G, C 안정성 더 안정적 (2'-H 존재) 덜 안정적 (2'-OH 존재) 기능 장기 유전 정보 저장 유전자 발현, 조절, 촉매 o DNA 의 기능 ▪ DNA 는 Stable Genetic Repository (안정적인 유전 저장소) 역할. ▪ 유전 정보의 장기 저장 (Long term storage) ▪ 세포 분열 및 생식 시 정확한 전달 (Accurate transmission) ▪ Gene: 기능적 산물 (단백질 또는 기능적 RNA)을 암호화하는 DNA segment. o 주요 RNA 의 종류 및 기능 종류 (약자) 길이 기능 mRNA (Messenger RNA) 다양함 유전 코드를 리보솜으로 운반하여 단백질 합성 지시 tRNA (Transfer RNA) (^) 짧음 번역 과정에서 mRNA 코돈에 맞는 아미노산 운반 rRNA (Ribosomal RNA) (^) 다양함 리보솜의 구조적/촉매적 구성 요소 miRNA (microRNA) ∼ 21 − 25 nt mRNA 번역 억제 또는 분해 촉진 snRNA (small nuclear RNA) ∼ 100 − 300 nt (^) mRNA 스플라이싱을 위한 스플라이소솜의 구성 요소 lncRNA (long noncoding RNA) > 200 nt (^) 전사 조절, 염색질 구조, 스캐폴딩 조절 o RNA 의 Alkaline Hydrolysis 에 대한 감수성 ▪ 알칼리 조건 하에서 RNA 는 2′-OH 그룹의 친핵성 공격으로 인해 빠르게 가수분해 (hydrolyzed) ▪ DNA 는 2′-OH 그룹이 없으므로 더 안정적. o Structural Properties of Nucleotide Bases ▪ 염기는 약한 염기성(Weakly basic) 및 방향족(aromatic) 특징을 가짐 ▪ Purine(A, G)은 puckered 형태, pyrimidine(C, T, U)은 planar 형태 ▪ 모든 염기는 260 nm 근처에서 UV 빛을 강하게 흡수 ▪ π-전자 비편재화 되어있어 부분적인 이중 결합 특성을 가짐. ▪ Tautomerism
- 염기는 Lactam, Lactim, double lactim 형태로 존재할 수 있음
- 생리적 pH (7.0)에서는 lactam 형태가 우세
- Rare tautomers 는 복제 시 mispairing 을 유발할 수 있음
- 유전 물질로서 DNA 의 발견과 이중 나선 구조 o DNA 가 유전 물질임을 입증한 주요 사건 연도 연구자 실험/발견 핵심 내용 1928 Griffith 변형^ 실험^ (Transforming Principle)
열처리된 S 형 균주가 R 형 균주를 치명적인 S 형으로
1944 Avery, MacLeod, McCarty 변형 원리 규명 DNA 가 변형 원리(유전 물질)임을 RNase, Protease, DNase 를 사용하여 입증. 1950 Chargaff (^) 샤가프 법칙 (Chargaff’s Rule)
DNA 에서 [A] = [T], [G] = [C] 이 성립함을 발견. 염기쌍 형
(^1953) Franklin, WilkinsWatson, Crick, DNA 이중 나선 구조 제안
X 선 회절 데이터를 기반으로 DNA 의 이중 나선 구조 모
▪ Chargaff’s Rule (1950) : DNA 에서 A 와 T, C 와 G 의 양이 각각 Equimolar (등몰) 함. ▪ Watson and Crick (1953) , : DNA 가 Right-handed double helix 구조임을 제안. Rosalind Franklin 의 Photo 51 (X-ray diffraction pattern)이 핵심 정보 제공.
