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LICENCIATURA EN BIOLOGÍA:
Asignatura de: AGENTES ANTICROBIANOS. Curso 2000 / 2001. Prof. Juan Carlos Argüelles. TEMA I. PATOGENICIDAD MICROBIANA. Teoría microbiana de las enfermedades infecciosas. Identificación de agentes patógenos. Postulado de Koch y de Rivers. Conceptos básicos. Relaciones patógeno-hospedador. Mecanismos de patogenicidad microbiana: Invasión y Toxicidad. Factores de virulencia. Exotoxinas y endotoxinas. Estructura y modo de acción de las exotoxinas más significativas. TEMA I. PATOGENICIDAD MICROBIANA. Desde la antigüedad se conocen las enfermedades a las que les atribuía un origen divino, como una especie de castigo causadas por la maldad del hombre. Si nos remontamos a la Mitología griega, encontramos que Hygea era considerada como la diosa de la salud y Pandora era la diosa de las enfermedades. Alejandro Magno fue capaz de crear su gran imperio porque siguió los consejos de Aristóteles en lo referente de dar a sus ejércitos el agua hervida. Tucydides introdujo el término peste, observó epidemias y fue capaz de darse cuenta que las personas que pasaban la enfermedad una vez, no la volvían a padecer. Comprobó que realizando extractos de tejidos, machacándolos y dándolos a inhalar a personas sanas la virulencia de la enfermedad era menor. El término “inmunitas” se remonta a épocas donde se confeccionaron los primeros Senados y hace referencia a los privilegios y exenciones que sufrían las personas elegidas para senadores. El término y las exenciones se mantienen en la actualidad. En la época de Moisés existía un código que contenía las primeras leyes de conducta e higiene. En el Siglo XVI, Fracastorius propuso la existencia de semillas vivas que eran portadoras de enfermedades y también que los objetos inanimados eran fuente de enfermedad. En el Siglo XIX, se mostró la existencia de procesos de tipo contagioso:
- Bassi demostró la existencia del hongo Botrytis cinerea que atacaba a los gusanos de seda.
- Holmes descubrió que las fiebres del parto, causa de muchas muertes en la época, eran producidas por ginecólogos y comadronas que asistían varios casos sin tomar las medidas oportunas de higiene.
- Snow estudió el cólera en Inglaterra y comprobó que los brotes de cólera eran transmitidos por el agua, esto es, de forma indirecta.
- Pasteur encontró un protozoo que afectaba al gusano de la seda y desarrollo las primeras vacunas. El cólera, mediante técnicas de envejecimiento es capaz de inducir inmunización.
- R. Koch trabajó con la bacteria del carbunco, introdujo la técnica de la gelatina para trabajar en medios sólidos, introdujo los colorantes y fue capaz de aislar cultivos puros. Descubrió la bacteria de la tuberculosis Mycobacterium tuberculosis. Estableció una relación causal entre el agente patógeno y la enfermedad, seguido de una serie de postulados o criterios que debía cumplir un microorganismo como responsable de una patología. Postulados de R. Koch: El microorganismo debe estar presente en los individuos enfermos y nunca en los sanos. El microorganismo debe de ser aislado de individuos enfermos y cultivado fuera del animal hasta la obtención de un cultivo puro. La inoculación a partir del cultivo axénico en individuos susceptibles debe reproducir todos los síntomas de la enfermedad. De nuevo el microorganismo debe ser aislable de estos animales y cultivado en laboratorio, manifestando todas las propiedades del cultivo original.
- Lister introdujo el ácido carbónico (fenol) en quirófanos, mejorando las técnicas médicas e introdujo las diluciones seriadas.
- Von Bering & Kitasato encontraron en el tétanos no una bacteria sino una toxina.
- Rives modificó los postulados de Koch para englobar a los virus: 1. – Idem. 2. – Filtrados de material infeccioso sin bacterias ni ningún otro microorganismo, deben reproducir la enfermedad en plantas y/o animales susceptibles. 3. – Filtrados y libres de células procedentes de animales y/o plantas infectadas han de transmitir la enfermedad a individuos sanos. 4. – Idem. CONCEPTOS BÁSICOS. RELACIONES PATÓGENO-HOSPEDADOR. DEFINICIONES. Dependiendo del grado de integración entre parásito y hospedador, sus relaciones pueden ser clasificadas como: A). – PARÁSITOS EXTRACELULARES. Son la mayoría, se destruyen rápidamente porque el propio patógeno libera factores estimuladores de la fagocitosis, producen enfermedades de corta duración; Echerichia coli y Streptococcus neumoniae. B). – PARÁSITOS INTRACELULARES. Se dividen dentro de las células fagocitarias (macrófagos y micrófilos), producen enfermedades de tipo crónico, larga duración y síntomas no muy agresivos; Mycobacterium tuberculosis. C). – PATÓGENOS OBLIGADOS. Necesitan del organismo vivo para poder vivir, su capacidad infecciosa depende del reconocimiento de los factores en la célula hospedadora; virus, Rickettchia y Clamides. En el proceso de adaptación al medio ambiente se producen asociaciones no aconsejables. Parásito; individuo que vive y se reproduce a expensas de otros. Comensal; cuando la relación parasitaria no produce daños en el hospedador. Patógeno; cuando la relación parasitaria produce daños en el hospedador. Hospedador; individuo objeto del parásito. Infección; entrada y permanencia del parásito en el cuerpo del hospedador. Puede ser inaparente o puede producir daños que desemboquen en una enfermedad. Patología o patogenicidad; capacidad de un parásito de causar daños en su hospedador. Es la resultante de dos factores: invasión del hospedador y enfermedad. Virulencia; grado de patogenicidad de un parásito. Puede ser expresada como el nº de individuos necesario para producir una enfermedad o como LD 50. Patógeno oportunista; agente que solo causa enfermedad en circunstancias excepcionales debido a la disminución de las defensas del hospedador por inmunodepresión, terapia anticancerosa, transplante o bien, por alteraciones de la flora normal permitiendo que microorganismos no patógenos actúen como patógenos. Por ejemplo: el virus del SIDA, la levadura Candida albicans o Haemophilus. MECANISMOS DE PATOGENICIDAD MICROBIANA. Los mecanismos de patogenicidad microbiana son: INVASIVIDAD. TOXIGENICIDAD. HIPERSENSIBILIDAD. INVASIVIDAD. – Capacidad de un patógeno de introducirse y proliferar (algunos patógenos proliferan masivamente dentro del cuerpo del hospedador, a esta proliferación masiva se la conoce con el nombre de septicemia) de forma invasiva dentro del cuerpo del hospedador, salvando sus barreras externas. Por ejemplo: Bacillus anthracix. TOXIGENICIDAD. – Capacidad para producir ciertas sustancias químicas (toxinas) capaces de alterar o destruir la estructura del organismo sano. Por ejemplo: Vibrio cholerae, Clostridium tetani.
