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BLOQUE I: INTRODUCCIÓN
TEMA 1: EL DESCUBRIMIENTO DEL MUNDO MICROBIANO
El objeto de estudio de la Microbiología es invisible a simple vista. La Microbiología es el conjunto de estudios cuyo objetivo final es el conocimiento de los microorganismos en cualquiera de sus aspectos, por lo que son y por lo que hacen (objeto formal). Denominamos microorganismo (objeto material) a todo ser vivo que a lo largo de su vida no sobrepasa los 0,1mm de tamaño, que desarrolla un ciclo de vida completo e independiente, que no se diferencia en tejidos u órganos y que necesita para su estudio una metodología propia y adecuada a sus pequeñas dimensiones.
CLASES DE MIRCOORGANISMOS
Con organización celular:
• poseen membrana celular.
• tienen como ácidos nucleicos tanto ADN
como ARN
Procariotas Arqueas Bacterias
Eucariotas
Protozoos Algas microscópicas Hongos microscópicos
Sin organización celular:
- no poseen membranas.
- nunca están presentes los 2 ácidos nucleicos juntos.
- son parásitos estrictos de los que tienen organización celular, ya que carecen de metabolismo
Virus Partículas subvirales: - viroides.
A diferencia de otras disciplinas que estudian organismos, la Microbiología estudia entidades sin más relación que su pequeño tamaño. Sin embargo permanece como una disciplina perfectamente diferenciada debido a la coherencia interna del tipo de metodologías aplicadas al estudio de los microorganismos y a que aporta un conjunto específico de conceptos que han enriquecido la moderna biología.
La microbiología consta de 2 grandes bloques evolutivos: Bacteria Procariotas Arquea Microorganismos
Eucariotas
DESARROLLO HISTÓRICO: PERÍODOS EN LA EVOLUCIÓN DE LA MICROBIOLOGÍA
- Antigüedad – primeros microscopistas: F 0 E 0período especulativo. La humanidad sufre/aprovecha las actividades microbianas antes del descubrimiento de los microorganismos; enfermedades infecciosas y alimentos y bebidas fermentados.
- 1675 – mediados del siglo XIX: · primeros microscopistas. · controversia sobre la generación espontánea. · fermentación y vida anaerobia.
- mediados siglo XIX – principios siglo XX: · cultivo de microorganismos y avances técnicos. · teoría microbiana de las enfermedades infecciosas.
- principios siglo XX – actualidad: · multitud de enfoques en el estudio microbiano. · surgimiento/escisión de algunas especialidades (virología, inmunología).
Primeros microscopitas Robert Hooke inventó el microscopio compuesto, acuñó por primera vez el término célula y describió hongos filamentosos. Antonie van Leeuwenhoek descubrió el mundo microbiano (descrubrió los “animáculos”) gracias a un microscopio simple.
El desarrollo de la Microbiología dependió de todo ésto, pero también de otros, como la aclaración de la Teoría de la Generación Espontánea : se pensaba que los microorganismos procedían de la materia orgánica en descomposición. Era una teoría muy arraigada, apoyada por multitud de grandes personalidades como Aristóteles.
Johann Van Helmontz (siglo XVII) apoyaba esta teoría basándose en experimentos que realizó, como el de dejar ropa sucia y trigo en un lugar determinado; al tiempo, la ropa y el trigo desaparecen y aparecen ratones, lo que él atribuyó a un proceso de organización de la materia para crear organismos nuevos. Confundió los efectos con las causas.
En el siglo XVIII, John Needham preparó una sopa o extracto de carne y lo calentó, pensando que todos los microorganismos morían con la ebullición, y lo colocaba en un sitio cerrado con un tapón de corcho. Vio que aparecían microorganismos en el extracto y dedujo que procedían de la carne.
Lazzaro Spallanzani hizo el mismo experimento, pero aisló el extracto herméticamente, y no aparecían microorganismos. Dedujo que los microorganismos que había en el experimento de Needham pasaban desde el exterior a través del corcho.
