2 - 2 | Apuntes de Biología Celular

docsity.com



































































Vista previa parcial del texto

¡Descarga 2 - 2 y más Apuntes en PDF de Biología Celular solo en Docsity!

(Br-dUTP) es el antígeno. Existen anticuerpos comerciales específicos contra Br-dUTP . Las células incorporan Br-dU , usamos los anticuerpos que reconoce Br-dU y que además llevan incorporado la fluorescencia. La preparación la observamos con MF o MBC (con MBC no necesitaríamos hacer cortes de la muestra). Este también es un experimento de "pulso y caza". Si marcamos moléculas y queremos tener una mayor resolución usamos el MET y marcamos los anticuerpos con metales pesados (oro). Con las técnicas de anticuerpos podemos trabajar en MO y ME. TEMA 2: TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS PARA MO Y ME. HISTOQUÍMICA: "Conjunto de técnicas que permiten la identificación, localización y cuantificación de una sustancia en un tejido o en una célula”. Las técnicas histoquímicas son un conjunto de técnicas usadas para la localización de moléculas, dependiendo del nivel donde estemos trabajando se llamarán histo—químicas (tejidos) o citoquímicas (célula) aunque ambos términos se usan como sinónimos. Estas técnicas se usan tanto en MO como en ME. Son por ejemplo el PAS (histoquímica de glúcidos), Sudan TIT (histoquímica de grasas)... Existen distintas técnicas para la localización de los distintos componentes en la célula. Antes del uso de los anticuerpos, estas técnicas eran las únicas que podían servir para detectar estos componentes, ahora se usan técnicas inmunohistoquímicas o inmunocitoquímicas que son más potentes. Existe otro grupo de técnicas que son las pruebas para localizar reacciones químicas que se llaman técnicas de HISTOQUÍMICA DE GLÚCIDOS. Reacción del ácido periódico de Schiff. (PAS). Revela la presencia de polisacáridos (glucógeno, almidón y celulosa) y glucosaminoglicanos neutros (mucinas). Utiliza el reactivo de Schiff (fucsina básica decolorada con ácido sulfuroso). El reactivo de Schiff reacciona con aldehidos libres del tejido formando una estructura compleja, se oxida y pasa a ser de color rosa, por tanto donde tenga lugar esa reacción se verá de color rosa debido a la fucsina. Aldehidos libres hay pocos en el interior de la célula y los polisacáridos no tienen aldehidos libres, nosotros a través de una reacción previa generamos los aldehidos libres en los polisacáridos. El ácido periódico reacciona con los grupos alcoholes de carbonos adyacentes (grupos glicoles) de los 13 docsity.com polisacaridos y forma los aldehidos. Si aplicamos la fucsina, reaccionará con estos aldehidos libres dando el color rosa. Esta técnica se usa por ejemplo para observar las células caliciformes del intestino (mucinas). Este tipo de reacciones histoquímicas necesita de un control para asegurar que esa reacción es específica y que de verdad ponemos de manifiesto lo que queremos. El control por ejemplo es la utilización de amilasa (degrada los polisacáridos) de manera que si al tratar la muestra con amilasa y realizar esta técnica nos sale la reacción negativa ( no se tiñe) es que realmente la fucsina tiñe a los polisacáridos, si por el contrario la técnica sale positiva quiere decir que la fucsina tiñe algo que no son los polisacáridos pues estos ya no están en la muestra (han sido degradados con la amilasa). Azul alcián. Pone de manifiesto polisacáridos como glucoamoniglicanos ácidos (proteoglicanos o mucinas ácidas), estos aparecen mucho en el hueso, en la matriz del tejido conjuntivo y conectivo. Dependiendo del pH podremos identificar unos GAG u otros, es decir, podemos identificar los polisacáridos solamente cuando el pH al que se hace la reacción está por debajo del punto isoeléctrico del polisacárido en cuestión, de manera que nosotros vamos aumentando el pH, cuando este alcanza el punto isoeléctrico de un GAG determinado cambia el color en la zona donde esté ese GAG. Cada glucosaminaglicano posee distinta acidez de manera