de Streptococcus y Staphilococcus. Candida albicans utiliza proteasas como el aspartil que degrada las proteínas extracelulares del hospedador. La bacteria de la cangrena gaseosa, Chlostridium perfringens secreta colaginasa que despolimeriza las mallas de colágeno, soporte de muchos tejidos y facilita la dispersión del patógeno. Existen patógenos fibrinolíticos y otros que producen la conversión de fibrinógeno en fibrina. Son bacterias que poseen la enzima coagulasa como Staphilococcus que entra protegida por un coágulo.
2. – PRODUCCIÓN DE ENZIMAS LÍTICAS; como la hemolisina, degrada componentes específicos de la membrana y permite la presencia de patógenos en la célula. Existen dos hemolisinas muy características: estreptoquinasa sensible a O 2 y estreptoquinasa S. Las neuroaminidasas actúan hidrolizando el ácido siálico o neuroamínico de las células animales; virus de la gripe Ortomixovirus y Corynebacterium difteria. FACTORES DE RESISTENCIA. 1. – PRODUCCIÓN DE CAROTENOIDES, moléculas pigmentadas capaces de secuestrar y acomplejarse con las formas reactivas de los virus; anión superóxido, oxígeno singlete, peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo. Impiden el daño a los patógenos más resistentes como Staphylococcus aureus. 2. – PRODUCCIÓN DE LEUCOCIDINAS, factores o proteínas que producen algunos patógenos y que destruyen a los leucocitos, de manera que una bacteria produce leucocidina y se libera viva, Streptococcus y Bacillococcus que son piógenos, es decir, formadores de pus. 3. – FORMACIÓN DE CÁPSULAS, las bacterias capsuladas entran dentro de las especies virulentas, ya que la posesión de la cápsula interfiere en la fagocitosis. Las bacterias y virus no capsulados son fagocitados fácilmente. 4. – RESISTENCIA INTRACELULAR, en algunos casos el patógeno es fagocitado pero no es destruido, es capaz de sobrevivir dentro del macrófago. Este mecanismo está perfectamente descrito en; Mycobacterium leprae, Candida y Listeria. Sobreviven ya que impiden el ataque lisosomal, en otros casos el patógeno simplemente escapa de la vesícula lisosomal y se instala en el citoplasma celular. TOXIGENICIDAD. TOXINAS: sustancias químicas de alto peso molecular que producidas por un patógeno actúan simulando los síntomas de una enfermedad en pequeñas concentraciones. Los criterios que debe cumplir una toxina para considerarse ecológicamente activa son: 1. – Debe producir uno o más síntomas de la enfermedad. 2. – El sitio de acción y la concentración efectiva deben ser los que se obtendrían en el curso de la enfermedad. 3. – Debe existir una correlación entre virulencia y la producción de toxinas en las diferentes cepas de la especie patógena. 4. – Antisuero dirigido frente a la toxina protege a los animales de todos o algunos de los síntomas de la infección. TIPOS DE TOXINAS. Exotoxinas; se sintetizan y son excretadas al exterior por el organismo patógeno. Endotoxinas; forman parte de la estructura de la célula, sólo se libera cuando la célula ha sido lisada. Sólo es producida por bacterias Gram -. Toxoide; toxina tratada con calor o con formaldehído, se diferencia de la toxina en que no causa daños. Sirve para producir inmunidad. Micotoxinas; son toxinas producidas por hongos, son de bajo peso molecular y termorresistentes. Existen varias especies de hongos que las producen. Las aflotoxinas son producidas por el hongo Aspergillus flavus , actúan como contaminantes graves en material cereal, pero especialmente en los frutos secos que son servidos en bares, ya que estos productos son contagiados durante su almacenamiento. Estas toxinas se unen al ADN del individuo inhibiendo su transcripción. Se ha descrito una acción mutagénica y cancerosa en algunos animales de experimentación en los que ha aparecido cáncer por hepatomas. Las aflotoxinas funcionan como ayudante del virus de la Hepatitis B. Las aflotoxinas están controladas a escala sanitaria.
En este tipo de hongo, las esporas se desarrollan con ciertos niveles de humedad como pueden ser aparatos de refrigeración. Se desarrollan en pacientes inmunodeprimidos, por ello se adquiere fácilmente en hospitales.