Francesco Redi vio que si cogía un trozo de carne, lo hervía y lo dejaba pudrir en contacto con el aire, aparecían gusanos. Sin embargo, si lo tapaba, no. Si se dejaba al aire libre, las moscas dejaban huevos y entonces aparecían gusanos, y tapándolo las moscas no tenían acceso a la carne, por lo que desmintió la generación espontánea.
Esta teoría tuvo una controversia que duró siglos. Los que estaban a favor pensaban que en el aire existía un “fluído vital” que producía la aparición espontánea de organismos.
Franz Schulze puso los caldos expuestos al aire previamente en contacto con ácido, que eliminaba los microorganismos, y vio que no aparecían microorganismos en el caldo. Theodore Schwann consiguió el mismo resultado calentando el aire que entraba en contacto con la muestra. Los defensores de la teoría alegaban que el fluído vital era sensible al ácido y el calor.
Un experimento clave para rechazar la teoría lo realizaron en el siglo XIX Georg Friedrich Schroeder y Theodor von Dusch : cogieron caldo, lo hirvieron y lo colocaron en un matraz cerrado con algodón estéril, por el cual entraba el aire, pero que retenía a los microorganismos, por lo que éstos no aparecían en el caldo.
En el año 1861, Louis Pasteur definitivamente rechazó la teoría de la Generación Espontánea. En primer lugar realizó un experimento para demostrar la función del algodón para retener microorganismos: filtró el aire a través de un algodón y observó que habían quedado atrapados partículas semejantes a esporas de plantas, y que si se colocaba un trozo de este algodón en un medio estéril, se producía crecimiento microbiano. A continuación, introdujo soluciones de nutrientes en matraces y calentó los cuellos de éstos en una llama para darles distintas formas curvadas, manteniendo el extremo de los cuellos abiertos a la atmósfera. Luego hirvió las soluciones y las dejó enfriar. No se produjo crecimiento aunque el contenido de los matraces había estado expuesto al aire. Pasteur señaló que no se había producido crecimiento microbiano porque el polvo y los gérmenes habían quedado atrapados en las paredes de los cuellos curvados. Si se rompían los cuellos, comenzaba el crecimiento inmediatamente. Por aquel entonces se consideraba que la putrefacción era el origen de los microorganismos, cuando en realidad eran ellos los que originaban la descomposición.
Muchas veces la suerte ha determinado las evidencias clave: muchos microorganismos no mueren durante la ebullición (son termoresistentes), y dio la casualidad de que, durante el experimento que realizó Pasteur , no había este tipo de organismos, o su experimento no habría funcionado.
Todos estos experimentos demostraron que no existe la generación espontánea, o que al menos ésta no es posible en las condiciones actuales.
Se fue viendo que existía una correlación entre el crecimiento de los microorganismos en el medio y los cambios químicos que se producían en éste. Se puso de manifiesto que los microorganismos eran la causa y no el efecto de estos cambios. Jöns Jacob Berzelius, Justus von Liebig y Friedrich Whöler , que pensaban que la materia era capaz de cambiar por sí misma. Cagniard-Latour, Theodore Schwann y Friedrich Kützing vieron que estos cambios, como el cambio de glucosa a alcohol, sólo se producían si había en el medio un tipo de microorganismos.
Lo aclaró Pasteur , que era Químico pero apoyó a los Biólogos, y dedujo que sin microorganismos no había cambio, y que además debía ser un determinado tipo. Además hizo otra contribución, descubriendo la existencia de microorganismos anaerobios.
Todo esto permitió rebatir la Teoría del Pleomorfismo , y contribuyó a desarrollar técnicas de cultivos puros, y también aparecen las placas de Petri.
A finales del siglo XIX los investigadores se preguntaron si, a parte de la orgánica, los microorganismos eran capaces de transformar la materia inorgánica. Sergei Winogradsky descubrió la existencia de vida autótrofa; Martinus Beijerinck descubrió la fijación de N₂ atmosférico.