- DNA Double Helix 의 구조적 특징 o 핵심 구조 특징 ▪ Antiparallel Orientation (역평행): 두 가닥은 서로 반대 방향 ( 5 ′^ → 3 ′^ 대 3 ′^ → 5 ′)으로 주행. ▪ Helical Parameters (나선 매개변수): - 나선 회전당 10.5 base pairs - 염기쌍 간 간격 3. 4 A˚ - 한 바퀴 36 A˚ - 나선 직경 20 A˚ ▪ Groove Formation (홈 형성): 염기쌍의 Off-set 으로 Major (넓은) groove 와 Minor (좁은) groove 형성. 단백 질-DNA 상호작용에 필수적. o Watson–Crick Base Pairing 및 Complementarity ▪ A-T Pairing: 2 개의 수소 결합 (H-bonds) ▪ G-C Pairing: 3 개의 수소 결합 (H-bonds) ▪ Complementary Sequences (상보성): 각 가닥은 파트너 가닥의 서열을 결정하며, 정확한 복제와 전사를 가능하게 함. o DNA 구조의 안정성 ▪ 수소 결합 (Hydrogen bonding) 및 Base stacking (염기 쌓임)에 의해 유지. ▪ 기능적 함의: 염기 서열이 유전 정보를 암호화하며, Major/Minor groove 는 단백질 결합 및 유전자 조절 허 용. o DNA 의 구조적 유연성 ▪ DNA 는 구조적 가변성을 보이며, Phosphodiester bond 주위 회전, Deoxyribose ring 의 Puckering, Glycosidic bond 주위의 자유 회전 등이 원인. ▪ B-form (가장 일반적): Watson-Crick 모델, 생리학적 조건에서 주된 형태. ▪ A-form: Dehydrated (탈수) 조건에서 형성, 더 넓고 짧은 나선. ▪ Z-form: Left-handed (왼손잡이) 나선, Zig-zag 모양, GC-rich 영역에서 발생 가능. o Non-Canonical DNA Structures (비표준 DNA 구조) , ▪ Hairpin / Cruciform: Palindromic 또는 Inverted repeat sequence 에 의해 형성. - Hairpin: 단일 가닥 루프 - Cruciform: 이중 가닥 돌출 구조 ▪ Triplex DNA (삼중 나선): Hoogsteen pairing 을 통해 세 번째 가닥이 이중 나선에 결합 (Purine-rich sequence 에서). ▪ G-quadruplexes (G4 DNA): G-rich sequence 가 형성하는 4 가닥 구조. G-quartets 에 의해 안정화되며 Telomeres 및 Promoters 에서 생물학적 중요성 가짐. G-quartet stabilized by Hoogsteen H-bonds o Nucleic Acid 구조의 계층적 수준 ▪ Primary structure: Covalent phosphodiester bond 로 연결된 Nucleotide 의 선형 서열. ▪ Secondary structure: 규칙적인 Base pairing 에 의한 국소적 접힘 (예: DNA 이중 나선, RNA Stem-loops). ▪ Tertiary structure: 전체 분자의 장거리 3D 접힘 (예: tRNA, rRNA 의 복잡한 형태).
- 비효소적 DNA 변형 및 돌연변이 (Nonenzymatic DNA Alterations and Mutations) o 돌연변이(Mutations)는 DNA 구조의 영구적인 변화로, 노화 및 발암과 관련. o 자발적 변형 (Spontaneous Alterations) ▪ Spontaneous deamination: - Cytosine → Uracil (∼ 100 events/day). - Adenine, Guanine 등 다른 염기도 Deaminate. - Deaminated bases 는 비정상으로 인식되어 repair. - DNA 가 Uracil 대신 Thymine 을 사용하는 이유를 설명. ▪ Depurination: - N-𝛽-glycosyl bond 절단을 통해 Purine 염기 손실. - Apurinic (AP) sites 생성, 복구 필요. o 방사선 및 화학물질에 의한 손상 ▪ UV radiation: - Pyrimidine dimers (예: thymine dimers) 형성. - DNA 구조 왜곡, 복제/전사 방해. ▪ Ionizing radiation (X-rays, 𝛾-rays): - Ring opening, Base fragmentation, Strand breaks 유발. ▪ Reactive chemicals: - Nitrous acid: 염기 Deamination. - Alkylating agents (예: dimethyl sulfate): DNA 염기 Methylation. o Guanine → 𝑂^6 - methylguanine, 복제 시 Mispairing 유발. o 산화적 및 효소적 염기 변형 ▪ Oxidative stress (예: H 2 O 2 , Hydroxyl radicals): - 염기 변형 및 Strand breaks 유발. - Hydroxyl radicals 는 매우 반응성이 높고 돌연변이 유발성(mutagenic). - 세포는 Antioxidant defense systems 보유. ▪ DNA methylation: - A 와 C 에 더 많이 영향. - S-adenosylmethionine (SAM)이 Methyl group 제공. - Eukaryotes 에서 Cytidine 잔기의 ∼ 5 %가 Methylated. - Gene expression 및 Genome stability 조절.