Cuando la cámara alcanza esta temperatura de 121º C, entonces es cuando se empieza a contabilizar el tiempo de esterilización. Cuando una población microbiana se somete a la acción de un agente letal, no muere al instante sino que la cinética de muerte es una cinética exponencial, de tal manera que sólo una fracción de la población muere en un intervalo de tiempo. Esta fracción microbiana que muere en función del tiempo es constante, ejemplo; 75 % de las bacterias mueren en 5 minutos, 25 % que sobrevive morirá en los 5 minutos siguientes. Ejemplo de problema; Poseemos 10^9 células / ml, aplicamos un autoclave y mueren en un minuto el 90 % luego sobreviven 9 x 10^8 células / ml. , en el minuto siguiente mueren el 90 % quedando 9 x 10^7. TIEMPO DE REDUCCIÓN DECIMAL. Tiempo necesario para que a una temperatura determinada, eliminar el 90 % de una población microbiana, lo que supondría un ciclo logarítmico. Este tiempo es un valor fijo para cada microorganismo y la relación frente a la temperatura nos da un valor exponencial. La pendiente de esta recta es una medida de la sensibilidad de los microorganismos al agente esterilizante. Parámetro fundamental en la industria alimenticia y conservera. El valor de Z es igual a la temperatura. Es el incremento de temperatura necesario para reducir el tiempo de reducción decimal a la décima parte, también es cuanto deberíamos bajar la temperatura para reducir D a 1 luego Z es el incremento necesario tanto para subir como para bajar D. PROBLEMA: Muestra microbiana de 10^10 células y en 10 minutos a 101º C recuperamos 10^2 por minuto. Calcular D y si el valor de Z = 10º C, cuál sería D a 91º y a 101ºC. 10 log 10 >>>>> 10 2 log 10 >>>>> 2 10 – 2 = 8 ,, 10^8 células mueren en 10 minutos. 8 ----- 10minutos 1 ----- x minutos x = 1.18 minutos 91ºC ----- D 91 = 11.8 minutos 111ºC ----- D 111 = 0.118 minutos. El tiempo de reducción decimal es un valor de sensibilidad del microorganismo, muy importante en las empresas conserveras. Existen otros parámetros como: TIEMPO DE MUERTE TÉRMICA MT. Es el tiempo más corto para matar todas las células de una población a una Tº determinada. Este parámetro depende del tamaño de la población. Este parámetro se emplea porque para el cálculo de D se tienen que hacer muestras y después contar, por lo que es muy laborioso. TIPO DE PATÓGENO. Distintas especies o tipos celulares varían su sensibilidad frente a la esterilización por calor, las esporas aguantan más que las células vegetales. Escherchia coli muere más rápido que Mycobacterium tuberculosis. La eficacia de un agente esterilizante depende de los factores fisiológicos y condiciones ambientales del medio como por ejemplo los cultivos que están creciendo en fase exponencial se destruyen más rápido que los cultivos retardados o en reposo. La presencia de una alta concentración de azúcares, proteínas o grasas disminuye la penetración del calor y aumenta la resistencia microbiana. El caso de la sal es ambiguo. Los medios o cuerpos secos necesitan más Tº para esterilizarse que los húmedos. A pH ácido la muerte microbiana por calor es más rápida. Es importante la naturaleza del calor, el calor húmedo es más eficiente que el calor seco ya que su capacidad de penetración es mayor. A 121ºC las esporas tienen un valor de D entre 4 – 5 minutos y las células vegetativas D < 1 minuto.
Calor húmedo Calor seco Clostridium botulinum 120ºC (4 – 20 min.) 120ºC (2 horas) Bacillus subtilis 100ºC (2 – 15 min.) 150ºC (1 – 2 horas) ESTERILIZACIÓN POR RADIACIÓN. Las radiaciones sirven para esterilizar o disminuir la carga microbiana de un medio. Existen distintos tipos de radiaciones; Radiación ultravioleta. Posee una longitud de onda de 200 – 300 nanometros, produce dimerización del ADN. Se utiliza en cámaras de flujo laminar o en tuberías, su poder de penetración es escaso y además es dañina para la piel y los ojos por lo que sirve para microorganismos del aire o superficies expuestas. Radiación ionizante. Son radiaciones esterilizantes de alta energía, con un alto poder de penetración y fundamentalmente son los rayos g y los flujos de e-^ acelerados. Produce iones OH- del agua con un fuerte efecto oxidativo, daña directamente al ADN. Este tratamiento es muy caro ya que necesita de aparatos especiales que emitan Co^60 y Cs^37. Cada día son más usados para; esterilización fría de material de uso sanitario, esterilización de alimentos (poco usual pero cada vez más usado), en la pasteurización de ciertos productos perecederos como productos del mar y también se usan como desinfectante o desinsectante. El problema que existe con la radiación es que despierta ciertos recelos por la posibilidad de contaminación por radioactividad, formación de productos cancerígenos y sabores raros. ESTERILIZACIÓN POR FILTRACIÓN. Se usa en líquidos termolábiles (antibióticos, vitaminas, aa). En la esterilización por filtración no se produce una muerte de microorganismos, sino una separación física entre el microorganismo y el medio. El tamaño del poro se encuentra bien definido, para la retención de microorganismos el tamaño del poro se encuentra en torno 0.1 -–10 mm, los más utilizados se encuentran entre 0.22 – 0.45 mm. TIPOS DE FILTROS. Filtros de membrana. Son los más comunes, son partículas esféricas de 0.1mm de espesor compuestos de; acetato de celulosa, nitrato de celulosa, policarbonatos o polivinilos. Están diseñados de tal manera que sobre su superficie se disponen los poros que oscilan entre 0.22 – 0.45 mm, de manera que retengan partículas y permitan un elevado flujo de líquidos. En la práctica se fuerza el paso de una suspensión líquida mediante una bomba peristáltica (de vacío) que permite retener células y partículas en su membrana. PRÁCTICA DE LA FILTRACIÓN: El filtro requiere un equipo específico para ciertos volúmenes, así tenemos: Torre de filtración. Con volúmenes superiores a 5 litros, se dispone de cartuchos desechables de filtros de membrana, la filtración necesita de una jeringa de presión o una bomba peristáltica para el paso del líquido. Cabinas de flujo laminar o de seguridad biológica. Contienen filtros HEPA, eliminan el 99.7% de las partículas inferiores a 0.3 mm. Se pasa aire forzado sobre el filtro, la persona que está trabajando recibe una corriente de aire estéril, se impide la contaminación tanto de muestras como de las personas. Estas cabinas HEPA son de uso obligatorio en todos los laboratorios de investigación, industrias alimentarias y farmacéuticas que trabajan con patógenos, sin olvidarnos de los hospitales. Mascarillas quirúrgicas de esterilidad. Utilizan el mismo criterio que los filtros HEPA. Hasta que no se dispusieron de estas cabinas, algunos microorganismos como Legionella , responsable de la neumonía (1956) y virus histolíticos no fueron observados.