A finales de siglo había una serie de enfermedades todavía con causa desconocida. Se sabía que el agente que lo causaba era capaz de atravesar todos los filtros bacterianos conocidos entonces, por lo que su tamaño era mucho menor que el de cualquier bacteria. A estos agentes se les llamó virus, y no son considerados organismos porque no presentan organización celular.
Estos descubrimientos se deben a las observaciones de Dimitri Ivanowsky y Beijerinck****. La primera observación fue en una enfermedad de plantas, la del mosaico del tabaco. No lograron ver los virus por microscopía óptica, pero intuían su existencia. A finales del siglo XIX ya estaba establecido el origen de las enfermedades infecciosas.
Ivanowsky descubrió el primer virus: el TMV , o virus del mosaico del tabaco. Hizo extractos de una planta enferma del mosaico, y el sobrenadante lo coló por un filtro bacteriano que retenía a las bacterias. Si el líquido ya filtrado se inyectaba en una planta sana, ésta enfermaba. Propuso que probablemente existían agentes más pequeños que las bacterias, ya que superaban los filtros. Esto no demostraba que existiese un organismo vivo capaz de replicarse, ya que podría tratarse de una sustancia (lejía, toxinas, etc.).
Hoy en día se considera que el primer descubridor de los virus fue Beijerinck****. Pensó que tal vez se trataba de bacterias productoras de exotoxinas que serían filtrables, y que producirían la enfermedad, causando daño a distancia. Este sobrenadante, aunque se diluyera muchas veces, nunca perdía su capacidad patógena. Se llegó a la conclusión de que este principio infeccioso se reproducía y era mucho más pequeño que una célula. Se consideraron acelulares, por lo que no son considerados como organismos.
Más tarde se descubrió que no sólo había virus vegetales sino también animales. Frederick Loeffler y Paul Frosch descubrieron, ya en el siglo XX, el primer virus animal, el responsable de la fiebre aftosa o glosopeda. En 1916, Frederick W. Twort y Félix d’Herelle descubrieron virus bacterianos. A finales del siglo XX se describieron agentes más pequeños que los virus: en 1960, Theodor Diener descubrió los viroides (pequeños agentes patógenos subvirales constituidos por ácido nucleico solamente, RNA en general). Stanley Prusiner descubrió otros agentes más pequeños: los priones.
· Virus: ácido nucleico + proteínas · Viroides: ácido nucleico. Afectan a plantas · Priones: no tienen ácido nucleico. Afectan a animales
Muchos de estos descubrimientos iniciales se estudiaron porque las enfermedades que producían tenían impacto económico o en el hombre. Los microorganismos llamaron la atención por la capacidad destructiva o dañina que tenían.
Había, por tanto, que buscar remedios. Esto dio origen a 2 líneas de investigación: la inmunización y la quimioterapia.
INMUNIZACIÓN
Se basa en la profilaxis o tratamiento preventivo. El inicio de estas prácticas es antiguo: se iniciaron con las observaciones de Edward Jenner****. Observó que la viruela era una enfermedad tanto humana como vacuna. Se dio cuenta de que las personas que ordeñaban a las vacas afectadas de viruela no adquirían la viruela humana: de algún modo se hacían resistentes. Así sacó muestras de las heridas de la viruela vacuna y las inoculó en humanos sanos. Nacía de esta manera la primera vacuna, denominada así por Pasteur que lo hizo en honor a Jenner y sus estudios con las vacas. Actuaba contra enfermedades no sólo de origen viral, sino también de origen bacteriano, como el carbunco.
La vacuna contra la rabia fue elaborada por Pasteur. La rabia es un virus que ataca al sistema nervioso, primero actuando sobre los músculos de la zona de la garganta. Se le llamaba “hidrofobia” porque los afectados, aunque tienen sed, no pueden beber agua porque no controlan la epiglotis. Una mujer llevó a su hijo, Joseph Leister, ante Pasteur cuando un perro con rabia le mordió. Pasteur le dijo que aún no había probado su vacuna contra la rabia, pero la madre accedió a que vacunase a su hijo y le salvó la vida. El chico quedó tan agradecido que trabajó para Pasteur el resto de su vida.