- DNA 합성 및 증폭 기술 o Solid-Phase DNA Synthesis ▪ Solid support (예: resin) 위에서 DNA 를 단계적으로 합성. ▪ 각 Nucleotide 는 Protection/Deprotection 화학을 통해 추가. ▪ 효율적이고 정확한 합성을 위해 완전 자동화. o Polymerase Chain Reaction (PCR) ▪ Kary Mullis 가 1983 년 발명 (1993 년 노벨 화학상). ▪ 특정 DNA 서열을 Primer, dNTPs, Polymerase 를 사용하여 증폭. ▪ 새로운 Nucleotide 는 Primer 의 3 ′^ 끝에 추가. ▪ 특징: 단일 DNA 분자도 검출 가능, 오래되거나 손상된 샘플에 효과적. ▪ 주요 응용: 고대 DNA 클로닝, 진화 연구, 법의학, 초기 바이러스/암 검출, 산전 유전 검사. o PCR 의 In Vitro 증폭 (Thermal Cycling) ▪ 각 Cycle 은 세 단계로 구성되며, 몇 시간 내에 수백만 개의 사본 생성: - Denaturation ( 94 ∘C): DNA 두 가닥 분리. - Annealing ( 55 ∘C): Primer 가 Target sequence 에 결합. - Extension ( 72 ∘C): DNA polymerase 가 새 가닥 합성. o 참고 : GC-rich sequences 는 DMSO 와 같은 첨가물이 필요하여 이차 구조를 불안정하게 함. o Taq DNA polymerase 사용 (고온 안정성).
- DNA Sequencing(DNA 염기서열 분석) o Maxam-Gilbert Sequencing (화학적 DNA 절단법) ▪ 원리: 염기 특이적 화학적 절단 이용. ▪ 주요 단계: ▪ 5 ′^ 끝을 32 P 로 표지. - G, A+G, C+T, 또는 C 에서 화학적으로 DNA 절단. - Gel 에서 Fragment 이동. - Gel pattern 에서 서열 판독. ▪ 단점: 화학적 절단 반응이 위험하고 정밀하게 조절하기 어려움. o Sanger Sequencing (Dideoxy Chain Termination Method) ▪ 원리: DNA 합성 중 Dideoxynucleotide (ddNTP)가 통합되면 합성이 멈춤. ▪ ddNTPs 는 3 ′-OH 기가 없어 더 이상의 Elongation 방지. ▪ 서로 다른 ddNTP 를 사용하여 A, T, C, G 에서 끝나는 Fragment 생성. o Automated DNA Sequencing (형광 ddNTPs 사용) ▪ 각 ddNTP 에 고유한 형광 염료(fluorescent dye)를 태그. ▪ Capillary electrophoresis 중 서열 검출. ▪ Laser 가 말단 염기의 색을 읽어 서열 추론. o Human Genome Project (HGP, 1990–2003) ▪ DOE 와 NIH 의 공동 이니셔티브, 2003 년 조기 완료. ▪ 주요 성과: 2001 년 Nature 와 Science 에 Draft Genome Sequence 동시 발표. ▪ Sequencing 전략: - 공공 컨소시엄 (DOE & NIH): Clone-by-clone 방식 (기존 지도 기반). - Celera Genomics (Craig Venter 주도): Shotgun Sequencing. ▪ Genome Sequencing 비용 감소: 기술 발전으로 비용이 급격히 하락. o Next-Gen DNA Sequencing 특징 (Feature) Illumina (가역적 터미네이터) PacBio (SMRT, 단일 분자 실시간) Oxford Nanopore (나노포어 기반) Read Length (^) 짧음 (100– 300 bp) 김 (10– 25 kb; 최대 100 kb~) 매우 김 (10 kb ~ 1 Mb 이상) Accuracy (^) 매우 높음 (>99.9%)
( CCS/HiFi 모드는 >99.9%)