DEFINICIÓN: producto químico que mata o inhibe el crecimiento de una población microbiana, pudiendo ser productos naturales o de síntesis en el laboratorio. En esta categoría encontramos sustancias bactericidas, fungicidas, etc. pero la mayoría de los agentes antimicrobianos no producen esterilización y en la práctica se utilizan como desinfectantes. AGENTES DESINFECTANTES. FACTORES QUE AFECTAN A LA POTENCIA DE LA ACCIÓN. Su utilización está basada en el principio de “Toxicidad Selectiva”, propuesto por el científico alemán Paul Ehrlich. “Cualquier compuesto debe de ser tóxico y nocivo para los patógenos y sin embargo debe dejar intactas las células del huésped”. Se trata de un principio ideal, ya que tanto microorganismos como organismos macroscópicos comparten la misma composición biológica y rutas metabólicas similares. PROPIEDADES DE LOS DESINFECTANTES:
- – el desinfectante y el antiséptico deben ser activos contra una amplia variedad de microorganismos infecciosos en altas diluciones y en presencia de materia orgánica.
- – el desinfectante y el antiséptico no deben ser nocivos ni tóxicos para las personas ni corrosivo para el material quirúrgico ni hospitalario.
- – el compuesto debe ser estable durante su actuación, inodoro y anfifílico (soluble en agua como en disolventes orgánicos) para facilitar su penetración en la superficie de células microbianas, baja tensión superficial para facilitar su absorción.
- – el compuesto debe ser relativamente barato para que no quiebre el sistema español de la Seguridad Social. FACTORES QUE AFECTAN A LA POTENCIA:
- – concentración del agente y tiempo de aplicación, algunos compuestos sólo son eficaces a altas concentraciones pero estos compuestos a bajas concentraciones sólo retardan o incluso estimulan el crecimiento, por ejemplo; existen algunas especies de Pseudomonas que utilizan el desinfectante a bajas concentraciones como fuente de carbono. Para cada especie de patógeno la concentración necesaria para destruir una fracción de la población es constante. [ X]^n x T = K. De tal manera que si en un tiempo T se destruye una fracción, a otro tiempo T se destruye la misma fracción. El tiempo es importante ya que a tiempos muy prolongados aumenta el daño del agente a las células del huésped, por ejemplo; fenoles, si se reduce su concentración a, ½ aumenta en 64 horas el tiempo de esterilización.
- – temperatura y pH, el pH afecta tanto a la sensibilidad del microorganismo como a la potencia del compuesto. A pH neutro, la mayoría de las bacterias poseen carga (-). A medida que el pH va subiendo, aumenta la carga de las células y se altera la concentración del compuesto real sobre la superficie. También afecta al grado de ionización de los compuestos. Como norma general las formas no ionizadas de los compuestos atraviesan mejor las membranas que los compuestos ionizados. En realidad esto no es así. La destrucción de bacterias y hongos por agentes químicos se potencia con el aumento de la temperatura. A bajas temperaturas, por cada 10ºC de aumento de temperatura, se duplica el índice de mortalidad, sin embargo en algunos compuestos el aumento de la temperatura afecta a su eficacia.
- – la naturaleza de los microorganismos, las propiedades fisiológicas y metabólicas de cada organismo determinan la efectividad del agente, hay que tener en cuenta el medio de cultivo, la fase de crecimiento y la presencia de estructuras especiales(cápsulas, esporas, cuerpos fructíferos, etc.), así como el tamaño de la población. PRINCIPALES MECANISMOS DE ACCIÓN MICROBIANA.
Todos actúan produciendo daños irreversibles de constituyentes moleculares esenciales, muchos de estos compuestos, además de la lesión 1ª, producen secuelas y daños secundarios que con frecuencia son más nocivos que la lesión 1ª. Compuestos que actúan sobre la membrana celular: Sustancias orgánicas y amonio cuaternario se intercalan en la membrana lipídica alterando la disposición de fosfolípidos y proteínas provocando varios efectos:
- Alteración de la permeabilidad de la membrana, pérdida de moléculas, iones, agua, etc.
- Alteración del transporte.
- Alteración del metabolismo energético. Estos pueden ser a su vez:
- – Compuestos fenólicos. Son bactericidas a bajas concentraciones porque inactivan de forma irreversible proteínas y enzimas de membrana con la consiguiente pérdida del contenido celular. En la práctica no se utilizan fenoles, sino unos derivados como son los cresoles. Su mayor efecto recae sobre el género Mycobacterium , son activos en presencia de materia orgánica y tienen una persistencia elevada sobre la superficie donde son aplicados. En cambio son muy irritantes para la piel debido a que su hidrosolubilidad es muy baja, su olor es muy desagradable. Pseudomonas y algunas bacterias Gram + como Rhodococcus pueden utilizar los fenoles como fuente de carbono. Los virus son totalmente insensibles a los fenoles. Su mayor utilidad es la de servir como índice de referencia para otros compuestos.
- – Hexaclorofeno. Fue muy utilizado junto con el flúor porque son muy activos contra la flora bacteriana de la dermis, es muy insoluble, a altas concentraciones produce trastornos cerebrales. Actualmente sólo se aplica en hospitales infantiles para controlar infecciones por Staphylococcus y ocasionalmente para el control de infecciones nosocomiales (enfermedades de contagio indirecto en los hospitales).
- – Compuestos alcohólicos. Etanol e isopropanol, tienen acción bactericida y fungicida pero son inútiles frente a esporas, sin embargo ciertos tipos de virus, virus envueltos, sí son atacados por alcoholes. Los alcoholes poseen doble efecto; desorganizan estructuras lipídicas de las membranas y coagulan proteínas. Los alcoholes más útiles son los alifáticos de cadena corta. Se emplean en unas concentraciones entorno al 70 u 80 % en volumen de alcohol. compuestos que desnaturalizan proteínas: Actúan a varios niveles, pueden producir arrollamientos irregulares de la conformación 3ª de la proteína, arrollamientos aleatorios de la molécula nativa que lleva a su desnaturalización, etc. a nivel enzimático puede reducir los puentes disulfuro entre cisteinas adyacentes, provocando la pérdida de la actividad enzimática.