Pasteur tuvo suerte: la rabia es la única enfermedad en la que se puede vacunar al paciente después de haberse infectado, porque el virus tarda mucho en llegar al sistema nervioso. QUIMIOTERAPIA Sólo se aplica cuando ya se ha enfermado. Junto con la inmunización aumentó la esperanza de vida del hombre al doble.
Partió de Paul Ehrlich , que, sugestionado por las ideas de Pasteur sobre la inmunización, pensó que podían existir sustancias químicas con toxicidad selectiva, capaces de dañar a las bacterias pero no a las células. Las llamaba “balas mágicas”.
Ehrlich y Sahachiro Hata empezaron a probar sustancias dañinas para las bacterias de Treponema pallidum , que provoca la sífilis, pero que eran inofensivas para las células del cuerpo humano. Después de 605 ensayos encontraron la sustancia correcta, a la que llamaron “ Salvarsan 606” , y que contenía pequeñas trazas de As. Se disparó toda una línea de investigación.
Pocos años después, Donald D. Woods descubrió las sulfamidas. Alexander Fleming , en 1926, estudiaba el Staphylococcus aureus cuando se dio cuenta de que su placa se había contaminado al caer una espora de Penicillium notatum , un hongo que secretaba alguna sustancia que impedía el crecimiento del estafilococo en sus alrededores. Fue en los años 40 cuando Ernst Chain y Howard Florey produjeron, por primera vez, la penicilina. Poco después, Selman Waksman descubrió la estreptomicina.
Para que una sustancia sea considerada como un antibiótico, debe estar producido por un microorganismo. Las sulfamidas, por ejemplo, no son un antibiótico, sino simplemente un agente químico. Todos los microorganismos que forman antibióticos son esporulados. El hecho de que produzcan estas sustancias no les supone ninguna ventaja ecológica, ya que lo hacen de forma secundaria.
Así comenzó la Era De Los Antibióticos. Los microorganismos son muy eficaces y eficientes, y por ello se hacen resistentes por el principio de Selección Natural. Es una selección mediada por los antibióticos. Siempre aparece algún microorganismo resistente por mutaciones.
MICROBIOLOGÍA ACTUAL
La Microbiología Actual estudia a los microorganismos y sus actividades, tanto patógenos como no patógenos. Comprende conocimientos de distintos campos: Ecología, Genética, Bioquímica, Morfología,… A su vez, la Microbiología se puede dividir en otros campos: - Bacteriología, - Virología, - Micología,…
Existe una aplicación clínica para el control de bacterias y virus con impacto en humanos y animales. También hay una aplicación industrial, que saca provecho de las actividades de los microorganismos.
Se cree que primero aparecieron los Archaea; organismos anaerobios que han llegado hasta nuestros días y se encuentran sólo en ambientes extremos que recuerdan a la Tierra primitiva. Son los que comenzaron la evolución hacia los eucariotas.
TIPOS DE MICROORGANISMOS
bacterias algas microscópicas Procariotas Eucariotas hongos microscópicos arqueas protozoos
Virus y partículas subvirales. DIFERENCIAS ENTRE PROCARIOTAS Y EUCARIOTAS
ASPECTO PROCARIOTAS EUCARIOTAS
Tamaño y diferenciación 0,1/0,2 - 10μm Unicelulares
10 -100μm Uni o pluricelulares. Tejidos y órganos.
Genoma
Nucleoide.
- 1 cromosoma.
- circular (excepciones).
- ligado a la m. plasmática
- plásmidos; no esenciales, con mecanismos de replicación independiente.
Núcleo (membrana).
- cromosomas.
- ADN en el núcleo, mitocondrias y cloroplastos.