Throughput (^) 매우 높음 (런당 테라베이스) 중간 ~ 높음 중간, 실시간 처리 Run Time (^) 수 시간 ~ 수 일 수 시간 ~ 1 - 2 일 수 분 ~ 수 일 (실시간) Instrumentation Cost 높음^ (고가)^ 높음^ (고가)^ 낮음^ ~^ 중간 Per-base Cost 낮음 중간 가변적 (Variable) Portability (^) 없음 (불가) 없음 (불가) 있음 (예: MinION) Strengths (^) 높은 정확도, 비용 효율성
Limitations
유전체 조립(Assembly) 및 페이징(Phasing)에 제한적
신호 잡음(Signal noise) Key applications 변이 탐색(Variant calling), RNA 시퀀싱(RNA-seq), 전장 유전체 분석(WGS) De novo 조립, 아이소폼 시퀀싱, 구조적 변이 분석 현장 진단(Field diagnostics), 신속 시퀀싱
Ch. 9 DNA-Based Information Technologies
- Genome/Genomics o Genome: 한 유기체의 완전한 DNA 세트 o Genomics: Genome 의 서열, 구조, 기능 및 조절을 대규모로 연구하는 학문
- 생명공학의 주요 발견 o Restriction Enzymes(제한효소) ▪ Werner Arber: 바이러스에 대한 방어 기전으로 제한 효소의 존재를 제안 ▪ Hamilton O. Smith 와 K. W. Wilcox: 제한 효소를 제안하고, HindIII 를 발견 ▪ Kathleen Danna 와 Daniel Nathans: 제한 효소 소화에 의한 DNA 절편 절단을 입증 o Recombinant DNA Technology, 1973 ▪ Stanley Cohen 과 Herbert Boyer: 재조합 DNA 기술을 개발 ▪ Genentech 설립: Herbert Boyer, Robert Swanson 이 설립하여 재조합 인슐린, hGH 등의 개발에 기여 o PCR 의 발견 (1983) ▪ Kary Mullis: Polymerase Chain Reaction, PCR 을 발명 ▪ 특정 DNA 서열을 신속하고 반복적으로 증폭하여, 미량의 DNA 로부터 수백만 개의 사본을 얻을 수 있음
- PCR 의 DNA 증폭 단계 온도 (oC) 시간 / 조건 기능 변성 (Denaturation) 94 40 초 (초기 5 분) DNA 이중 가닥을 단일 가닥으로 분리 결합 (Annealing) 55 40 초 primer 가 표적 서열에 결합 신장 (Extension) 72 1 분 / kb DNA 중합효소가 새로운 가닥을 합성 o GC rich 서열은 2 차 구조를 불안정하게 하기 위해 DMSO 와 같은 첨가제가 필요할 수도 있음
- Gene Cloning and Recombinant DNA Technology o Clone: DNA 서열, 세포 또는 유기체의 동일한 사본 o DNA Cloning: 특정 유전자나 DNA 단편을 선택적으로 증폭하여 연구 및 실험에 사용 o Recombinant DNA technology: DNA Cloning 을 수행하고 유전자를 조작하는 분자 기술 세트 o DNA Cloning 의 과정 및 단계 ▪ Isolate the DNA Fragment: PCR 증폭 또는 제한 효소 소화를 통해 표적 유전자를 얻음 ▪ Select an Appropriate Vector: Plasmid 와 같은 작고 자가 복제하는 DNA 분자를 선택 ▪ Ligate the DNA Fragments: DNA ligase 를 사용하여 DNA 삽입물과 벡터를 연결 ▪ Transform Host Cells: 재조합 DNA 를 대장균(E. coli)과 같은 숙주 세포에 도입 ▪ Identify Recombinant Cells: 선택 가능한 마커(예: 항생제 내성)를 사용해 재조합 DNA 보유한 세포 검출 o Cloning Vectors: 외래 DNA 를 숙주 세포로 운반하는 데 사용되는 작고 자율적으로 복제하는 DNA 분자 (예: Plasmid). ▪ Recombinant DNAs: 둘 이상의 상이한 출처의 유전 물질이 공유 결합된 DNA 분자 ▪ 핵심 구성 요소 (Plasmid)
- Origin of replication(ori): 복제 개시 부위.
- Selectable marker: 항생제 내성 (예: AmpR, TetR).