- – alógenos. Yodo, como antiséptico tópico y el cloro como desinfectante de aguas se encuentran entre las moléculas de aplicación universal, son muy potentes frente a bacterias y esporas. El yodo se puede aplicar de dos formas; tintura de yodo, se trata de una aplicación alcohólica al 2 % de yodo e yoduro potásico, es irritante para la piel, produce coloración y puede generar reacciones alérgicas. La otra forma es en forma de yodóforo, no es más que una mezcla de yodo con un compuesto orgánico que aumenta la permeabilidad del yodo, lo solubiliza en agua y facilita su liberación de forma lenta. Entre las marcas comerciales destacan Betadine e Isodine, generalmente poseen agentes tensioactivos. El yodo se une a la tiroxina produciendo alogenación e yodación de proteínas, parece ser que no posee efectos secundarios. El cloro es el desinfectante de uso universal para redes de potabilidad de aguas, depósitos, piscinas e igualmente en empresas de tipo lácteo y alimenticio. El cloro se aplica bajo dos formas; cloro libre y sales de cloro (hipocloritos), de tal manera que cuando el cloro libre se mezcla con el agua se produce la siguiente reacción: Cl 2 + H 2 O ---------- HCl + HOCl. Ca(OCl) 2 + 2H 2 O --------- Ca(OH) 3 + ClOH. El ácido hipocloroso se descompone formando el ácido clorhídrico y ½ de oxígeno naciente, oxidante muy fuerte. La acción del cloro disuelto es muy rápida, en 30 minutos aproximadamente
el compuesto que produce mayor halo de inhibición es el de mejor elección, ya que hay que tener en cuenta el grado de toxicidad y los efectos secundarios, junto con la capacidad de eliminación del organismo.
- Cálculo del índice de fenol. Solamente para microorganismos sensibles a fenol como Salmonella tiphi y Staphylococcus. Mide la eficacia de cualquier desinfectante o antiséptico y la compara con el fenol. CMI = 1 / 100 y 1 / 250 U = es el inverso de las diluciones que corresponden a CMI para el compuesto X respecto a la CMI del fenol. 100 / 250 = 0.25 Si es < 1 es menos eficaz. Si es > de 1 es más eficaz. Mertiolato U = 1. Alcoholes U = < 1. Sirve para comprobar los productos frente al fenol en condiciones estándar de laboratorio. VARIANTES PARA LA DESTRUCCIÓN MICROBIANA. Se basan en la prueba de la dilución, se cogen cilindros metálicos y se sumergen en distintas preparaciones de microorganismos, cada uno en una, cada cilindro se sumerge en tubos que contienen distintas concentraciones de desinfectantes, se incuban y se mide la presencia o ausencia de crecimiento. De nuevo a mayor dilución, menor concentración del compuesto. Otra es contaminar los cilindros con una misma concentración de bacterias problema y sumergir estos cilindros en unas baterías de distintos desinfectantes durante 10 minutos, a continuación se incuban de 24 – 48 horas y se calcula la concentración de desinfectante que produce la muerte de la suspensión problema. Fiabilidad superior al 95%. Mide la sensibilidad del desinfectante en una situación concreta. TEMA 5: AGENTES QUIMIOTERAPICOS SINTETICOS.
Desarrollo de la quimioterapia. El principio de acción selectiva. Las sulfamidas y otros antagonistas metabólicos. Inhibidores de la función del ADN. Mitomicinas. Quinolonas. Otros antimicrobianos sintéticos. Isoniacida. DEFINICIÓN: son sustancias antimicrobianas que sirven para tratar las infecciones, bien sean producidas por bacterias, virus, hongos, protozoos, etc. destruyendo o inhibiendo su crecimiento. Se usa en el tratamiento contra los tumores, células del propio organismo que se vuelven nocivas. Se diferencia de los desinfectantes en que es capaz de actuar en el interior del organismo, poseen una toxicidad selectiva en grado máximo, dependiendo de su concentración, pueden causar efectos secundarios. CLASIFICACIÓN. Los agentes quimioterápicos se clasifican en –státicos y en –cidas. Así, un compuesto bacteriostático será aquel que provoque que las células microbianas dejen de crecer pero que sigan siendo viables. Un compuesto bactericida es aquel que provoca que el número total de células se mantenga constante, ya que las células siguen sin lisar, lo que no se sabe es si las células están vivas o muertas. El compuesto bacteriolítico es aquel que lisa las células, el número total de células y el número de viables sigue un descenso paralelo. Nota: todos los compuestos bacteriolíticos son bactericidas, pero no todos los bactericidas son bacteriolíticos. DESARROLLO DE LA QUIMIOTERAPIA. Desde el punto de vista empírico los datos de sustancias que han sido utilizadas por el hombre para curar enfermedades son muy antiguos, por ejemplo; en China se utilizaba el “cuajo mohoso” para las quemaduras de la piel. En la Grecia antigua, Hipócrates utilizaba vino, mirra y extractos de plantas para curar ciertas enfermedades. Los indios del Perú utilizaban la corteza de ciertos árboles que contenían quinina para combatir la malaria. La utilización de plantas ha sido un uso corriente a lo largo de la historia por el hombre. La quimioterapia como ciencia tiene su origen en el científico alemán Paul Ehrlich, que fue desarrolló el concepto y teoría de “bala mágica” basado en la teoría de la toxicidad selectiva. Utilizaba colorantes para teñir tejidos y observaba que los colorantes se adherían a ciertas estructuras del organismo, pensó que el colorante poseía una afinidad selectiva por el tejido. Si se era capaz de utilizar esta base para aplicar compuestos tóxicos afines para los patógenos pero no para los tejidos, se controlarían muchas enfermedades infecciosas. Desarrolló muchas sustancias entre las que se encuentra el Salvaxan 505, compuesto basado en el arsénico (Ar), que fue utilizado contra la sífilis Treponema pablidum. La clave de los agentes quimioterapeuticos no estriba en la potencia sino en la selectividad del compuesto. Todavía son aplicados hoy día contra el cáncer, enfermedades autoinmunes y degenerativas. Sus ideas no tuvieron mucho éxito porque los componentes que aisló eran inactivos en cultivo. El problema radicaba, según sus detractores, en que los compuestos que aisló ayudaban a las defensas del organismo, pero que por sí no tenían ningún valor. Con este hecho desaparece la quimioterapia hasta 1935. Domagk realizó una búsqueda selectiva de compuestos microbianos encontrando las sulfamidas, descubrió por qué Ehrlich había fracasado; los compuestos quimioterapeuticos debían ser procesados metabólicamente por el organismo para que fuesen compuestos activos. Descubrió el Prontosil, que servía para controlar infecciones por Staphylococcus. Se descubrió que los pacientes tratados con Prontosil secretaban en la orina sulfamidas. A partir de estos momentos arranca la segunda edad de oro de la microbiología. ASPECTOS GENERALES DE LA ACCIÓN QUIMIOTERÁPICA. Antes de aplicar ningún compuesto debemos tener en cuenta ciertas propiedades para saber; cuál, en qué dosis y el camino de inoculación o de su administración.