- histonas.
- nucleolo.
- mitosis (centriolos, microtúbulos…).
- intrones.
Recombinación genética
- transferencia unidireccional del DNA (parcial, no recíproca).
- transformación.
- transducción.
- conjugación.
En meiosis se fusionan los gametos.
Citoplasma y estructuras intracelulares
- mesosomas (a veces) (invaginaciones de la m.p.).
- vacuolas de gas (a veces).
- microfilamentos (a veces).
- ribosomas 70S (RNA y proteínas) - microtúbulos. - microfilamentos. - orgánulos limitados por membrana; F 0 E 0mitocondrias. F 0 E 0cloroplastos (fotótrofos). F 0 E 0RE. F 0 E 0aparato de Golgi. F 0 E 0lisosomas. F 0 E 0peroxisomas. F 0 E 0vacuolas verdaderas. - ribosomas 80S y 70S (RNA y proteínas).
Membrana plasmática (doble capa de fosfolípidos y proteínas. Barrera de permeabilidad.)
- no contiene esteroles (excepciones; bacterias metanotrofas y micoplasmas sí, necesitan adquirir los esteroles del hospedador que parasitan).
- maquinaria respiratoria.
- maquinaria fotosintética (parte o toda (fotótrofos)). - contiene esteroles.
Pared celular
- normalmente con PG. Arqueas no, y micoplasmas no poseen pared.
- Pasteuria y Planctomyces (bacterias) no. - más sencilla químicamente. - celulosa (algas y plantas). - celulosa y quitina (hongos). - polisacáridos (levaduras).
Estructuras extracelulares
Pueden presentar:
- glicocálix (capsula o slime).
- flagelos (simples).
- pili.
- fimbrias.
Los que son móviles:
Diferencias funcionales
- no mitosis; división celular directa por fisión binaria (o gemación) [sin centriolos, huso acromático ni microtúbulos].
- no meiosis.
Formas anaerobias estrictas, aerotolerantes, facultativas, microaerofílicas y aerobias.
- mitosis.
- sistemas sexuales frecuentes. Alternancia de fases haploides y diploides mediante meiosis y fecundación.
- fagocitosis, pinocitosis.
- digestión intracelular.
- corrientes citoplasmáticas dirigidas.
Casi exclusivamente aerobias.
POSICIÓN DE LOS MICROORGANISMOS EN EL PROCESO EVOLUTIVO
Cuando se desmintió la Teoría de la Generación Espontánea , fue la época en la que Darwin publicó su “Origen de las Especies”. Se planteó la evolución histórica y se vio que los microorganismos tenían un origen mucho más antiguo: eran la base del origen de la vida.
Se plantearon 2 teorías:
- Teoría de la Panspermia: fue defendida por Remius. Defendía que la vida en el planeta tuvo un origen exógeno (meteoritos, etc.). Desplaza la resolución del origen de la vida a un origen remoto.
- Teoría del Origen Endógeno: defiende que la vida comenzó en este planeta.
Esta última implica que las condiciones de vida en el planeta no eran las de ahora. Se han sucedido numerosas fases geológicas, la primera de las cuales fue una época sin O₂ y con mucho NH₃, un ambiente muy reductor. Oparin apoyó la idea de que en esas condiciones antiguas se generara materia orgánica, base de la vida.
Mediante estudios posteriores se vio que la formación del planeta ocurrió hace aproximadamente 4.500 ma, pero no se formó una corteza terrestre estable hasta hace 3.000 ma. En esa época se formaba materia orgánica que no se descomponía, ya que no había ni O₂ ni microorganismos, y que se iba acumulando, permitiendo la aparición de microorganismos. El hecho indudable es que hace 2.500 ma ya había vida microbiana. Existen fósiles del Precámbrico de microbios llamados estomatolitos. Éstos empezaron a generar O₂ creando la primera atmósfera estable. Eran organismos anaerobios y vivían en condiciones extremas. Aún se observan estas características en Archaeas. El origen de los virus es más incierto. No han precedido a las células porque las necesitan para reproducirse, por lo que son posteriores a los procariotas.