- MCS, Multiple Cloning Site: 여러 개의 고유한 제한 효소 인식 부위가 모여있는 합성 DNA 영역. 주요 클로닝 벡터 크기 제한 (Max Insert Size) 사용 숙주 플라스미드 (Plasmids) 5 – 400 kb (작음) 박테리아 BACs (Bacterial Artificial Chromosomes) (^) 최대 ~300 kb 박테리아 YACs (Yeast Artificial Chromosomes) (^) 최대 ~1 Mb 효모
- Key Enzymes in Recombinant DNA Technology 효소명 기능 Type II restriction endonucleases (^) 특정 염기 서열에서 DNA 분자를 절단 (제한 부위) DNA Ligase (^) 두 DNA 분자 또는 단편을 연결 (포스포디에스터 결합) DNA Polymerase I (E. Coli) (^) 3' 말단에 뉴클레오타이드를 추가하여 이중 가닥의 틈을 채움 Reverse transcriptase (^) RNA 분자로부터 DNA 사본을 만듦 Polynucleotide kinase (^) Polynucleotide 의 5'-OH(수산기) 말단에 인산기를 추가하여 labeling 하거나 ligation 이 가능하게 함 Terminal transferase 선형 이중가닥 DNA 의 3'-OH 말단에 단일 중합체 꼬리(homopolymer tails)를 추가함 Exonuclease III (^) DNA 가닥의 3' 말단에서 뉴클레오타이드를 제거함 Bacteriophage λ exonuclease 이중가닥의 5' 말단에서 뉴클레오타이드를 제거하여 단일가닥 3' 말단을 노출시킴 Alkaline phosphatase (^) 5' 말단과 3' 말단(또는 양쪽 모두)에서 말단 인산기를 제거함 (자가 연결 방지 등) Restriction endonucleases Restriction sites 에서 DNA 인식 및 절단 Methylases (^) 숙주 DNA 에 메틸기를 추가하여 자가 제한 효소에 의한 절단을 방지 o Type II 제한 효소의 특징 ▪ 인식 서열: 일반적으로 4 – 8 bp 길이이며, 6 bp 가 가장 흔함 ▪ 팔린드롬 (Palindromic): 인식 서열은 양쪽 가닥에서 5'→3' 방향으로 읽을 때 동일 o 제한 효소가 생성하는 DNA 말단 유형 ▪ 점착성 말단 (Sticky ends/Cohesive ends)
- 특징: 짧은 단일 가닥 오버행을 가짐 (예: EcoRI에 의해 생성)
- 특성: 상보적인 점착성 말단과 염기쌍을 형성할 수 있어 Ligation 이 용이 ▪ 무딘 말단 (Blunt ends):
- 특징: 불규칙한 염기쌍이 없음 (예: PvuII에 의해 생성).
- 특성: 추가적인 변형 없이는 연결 효율이 낮음
- DNA 삽입을 위한 PCR-Based Generation o primer 의 5' 말단에 제한 부위를 포함시켜 PCR 산물을 제한 효소로 절단함으로써 점착성 말단을 생성 o 벡터에 효율적이고 Directional Ligation 이 가능(예: EcoRI 부위를 포함한 primer → EcoRI로 절단된 벡터에 cloning).
- Insertion of DNA into Cells o Chemical transformation: CaCl 2 와 열 충격(Heat shock)을 이용하며, 효율은 일반적으로 1% 미만 o Electroporation: 전기 펄스를 사용하여 일시적인 막 구멍을 만들어 DNA 가 진입. 세포 사망률은 높으나 효율은 충분 ▪ 박테리아: 1.8–2.5 kV 사용 o Phage mediated transfection: 박테리오파지 감염을 모방하여 DNA 를 전달 o Conjugation: 공여 세포와 수용 세포 간의 직접적인 세포 간 접촉을 통한 DNA 전달 o Microinjection: 미세 바늘을 사용하여 DNA 를 핵으로 직접 전달 o Formation of protoplasts: 효소적으로 세포벽을 제거하여 DNA 흡수를 용이하게 함 o Particle gun: DNA 가 코팅된 입자를 식물, 곰팡이 또는 동물 세포에 물리적으로 쏘아 넣음