- – Identificación del patógeno siempre que sea posible.
- – Rango de sensibilidad, posibles compuestos a aplicar, tipo de respuesta del patógeno, etc. con lo que sabemos el rango de inhibición. Los problemas que se nos plantean ahora son; que no sirve este procedimiento para microorganismos anaerobios ni para microorganismos de
eucariótico 80S. Actúan bloqueando distintas etapas como la lectura del mensajero, la translocación del sitio A al sitio P. Salvo algunos casos la inactivación del ribosoma no suele conducir a un cambio letal, ya que a partir del ADN se pueden fabricar nuevos mensajeros para poder restaurar los enzimas dañados. RESISTENCIA FENOTÍPICA. Se da con muchos quimioterápicos. Si analizamos el efecto de un bactericida sobre una población observaremos que nunca tiene una acción letal completa. Existen organismos que adquieren resistencia natural al compuesto, pero no la transmiten a la siguiente generación. Si pasamos este microorganismo a un medio fresco, se observará crecimiento. Existen varias hipótesis para este fenómeno: Errores en la división celular. Las vías metabólicas para la acción bactericida quedan bloqueadas. Esta resistencia explica porqué se requieren tratamientos muy prolongados o que la enfermedad se haga crónica (brucelosis). Se piensa que este fenómeno es más abundante in vivo , dentro de nuestro cuerpo. TIPOS DE RELACIONES ENTRE QUIMIOTERÁPICOS. Antagonismo. Ocurre si la acción de un compuesto inhibe la acción de otro agente. Por norma general la acción de los bactericidas son antagonizados por los bacteriostáticos, ya que con frecuencia los dos utilizan la misma vía. Está comprobado que cultivos de Echerichia coli tratados con cloranfenicol quedan protegidos contra estreptomicina. Sinergismo. La acción bactericida se potencia en presencia de otro quimioterápico, de manera que la acción final es mucho mayor a la esperada por la suma de los dos efectos individuales. Las penicilinas actúan en sinergismo con los aminoglucósidos (estreptomicina), ya que la penicilina rompe la pared celular y la estreptomicina tiene el camino libre, pero si primero actúa la estreptomicina, el sinergismo no tiene lugar. SULFAMIDAS. Fueron los primeros quimioterápicos estudiados. Han servido para estudiar los fenómenos de competencia entre determinadas drogas y metabolitos esenciales. MODO DE ACCIÓN. La sulfanilamida que es un análogo del ácido paraaminobenzoico (PABA), precursor de las bases púricas y pirimidínicas además de la síntesis del ácido fólico. La sulfanilamida compite con el ácido benzoico por lo que inhibe el paso a ácido dihidrofólico. Todas las sulfamidas son bacteriostáticas. Presentan toxicidad selectiva para muchos patógenos ya que las bacterias sintetizan sus requerimientos de ácido fólico, los humanos los incorporamos en la dieta. La eficacia real de las sulfamidas se ve limitada por:
- En un 10 – 15% de los pacientes tienen efectos secundarios.
- Han inducido la aparición de resistencia en alto porcentaje. Con las sulfamidas se trataba la Meningitis meningococica por punción directa en las meninges. El antagonismo competitivo es modificado si alteramos la concentración de sustratos. Si aumentamos la concentración de sustrato se minimizan los efectos de la droga, esto explica que sean bacteriostáticos. TRIMETOPRIM. Es un ejemplo característico de sinergismo con las sulfamidas. Es un análogo del folato (ácido fólico) y bloquea el paso siguiente donde actúan las sulfamidas. La enzima del paso siguiente también se encuentra en humanos pero presenta mayor afinidad por la enzima bacteriana. Se han modificado las sulfamidas químicamente a partir de compuestos previos. Todas tienen el mismo espectro de funcionalidad. Uno muy usado es el Sulfametaoxazol. OTROS ANTIMETABOLITOS QUE SE EMPLEAN. Son compuestos que bloquean el funcionamiento del enzima o rutas clave necesarias para la supervivencia de la célula. Siempre el antimetabolito paraliza el crecimiento de todos los patógenos que tengan un requerimiento del sustrato correspondiente. Se sintetizaron muchos compuestos de este tipo, pero la mayoría no son utilizables en clínica; la piritianina o la fenilpantotenona que se ha utilizado tradicionalmente contra la piritonina malaria, la dapsona
que ha sido el compuesto que se emplea en el tratamiento de la lepra, el PAS (ácido paraaminosalicitico) que se ha usado contra la tuberculosis. Este PAS es más accesible a las células de resistencia. Estos antimetabolitos no presentan utilidad porque:
- Son de bajo peso molecular, solubles y se excretan rápidamente.