- N: constituye el 12% del peso seco. Está presente en proteínas, ácidos nucleicos y otros constituyentes celulares. La mayor parte está disponible en forma inorgánica; NH₃, NO₃⁻, N₂. La mayoría puede usar como única fuente de N₂ NH₃, otros muchos pueden usar NO₃⁻, y las bacterias fijadoras de N₂ (nitrogenasa), N₂.
- P: está en ácidos nucleicos y fosfolípidos. Puede estar en forma de fosfatos inorgánicos y orgánicos. La mayoría usa PO₄³⁻ inorgánico y lo incorpora directamente.
- S: está en algunos aa’s (Cys y Met), algunos carbohidratos y ciertas vitaminas y coenzimas (biotina, tiamina y CoA). La mayoría utiliza SO₄²⁻ y lo reduce (reducción asimilatoria de sulfato). Unos pocos precisan de una forma reducida de S (cisteína).
Requerimientos de K, Ca, Mg y Fe
- K⁺: aumenta la actividad de varios enzimas (por ejemplo los de síntesis de proteínas).
- Ca²⁺: ofrece termorresistencia de endosporas (dipicolinato cálcico).
- Mg²⁺: es cofactor de muchos enzimas (complejos con ATP). Estabiliza ribosomas y membranas celulares.
- Fe²⁺ (y Fe³⁺): es esencial en la respiración celular. Forma parte de citocromos. Es cofactor de ezimas y proteínas transportadoras de e⁻. En ausencia de O₂ Fe²⁺ es soluble, y en presencia de O₂ Fe²⁺ está en forma de minerales insolubles.
*Sideróforos: son agentes quelantes de Fe, lo solubilizan y transportan al interior celular. Hidroxamatos o catecolatos-fenolatos: son esenciales para iniciar la infección de muchas bacterias patógenas.
FACTORES DE CRECIMIENTO
Son compuestos orgánicos requeridos en pequeñas cantidades solo por algunas células porque no pueden sintetizarlos. Deben ser suministrados en el medio de cultivo.
1) aa’s (proteínas).
2) purinas y pirimidinas (ácidos nucleicos).
3) vitaminas (moléculas orgánicas pequeñas que foman todo/parte de coenzimas).
Los factores de crecimiento más frecuentes. Los microorganismos “exigentes” requieren muchas vitaminas (bacterias acidolácticas). Las principales son tiamina, biotina y piridoxina.
*Bioensayos de crecimiento-respuesta para cuantificar el “factor limitante”. Cuando los microorganismos tienen los requerimientos en el medio, se dedican a crecer, y lo hacen hasta que se acaba uno de ellos, al que llamamos factor limitante, y entonces deja de crecer. Si se le administra este factor limitante en pequeñas dosis, el microorganismo crecerá de manera proporcional a la cantidad administrada. El factor limitante, por tanto, determina el crecimiento poblacional microbiano.
4) Otros, no habituales: - colesterol (micoplasmas).
- grupo hemo ( Haemophilus influenzae ).
RELACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS CON EL O₂
Los microorganismos, dependiendo de su requerimiento en O₂, se clasifican en:
- Aerobios: requieren y dependen del O₂, que actúa como aceptor final de e⁻. F 0 E 0 Aerobios obligados: completamente dependientes del O 2 atmosférico para crecer. Respiran siempre. Enzimas; SOD+, Catalasa+.