- Selective markers 및 Screenable markers o Selectable marker: 특정 조건 하에서 세포 생존(양성 선택) 또는 세포 사멸(음성 선택)을 가능하게 하는 유전자. ▪ pBR322 플라스미드: AmpR^ 및 TetR^ 유전자를 포함하여 양성 및 음성 선택을 모두 가능하게 함 o Blue-White Screening ▪ Lac z 유전자는 β-galactosidase 를 암호화하며, 이는 X-gal 을 분해하여 파란색을 생성 ▪ Screening - DNA 삽입 시 LacZ 유전자가 파괴되어 효소가 생성되지 않으며 → 흰색 콜로니. (재조합) - DNA 삽입이 없을 시 LacZ가 정상 작동하며 → 파란색 콜로니. (비재조합)
o Terminal Tags Fusion for Affinity Protein Purification ▪ 친화도 크로마토그래피를 통해 표적 단백질을 단순하게 정제하고 높은 순도와 수율을 얻을 수 있음 ▪ 원리: 표적 단백질을 암호화하는 유전자에 태그를 융합 태그 단백질/펩타이드 분자량 (kDa) 고정화 리간드 Protein A 59 IgG 의 Fc 부분 (His) 6 0.8 Ni^2 + GST (Glutation-S-transferase) 26 글루타티온 Maltose-binding protein 41 말토스
- PCR 의 다양한 응용 o 역전사 PCR (Reverse transcriptase PCR, RT-PCR): ▪ 역전사 효소를 사용하여 RNA 를 상보적 DNA (cDNA)로 전환한 후, 표준 PCR 로 증폭 o 정량 PCR (Quantitative PCR, qPCR) 또는 실시간 PCR (real-time PCR): ▪ 증폭 과정 중 특정 DNA 서열의 상대적 양을 실시간으로 측정, 유전자 발현 분석, 병원체 검출 등에 사용
- DNA 라이브러리 및 cDNA o DNA 라이브러리 (DNA library): 다양한 DNA 단편을 나타내는 DNA 클론의 모음. 유전자 발견 및 기능 분석에 활용 o cDNA (Complementary DNAs): mRNA 로부터 역전사 효소에 의해 합성된 이중 가닥 DNA o cDNA 라이브러리: cDNA 를 벡터에 삽입하여 클로닝한 클론들 o 조합 라이브러리 (Combinatorial library): 단일 유전자의 서열 변이체를 풍부하게 포함하는 라이브러리
- 단백질 기능의 level o 표현형 기능 (Phenotypic function): 단백질이 전체 유기체에 미치는 영향 o 세포 기능 (Cellular function): 세포 수준에서 단백질 간의 상호작용 및 네트워크 o 분자 기능 (Molecular function): 단백질의 특정 생화학적 활성
- Transcriptome and Proteome 개념 정의 관련 학문 전사체 (Transcriptome) 주어진 시간에 세포 내에 존재하는 전체 RNA 전사물 집합 전사체학 (Transcriptomics) 단백질체 (Proteome) 주어진 시간에 세포 내에서 발현되는 전체 단백질 집합 단백질체학 (Proteomics)
- 단백질 기능 탐구 방법 연구 질문 방법 유사 단백질 및 모티프는 무엇인가? 비교 유전체학 (Comparative genomics) 발현 조건은 무엇인가? RNA-Seq 단백질의 풍부도 (abundance)는 어느 정도인가? 질량 분석법 (Mass spectrometry) 단백질 위치는 어디인가? 융합 단백질/면역형광법을 이용한 현미경 분석 (Microscopy) 단백질 상호작용은 어떻게 되는가? 면역침전법 (Immunoprecipitation), 효모 이중 잡종법 (Yeast two-hybrid) 단백질 제거의 효과는 무엇인가? CRISPR/Cas 특정 과정에 관련된 유전자는 무엇인가? 대규모 스크리닝 (Large-scale screening)
- Comparative Genomics 및 Structural Motifs o 비교 유전체학 (Comparative genomics): 유전체 데이터베이스 (BLAST)를 사용하여 상동성(homology)을 기반으로 유 전자 기능을 할당하는 방법 ▪ Orthologs (정상동 유전자): 서로 다른 종에 존재하는 유사 유전자. ▪ Paralogs (측상동 유전자): 단일 종 내에 존재하는 관련 유전자. o 유전체 주석 (Genome annotation): 염기 서열을 바탕으로 유전자 위치 및 기능을 식별하는 과정.