- La mayoría presentan acción transitoria, es decir, si inhiben a un enzima el sustrato previo queda acumulado y el agente es inhibido o se sintetizan nuevas copias de la enzima.
- Es imprescindible que el patógeno tenga un requerimiento específico del compuesto antagonizado y además una afinidad igual o mayor por el sustrato.
- Se necesita mejorar la toxicidad selectiva del compuesto. ISONIAZIDA. Actualmente es el antimetabolito que ha resultado más eficaz sobre el control de micobacterias y específicamente en el tratamiento de la tuberculosis. Ha resultado mucho más útil que el tratamiento con antibióticos porque:
- Es menos tóxica, es bactericida incluso a bajas concentraciones. Se aplica por vía oral y es activa contra los patógenos intracelulares como contra las bacterias libres en sangre.
- La resistencia de las micobacterias frente a isoniazidas aparece por mutaciones sucesivas, por lo que disminuye la virulencia del microorganismo, pierde capacidad infecciosa.
- La isoniazida sólo es activa frente a micobacterias que presenten crecimiento activo. ESPECTRO DE ACCIÓN DE LAS ISONIAZIDAS. Su acción es muy restringida, sólo actúa sobre micobacterias o algún género relacionado ( Nocardia, Corynebacterium, Rhodococcus ). La isoniazida inhibe la síntesis de ácidos micólicos que son específicos de este grupo, que se encuentran unidos a la capa de peptidoglicano y son los responsables de la rigidez y permeabilidad de las células. Así pierden la propiedad ácido-alcohol resistente. Si se trata una suspensión de micobacterias con una concentración de 5pmol / 10^10 células se inhibe la síntesis de la pared. En los últimos años existe un aumento alarmante de la resistencia a las isoniazidas y hacia otras drogas, sobre todo en pacientes con SIDA y otras enfermedades inmunodepresivas que liberan cepas de micobacterias al ambiente. Este fenómeno es debido a que los propios pacientes no cumplen con el tratamiento (el tratamiento con isoniazida es de 12 meses) debiendo tomar una rigurosa medicación a diario ya que si no, la enfermedad rebrota y los bacilos son resistentes a las drogas. En los hospitales se aplican cócteles para resistencias múltiples. QUINOLONAS. Son un grupo de quimioterápicos muy utilizados en muchos países. La primera quinolona fue el ácido nadilíxico, se diferencia en los sustituyentes. Se utiliza para infecciones del tracto genito-urinario. Un problema es la alta frecuencia de aparición de resistencia. Fue retirado del mercado y sustituido por derivados fluorados como narfloxacina y ciprofloxacina que son más activos que el ácido nadilíxico. Se utiliza contra bacterias como Echerichia coli, Kleibsella, Pseudomonas aeruginosa, etc. (Gram -). También se han aplicado contra infecciones de los tractos respiratorios y digestivo, parece ser efectivo contra cocos Gram + como Streptococcus y Staphilococcus. Son bactericidas pero empleadas a una concentración superior al valor de la concentración mínima obligatoria. Estas quinolonas no generan resistencia por plásmidos sino por mutaciones sucesivas en fases acumulativas. Además se usan con cierto éxito en enfermedades de transmisión sexual y lesiones en la piel por Clamydia. MODO DE ACCIÓN. Actúan inhibiendo la replicación del ADN a nivel de la ADN-girasa bacteriana (parecida a la topoisomerasa). Esta enzima tiene dos subunidades y cataliza la formación de superenrollamientos negativos, este proceso es necesario para que se separen las dos cadenas y se pueda replicar el ADN. Si los superenrollamientos no se forman, la maquinaria de replicación no puede actuar. La novobiocina interacciona con la ADN-girasa en la subunidad b.
TEMA 6: ANTIBIÓTICOS.
Terminología. Propiedades generales deseables. Valoración de antibióticos. Clasificación de antibióticos por su origen, espectro de acción, forma de actuación, mecanismo de acción o estructura química. Acción combinada de antibióticos. Uso no clínico de antibióticos. Función de los antibióticos en la naturaleza. ANTIBIÓTICO: se puede definir como productos químicos bien producidos por microorganismos o sustancias químicas que en pequeñas concentraciones inhiben el crecimiento o mata a los microorganismos. ORIGEN: En 1929 Fleming trabajaba con un cultivo de Staphylococcus que dejó varios días. Observó que la placa se le había contaminado con un hongo y en la vecindad de este hongo existía un halo de inhibición del crecimiento. Pensó por la inhibición del crecimiento que el hongo había producido alguna sustancia difusible (penicilina), ya que el hongo era Penicillium notatum. El problema ahora era que la penicilina es una sustancia muy inestable y difícil de manejar y producir. En 1939 un químico que trabajaba en Inglaterra; Chain, junto con Florey, redescubrieron los trabajos de Mendel y empezaron a producir penicilina en cantidades industriales. Fue de gran utilidad en la Segunda Guerra Mundial. Fue a partir de aquí cuando se empezó a buscar nuevos productos naturales y Walkman en 1944 encontró el primer antibiótico de amplio espectro que es la Estreptomicina. Los antibióticos son eficaces contra bacterias pero no contra infecciones de hongos. Existen algunos antibióticos antifúngicos como la Nistatina o la Anfotericina B. No hay antibióticos para virus. Los antibióticos son de alta distribución en la población y regulan el tipo de microorganismo y su sucesión. Los antibióticos son un grupo de compuestos muy heterogéneos, la única característica en común es que son antimicrobianos. De todos los antibióticos que se han encontrado, menos del 1% han sido útiles en clínica. La mayoría son producidos por microorganismos del suelo ya que el suelo es muy pobre en nutrientes y los microorganismos productores de antibióticos obtienen una ventaja ecológica a la hora de competir con los nutrientes. Un ejemplo son: Pemicillum >>>>>>> pemicilina Cephalosporium >>>>>>> cefalosporina Streptomyces, Nocardia y Bacillus. Estos son los microorganismos que sintetizan la mayoría de antibióticos útiles en clínica. PROPIEDADES IDEALES DE LOS ANTIBIÓTICOS. 