- Microaerófilos: requieren niveles de O 2 por debajo de la concentración atmosférica. Respiran y fermentan. Enzimas; SOD+, Catalasa +/- (niveles bajos). F 0 E 0 Aerobios facultativos: utilizan el O₂ cuando está disponible, pero también viven en ausencia de él. Su metabolismo depende de si hay o no O₂. Si hay respiran (crecen más), y si no hay fermentan (crecen menos). Enzimas; SOD+, Catalasa+. - Anaerobios:
F 0 E 0 Anaerobios aerotolerantes: no utilizan el O₂ pero no les es tóxico. Su metabolismo es siempre fermentativo. Enzimas; SOD+, Catalasa-. F 0 E 0 Anaerobios obligados o extrictos: no toleran el O2, les es tóxico, y muere en su presencia. Siempre fermenta. Enzimas; SOD-, Catalasa-.
DEFENSAS MICROBIANAS FRENTE AL O₂
³O₂ F 0 E 0triplete de O₂ (estado basal normal). ¹O₂ F 0 E 0singlete de O₂ (forma tóxica; oxida compuestos no deseados, tóxicos). Los pigmentos carotenoides sirven de protección.
El O 2 puede aceptar e⁻ y reducirse parcialmente con facilidad. Algunos constituyentes celulares (flavoproteínas, proteínas Fe-S, quinonas, grupos –SH etc) y la radiación promueven su reducción incompleta y lo convierten en ROS (especies reactivas del O₂).
Toxicidad: Radical hidroxilo (OH) > Anión superóxido O 2 -^ > Peróxido de hidrógeno (H 2 O 2 ).
Estos productos de reducción del O 2 son extremadamente tóxicos y tienen un gran poder de oxidación que destruye rápidamente los componentes celulares. Los microorganismos que viven en presencia de O 2 deben defenderse del O 2 -. Para ello, los microorganismos aerobios obligados y aerobios facultativos contienen normalmente la enzima superóxido dismutasa (SOD) y la catalasa , que catalizan la destrucción de los radicales O 2 -^ y H 2 O 2 respectivamente. La peroxidasa también puede
utilizarse para eliminar el H 2 O 2. 2 O 2 · -^ + 2H+^ SOD^ > O 2 + H 2 O (^2)
2 H 2 O 2 Catalasa^ > 2 H 2 O + O (^2)
H 2 O 2 + NADH + H +^ Peroxidasa^ > 2 H 2 O + NAD+
Los microorganismos aerotolerantes pueden carecer de catalasa, pero no acumulan el H 2 O 2 porque utilizan las peroxidasas. Se forma H 2 O pero no se libera O₂. Puede utilizarse el NADH.
CAPTACIÓN DE NUTRIENTES
1) Mecanismos específicos.
2) En ambientes pobres en nutrientes tienen que transportarlos contra gradiente de concentración.
3) Los nutrientes deben atravesar la membrana citoplasmática.
La membrana citoplasmática es: - permeable a compuestos solubles en fases hidrofóbicas y pequeños compuestos sin carga como el H₂O (también transportada mediante aquaporinas).
- impermeable a iones, moléculas cargadas y moléculas grandes transportadas mediante proteínas asociadas o insertas en la membrana.
En bacterias Gram- existe además: - membrana externa (de la pared celular); interviene en la regulación del paso de nutrientes y solutos.
- periplasma; presenta una composición y concentración de sustancias diferente.
SISTEMAS DE TRANSPORTE DE MEMBRANA (Todos hacia el interior excepto translocasas (exterior))
- A favor de gradiente de concentración: no gastan energía; - difusión pasiva.
- difusión facilitada; permeasas, especificidad de sustrato.
- En contra de gradiente de concentración: gastan energía y permiten acumular nutrientes/solutos contra gradiente de concentración; - transporte activo.
Difusión pasiva o simple Es el mecanismo más sencillo de transporte y no requiere gasto de energía. El flujo neto de solutos que se transporta se lleva a cabo por la existencia de un gradiente de concentración. Con este transporte se aproximan las concentraciones intra y extracelulares.
La velocidad de este transporte es directamente proporcional a la diferencia de concentración: a mayor diferencia, mayor velocidad.
En Gram+ este transporte no se conoce mucho. Hay unas proteínas equivalentes en función a las Binding Proteins, que se encuentran unidas a los lípidos de la cara externa del citoplasma.