que al cambiar el pH podemos poner de manifiesto unos polisacáridos u otros. Podemos ver si hay varios GAG y podemos saber cuantos hay. A pH=7 todos se tiñen por que todos son ácidos a ese pH. Trabajando a distinto pH podemos diferenciarlos pues se tiñen dependiendo de su punto isoeléctrico. HISTOQUÍMICA DE GRASAS. Pone de manifiesto grasas al disolverse en ellas. El tetraóxido de osmio es también un buen fijador para ME aunque también se puede hacer con él estudios de MO. Posee un color oscuro (muy negro). En estas técnicas lo importante es el procesamiento de la muestra o tejido. HISTOQUÍMICA DE ÁCIDOS NUCLEICOS. Reacción de Feulgen: Es la más usada, nos pone de manifiesto el ADN. También usa el reactivo de Schiffque pone de manifiesto aldehidos libres. 14 docsity.com Con esta técnica podemos localizar en la célula donde se da esa reacción enzimática. Debemos preservar la actividad del enzima, es decir que el procesamiento no debe ser el clásico (inclusión en parafina) pues destruye la actividad enzimática aunque esto depende del enzima pues algunos resisten a esos procesamientos. e Las técnicas que podemos usar para determinar la actividad de enzimas lábiles es por ejemplo la congelación (método físico) que sirve para fijar y también sirve de medio de inclusión para cortar la muestra en un criostato, así se preserva la actividad del enzima. + Debemos trabajar en condiciones fisico-químicas de osmolaridad, temperatura y pH adecuadas, debemos tener un control de estas variables. —Las condiciones de osmolaridad y temperatura dependen de la especie en la que estemos trabajando. —El pH dependen del enzima con la que trabajemos no de la especie en cuestión. e El producto de la reacción del enzima debe ser insoluble, es lo que lo diferencia de los fundamentos de determinación de la actividad enzimática que debe ser soluble para poder medir la absorvancia. Debe ser insoluble por que debemos verlos donde esté la actividad enzimática (donde precipita) si no se dispersaría en el medio y no veríamos nada. e Debe tener color para poder verlo en el MO o debe ser electronodenso (disperse los electrones) para poder verlo en el ME. El tetróxido de osmio es electronodenso, también el acetato de uranilo, citrato de plomo...dependiendo de la reacción debemos usar uno u otro. Debe llevar metal pesado que son los electronodensos. Foto=sección de nefrona a distintos niveles, lo que aparece de negro es la fosfatasa ácida (lisosomas) se observan las células donde están, no se aprecian los compartimentos donde están. INMUNOCITOQUÍMICA. Nota: Inmunoglobina G: 2 cadenas pesadas H y 2 cadenas ligeras L región Fc= propiedades biológicas (activación del complemento, opsonización...) región Fab= unión de anticuerpos. Anticuerpos son divalentes, poseen dos regiones de unión a antígenos que son iguales. Cada linfocito solo produce un tipo de cadena pesada y un tipo de cadena ligera. Se basan en la detección y localización de una molécula (antígeno) en un tejido o célula mediante el uso de un anticuerpo Han desplazado a las técnicas anteriores y son los más usados en la actualidad. 16 docsity.com Tienen una limitación y es la de disponer de anticuerpos específicos contra la molécula que queremos detectar o poner de manifiesto. Si disponemos del anticuerpo son muy sensibles, rápidas... Comparten el mismo fundamento que las técnicas bioquímicas de ELISA/RIA y Western. Aunque las técnicas de inmunocitoquímica sirven para localizar moléculas y el resto para cuantificar (ELISA/RIA y Western). La histoquímica de enzimas se aplican sólo a reacciones enzimáticas en cambio la inmunocitoquímica pone de manifiesto cualquier molécula de la célula, incluso moléculas de bajo Pm (actenos—> moléculas de bajo Pm pero que son incapaces de generar por si solos anticuerpos contra ellos). Lo importante de estas técnicas es que preservemos la estructura del ag para que el ac pueda reaccionar, es decir que no perdamos el ag en el procesamiento de la muestra. Para evitar esto hacemos varias pruebas empíricas con