- 세포 내 위치 및 타이밍을 통한 단백질 기능 분석 o 단백질은 특정 위치와 특정 시간에 활성화됨 o RNA-Seq (전사체학): 활발하게 전사되는 RNA 를 결정하며, 단일 세포 RNA-Seq (scRNA-Seq)도 포함 o 질량 분석법 (Mass Spectrometry, 단백질체학): 세포 단백질을 목록화하고 정량하며, 단백질 변형 (modifications)을 밝혀냄
o 융합 단백질 & 면역형광법 (Fusion Proteins & Immunofluorescence): GFP 태그를 사용하여 살아있는 세포 내에서 단 백질 위치를 추적 o 녹색 형광 단백질 (GFP) ▪ 구조: 11 개 가닥의 β-배럴 구조와 내부에 발색단(chromophore)을 가짐 ▪ 화학: 발색단은 Ser-Tyr-Gly 모티프에서 고리화(cyclization)와 산화(oxidation)를 통해 자발적으로 형성 ▪ 응용: 유전자 발현, 단백질 위치, 세포 역동성을 생세포에서 시각화하는 형광 태그로 널리 사용됨 o 면역형광법 (Immunofluorescence) ▪ 정의: 형광 항체를 사용하여 내인성(endogenous) 단백질을 시각화하는 방법 ▪ 단점: 세포 고정(cell fixation)이 필요하므로 세포 사멸(cell death)이 발생 ▪ 에피토프 태그 (Epitope tag): 특정 항체를 이용해 단백질을 검출할 수 있도록 단백질에 인위적으로 삽입된 짧은 펩타이드 서열(예시: FLAG (DYKDDDDK) 및 c-Myc (EQKLISEEDL) 태그)
- Interaction Analysis 를 통한 단백질 기능 결정 o 면역침전법 (Immunoprecipitation, IP) ▪ 비드(bead)에 고정된 항체를 사용하여 태그가 부착된 단백질 복합체를 분리 ▪ 함께 침전된 단백질은 상호작용을 나타냄 (예: FLAG, c-Myc 태그 사용) o 탠덤 친화성 정제 (Tandem Affinity Purification, TAP) ▪ 두 개의 태그를 사용하여 순차적으로 정제함으로써 비특이적 결합(background)을 줄임 ▪ 예시: Protein A 와 칼모듈린 결합 펩타이드(calmodulin-binding peptide). o 효모 이중 잡종법 (Yeast Two-Hybrid, Y2H) ▪ 단백질을 DNA 결합 도메인과 활성화 도메인에 융합. ▪ 두 단백질이 상호작용하면 리포터 유전자(reporter gene)의 전사가 재구성. o 단백질-단백질 interaction 측정 ▪ Surface Plasmon Resonance (SPR): SPR 센서를 사용해 결합 이벤트를 실시간으로 모니터링 ▪ Biolayer Interferometry (BLI): BLI 센서를 사용하여 결합 이벤트를 실시간으로 모니터링 ▪ SPR 분석 예시: 단백질 결합 특성 (친화도) 측정. KD = koff kon
- 여기서 KD는 해리 상수(Dissociation constant, nM), kon은 결합 속도 상수 (M−^1 sec−^1 ), koff는 해 리 속도 상수 (sec−^1 ). KD 값이 낮을수록 결합 친화도가 높음
- CRISPR/Cas9 를 이용한 유전자 기능 분석 o 기능 상실 연구 (Loss-of-function studies)는 유전자 제거/돌연변이를 통해 유전자 기능을 밝히는 데 도움을 줌 o CRISPR/Cas9: 유전체 편집을 위해 변형된 박테리아 면역 시스템입니다. ▪ CRISPR: Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ▪ Cas9: DNA 절단 핵산분해효소 (DNA-cutting nuclease) ▪ 가이드 RNA (gRNA/sgRNA): Cas9 을 표적 서열로 안내 o Cas9/sgRNA 복합체는 특정 DNA 에 결합하고 절단 ▪ 각 핵산분해효소 도메인은 DNA 한 가닥을 절단
- Personal Genomes 및 Precision Medicine o 전장 유전체 시퀀싱 (Whole genome sequencing)은 개인 질병 위험 예측, 체세포 돌연변이 식별 (예: 암), 개인 맞춤 의 학 (Personalized medicine): 맞춤형 진단 및 치료 등을 가능하게 함 o 유전적 표적을 기반으로 한 신약 개발 및 변이 해석의 복잡성을 할 수 있는 기회 o 생물학적 제제에 대한 동반 진단 (Companion diagnostics), 데이터 프라이버시 및 동의 문제, 유전체 관리 접근성의 형평성, 임상 사용을 위한 규제 장벽 등의 한계 존재