1). – TOXICIDAD SELECTIVA. A de ser inocuo para el hospedador y fatal para el microorganismo. No hay ningún agente inocuo, pero ninguno produce la pérdida de funciones esenciales. 2). – HIPERSENSIBILIDAD. No debe provocar reacciones de alergia en un alto porcentaje de pacientes. 3). – SOLUBILIDAD Y DIFUSIÓN DEL QUIMIOTERÁPICO EN EL INTERIOR DEL ORGANISMO. Los quimioterápicos más eficaces son solubles en los líquidos intersticiales accediendo más rápidamente al interior del organismo. Al mismo tiempo se pide que su velocidad de secreción y degradación sea muy lenta con el objetivo de que esté tiempo activo en sus tejidos. Igualmente se pide que sea estable en el proceso de control clínico. 4). – RESISTENCIA. Que el quimioterápico no induzca fácilmente la adquisición de resistencia contra él y esté siempre activo. 5). – ACCIÓN. Es preferente que la acción sea bactericida, sobre todo si el paciente se encuentra inmunodeprimido, además la capacidad bactericida a de alcanzarse rápidamente in vivo y debe mantenerse durante un tiempo prolongado. 6). – EFECTIVIDAD. Que sea altamente efectivo y con un amplio espectro frente a los patógenos más comunes en clínica, preferentemente hidrosoluble y que permanezca activo en presencia de sangre, exudados y líquidos corporales. APLICACIONES Y DIANAS DE ANTIBIÓTICOS. Menos del 1% de los antibióticos se usan en clínica. Su utilización se genera a partir de La Segunda Guerra Mundial, han servido para controlar los agentes infecciosos pero a partir de ahí también se ha ido generando resistencias.
La resistencia es el principal problema en la actualidad. Una manera de luchar contra esta resistencia es modificando los compuestos ya existentes en el mercado (antibióticos semisintéticos). Consideraciones a tener en cuenta:
1. – Las bacterias Gram + son más sensibles que las Gram -. 2. – Se prefieren antibióticos de espectro reducido. 3. – Hay que tener en cuenta que actualmente se utilizan antibióticos de amplio espectro que promueven un mayor nivel de resistencia tanto genética como fenotípica. 4. – Los antibióticos se clasifican en función de su estructura química y de su modo de acción. Aunque la estructura varíe, la mayoría son moléculas grandes que suelen contener anillos, los cuales pueden interaccionar con regiones hidrófobas facilitando su penetración en la célula. 5. – Las dianas de los antibióticos son las mismas que las de los quimioterápicos; pared celular, membranas, rutas de biosíntesis de proteínas y ácidos nucleicos, etc. Pero muchos antibióticos tienen una diana primaria y un sitio de acción secundario, de manera que a menudo se dan estados intermedios entre el efecto de la droga y la lesión última que produce. Esto explica el porqué el tratamiento tiene que ser prolongado. OTRAS APLICACIONES DE ANTIBIÓTICOS. En la alimentación de animales domésticos se adicionan antibióticos a los piensos en bajas concentraciones, esto estimula el crecimiento de los animales estabulados aumentando el rendimiento económico, ya que favorece una ganancia de peso y mejora la alimentación. Inhiben la flora microbiana de parásitos y patógenos que causan infecciones leves, reducen las defensas fagocitarias, la inflamación del epitelio intestinal. Esta aplicación es la causa del elevado número de resistencias ya que selecciona una microbiota capaz de soportar los antibióticos, diseminándose genes de resistencia a la microbiota. El hombre y los animales domésticos comparten parte de su flora intestinal, se abre una vía de transmisión de patógenos que van al hombre. La mayoría de estos genes de resistencia están codificados en plásmidos y transposones por lo que al consumir carne o sus derivados los marcadores de resistencia pasan al hombre y la flora natural adquiere factores de resistencia. Los animales que han sido tratados con antibióticos en la alimentación, cuando se deja de tratar mantienen durante largo tiempo la flora resistente de manera que el intestino ha eliminado su flora natural y posee una flora microbiana modificada. Profilácticos, los antibióticos se emplean para evitar la aparición de enfermedades. Algunas infecciones alimenticias se achacan al uso de antibióticos en productos agrícolas. PAPEL ECOLÓGICO DE ANTIBIÓTICOS. Los antibióticos son metabolitos secundarios por lo que solo se sintetizan en la fase estacionaria del crecimiento, donde ya no existe crecimiento exponencial. El metabolismo primario es muy parecido en todos los organismos, el secundario no. Dentro de este metabolismo secundario se incluyen algunos de los productos que tienen mayor valor industrial como vitaminas, ácido cítrico, ciclosporinas (inmunodepresor), aminoácidos y antibióticos. Ninguno de los metabolitos secundarios son necesarios para el crecimiento celular y sólo los producen un número limitado de microorganismos. La producción de estos metabolitos depende de las fuentes nutricionales y muy a menudo están sometidos a un proceso de represión por sustrato. Los antibióticos muestran una baja especificidad biosintética, son varios compuestos químicamente muy relacionados pero ligeramente distintos. Streptomyces tiene hasta 32 componentes relacionados con estructura parecida a la antraciclina. La mayor parte de los metabolitos secundarios están sujetos a modificación génica, así que se pueden obtener producciones masivas por mutaciones. En cambio, los metabolitos primarios no pueden ser alterados en su producción. Mutaciones que afectan a las primeras etapas de la esporulación inhiben la síntesis de antibióticos. Se piense que algunos antibióticos regulan el proceso de esporulación, pero la idea que también se tiene es que algunos antibióticos proceden de la degradación de la membrana celular en el proceso de formación de la preespora. Esta membrana es rica en D-aa y hay antibióticos con D-aa como la bacitracina que procede de una proteína que se degrada en la