distintos procesamientos hasta ver cual es la más adecuada. Otra posibilidad es realizar la reacción ag-ac antes de procesamiento. e Tradicional; la reacción ag-ac se realiza después del procesamiento, se realiza poniendo los cortes sobre el porta y adicionando el ac, luego se observa la reacción. e Reacción ag-ac se realiza antes de la fijación cuando el ag es lábil. Por ejemplo en células aisladas hacemos la reacción sobre las células vivas y se procesan (fijación, dehidratación, inclusión y corte). Estas técnicas se usan para ME y MO. Para MO existen varias técnicas alternativas, para ME solo hay una técnica. Inmunocitoquímica para MO. Las más usadas son fluorescencia, PAP (peroxidasa antiperoxidasa) y sistema Biotina—avidina/estreptavidina Técnicas de fl . . También se llaman técnicas de inmunofluorescencia. Detecta reacciones ag-ac con fluorescencia usando el microscopio de fluorescencia o microscopio de barrido confocal. Por ejemplo tenemos una sección en un porta, sobre ella adicionamos un ac para las moléculas que queramos poner de manifiesto y ese ac va conjugado con un fluorocromo (FITC y TRICT). DIRECTA: usamos un sólo anticuerpo que lleva unido el fluorocromo y con especificidad del ag. Por ejemplo: localización de los filamentos de actina en fibroblastos de ratón. Necesitamos anticuerpos anti—actina hechos en otro animal por ejemplo en conejo. Fluorocromo (TRICT) Anti—[actina de ratón] Actina de ratón 17 docsity.com Directa: 1 ac Simple: ponemos de manifiesto 1 ag. Doble: ponemos de manifiesto 2 ag. (colocalización- MBC) Indirecta: 2 ac. Simple: 1 ag. Doble: 2 ag. Problema: Si los anticuerpos primarios se han hecho en la misma especie animal por ejemplo en el conejo, sus regiones Fc son iguales, los 2” anticuerpos no distinguirían entre ellos y los marcarían por igual. Por ejemplo: Tenemos dos anticuerpos primarios; anti—actina de ratón y anti—tubulina de ratón ambas hechas en conejo. Tenemos un segundo anticuerpo; anti-Ig G de conejo marcado con dos fluorocromos distintos pero que se unirá a los 1* anticuerpos por región Fc que es igual en ambos anticuerpos (antiactina y antitubulina), pues ambos anticuerpos están hechos en la misma especie. Solución: Los anticuerpos primarios los hacemos en dos especies diferentes para que sus regiones Fc sean diferentes, por ejemplo, antiactina hecha en conejo y antitubulina hecha en cabra. En este caso los segundos anticuerpos tienen que ser anti—[Ig G de conejo] -TRICT y anti-[Ig G de cabra] -FICT. Cuando observamos la muestra por el microscopio: Verde = FICT = Tubulina. Rojo = TRICT = Actina. si los 1* anticuerpos son de la misma especie y no tenemos otros anticuerpos, realizamos: e 1? reacción ag (actina) — ac anti—actina. e 2? reacción 2 anticuerpo marcado contra anti-actina. e 3* reacción ag (tubulina)- ac anti—tubulina. e 4* reacción 2” ac marcado contra anti_tubulina. Esto posee el problema de que cuando echamos el 2? anticuerpo contra la tubulina se establece un equilibrio con el 2” anticuerpo de la actina, pues la reacción ag-ac no es covalente. La solución es hacer que la reacción anti—[actina]-——anti-[IgG] sea permanente usando un fijador. A esto se le llama "bloquear". 19 docsity.com Para MO usamos como fijador al paraformaldehido Para ME usamos como fijador al glutaraldehido . La primera reacción se trata con vapores de paraformaldehido, el paraformaldehido es sólido, se mete en una cámara y se sube la temperatura, emite vapores y fija la reacción ag-ac. En la segunda reacción echamos el 1* anticuerpo anti—tubulina y luego el 2” anticuerpo anti—IgG. Esto se puede hacer siempre que el 2” anticuerpo de la segunda reacción sea estable y soporte este procesamiento, también depende del antígeno. Si no sale lo probamos al revés, hacemos primero las reacciónes de la tubulina y luego las de la actina y si sigue sin salir recurrimos a hacer los anticuerpos en especies distintas. e 1? reacción ag (actina de ratón) — ac anti—actina. lavamos e 2* reacción 2” anticuerpo marcado contra anti—actina. Lavamos. e 3” fijamos con vapores del paraformaldehido. Lavamos. e 4* reacción ag (tubulina)- ac anti—tubulina. Lavamos. e 5* reacción 2” ac marcado contra anti_tubulina. Lavamos. CONTROLES DE PREADSORCIÓN. Se usan para saber si la reacción ag-ac es específica Si se usan anticuerpos comerciales a la dilución que aconseja la casa comercial no suele haber problema. Si el anticuerpo está preparado por nosotros debemos saber la dosis a la que está el anticuerpo en la dilución, pues el anticuerpo debe estar a una concentración apropiada ya que : Si la concentración es demasiado baja; no se da la reacción, hay pocos anticuerpos y no observamos nada. Si la concentración es demasiado altas se producen reacciones inespecíficas, el anticuerpo se pega a sitios del tejido de forma inespecífica. Debemos hacer varias diluciones y ver cual es la apropiada. La concentración óptima es la concentración a la que se satura el sistema. Por más que aumentemos la concentración, no se da más reacción específica. Reacción ag-ac específica. opt [Ag] Debemos determinar la concentración de unión específica Óptima que depende del anticuerpo y del antígeno. Podemos hacer un control para saber si esa reacción es específica y si lo que observamos es debido Únicamente a la reacción específica: Mezclamos el anticuerpo primario con el antígeno soluble. Cogemos el anticuerpo anti—actina lo incubamos con actina soluble de forma que los sitios de unión específica quedan bloqueados. Puede que: 20 docsity.com 1” adicionamos al tejido el anticuerpo anti—[actina] que se pega al antígeno (actina). 2” adicionamos segundo anticuerpo anti—[Ig G de conejo] contra el primario anti—[actina]. El anticuerpo 2" es el GAR= "goat anti—rabbit"= "anti—conejo de cabra". Se pone en exceso. 3" se adiciona el complejo PAP que está formado por dos moléculas de anticuerpo antiperoxidasa hechas en conejo y tres moléculas de peroxidasa. Está basado en la propiedad divalente de los anticuerpos, se usa un anticuerpo como puente entre el anticuerpo 1? y el 3% GAR PAP Anti—[actina de ratón] En esta técnica colocamos una enzima en el lugar donde ocurre la reacción. La actividad peroxidasa se pone de manifiesto usando diaminobenudina (DAB) y H202 . La peroxidasa oxida al DAB con el H202. La DAB oxidada es de color marrón oscuro—negro y además es insoluble en agua, precipita sobre la zona donde ha ocurrido la reacción ag-ac. También se puede usar el 4—cloronaftol que de igual forma se oxida con el H202 por la peroxidasa. 4cloronaftol + H202 producto oxidado azul insoluble. La DAB se usa generalmente por que también es insoluble en alcohol y esto es útil durante el procesamiento, en la deshidratación y montaje no desaparecen y se puede montar con bálsamo con el que resiste más tiempo la preparación. Tiene el inconveniente de que es tóxico. El cloronaftol es soluble en alcohol, no se puede deshidratar y entonces montamos con glicerina que no se puede conservar durante mucho tiempo. La ventaja del PAP frente a inmunofluorescencia es que es más sensible, el PAP detecta antígenos en menor concentración en la célula, que son incapaces de ser detectados con inmunofluorescencia. Es más sensible el PAP por que la sensibilidad se amplia usando una enzima ya que mientras que el enzima esté activo está generando moléculas de color, además por cada anticuerpo que lleva unido el tejido tiene 3 enzimas, por tanto da tres veces más de color. Se pone 3 enzimas por que es el único complejo que se puede formar entre 3 peroxidasas y 2 anticuerpos debido a los impedimentos estéricos entre el n* de enzimas y de anticuerpos, da lugar a un complejo molecular formado por 5 moléculas (3 enzimas —2 anticuerpos). El anticuerpo secundario debe estar en exceso por que favorece que la interacción sea con una sola valencia y que la segunda valencia quede libre para unir el PAP. Ag + ac ag-ac 22 docsity.com

2 - 2, Apuntes de Biología Celular

Documentos relacionados

Vista previa parcial del texto

¡Descarga 2 - 2 y más Apuntes en PDF de Biología Celular solo en Docsity!