- A expensas de un gradiente de concentración: es más común. Es un gradiente de H+^ o de Na+. En muchos
casos, la energía liberada por el microorganismo se utiliza para establecer un aumento del gradiente de H +^ a través de una membrana, situando una mayor concentración fuera que dentro. Una vez establecido ese gradiente de protones puede ser aprovechado para la incorporación de otras sustancias al interior celular. Las proteínas transportadoras de este transporte deben tener sitios específicos para las sustancias a transportar y otros para unir los H+^ y el Na+. A medida que esa sustancia se transporta, el gradiente se irá reduciendo. Siempre se está regenerando esta fuerza protomotriz, que continuamente se está produciendo.
Las proteínas de membrana responsables de este transporte no actúan conjuntamente con las Bindings Proteins. Se transportan sustancias como la lactosa.
Existen 3 tipos dependiendo del modo de transporte: F 0 E 0Uniporte: sólo interviene 1 sustancia. Los uniportadores transportan 1 sustancia a través de la membrana, ya sea para su entrada o para su salida. Este transporte está dirigido por un gradiente de e⁻. Se transporta por ejemplo K⁺, que aprovecha la diferencia de cargas de la membrana.
F 0 E 0Antiporte: es el transporte simultáneo de 2 moléculas en sentidos opuestos por un antiportador. Esta diferencia de cargas a los lados de la membrana puede permitir un antiporte electroneutro (1 anión y 1 H +) o un antiporte electrogénico (1 soluto sin carga y 1 H +). F 0 E 0Simporte: es el transporte simultáneo de 2 sustancias en el mismo sentido; uno va a favor de gradiente y otro se transporta con ella. También puede ser electroneutro (1 anión con 1 H +) o electrogénico (1 sin carga con 1 H+^ ).
Para transportar una determinada molécula no hay un solo mecanismo de transporte. La diversidad proporciona una ventaja ante posibles cambios ambientales, garantizando así el transporte.
Translocación de grupo Hay algunas sustancias que al entrar en la célula se modifican convirtiéndose en una sustancia impermeable para la célula. Esto permite que la célula mantenga una alta concentración de esa sustancia modificada en el interior a expensas de la sustancia no modificada del exterior.
Realmente, al ser simultáneo con el transporte, no se establece un gradiente de concentración porque son sustancias diferentes. Es un mecanismo conservador desde el punto de vista del gasto de energía (gasta menos) porque normalmente las sustancias, al entrar en la célula, se fosforilan, gastando energía (1 ATP para transportarla + 1 ATP para fosforilarla), mientras que el proceso de modificación sólo gasta 1 ATP. Esta translocación de grupo es específica de procariotas, y es típica de enterobacterias y otras bacterias fermentadoras.
El sistema más usado es el mecanismo de las fosfotransferasas. Se transporta:
a) Glucosa: consta de una enzima ( EI ) y de una proteína ( HPr ); ninguno de los 2 son específicos para la
glucosa. Después hay otras 3 enzimas ( 2A , 2B y 2C ), que son específicos para cada tipo de azúcar a transportar. La síntesis de estas enzimas está inducida por la presencia de la sustancia a transportar. 2A 2B 2C
Libre Asociada a Inserta en la membrana la membrana
El P llega a la glucosa a través de estas enzimas y procedente del PEP.
b) Ácidos grasos: se pueden transportar y a la vez tener unido el CoA , necesario para la utilización de estos
ácidos grasos. El sistema Acetil-CoA-sintetasa interviene en la entrada de ácidos grasos, introduciéndolos en la forma activada.
c) Bases nitrogenadas: pueden entrar y ser convertidas por un sistema denominado
Fosforibosintransferasa , que cataliza el transporte y la unión de ciertas bases a fosforibosilpirofosfato , que entran en forma de nucleótido. Algunas bacterias pueden incorporar ciertas bases como adenina, guanina, xantina, lipoxantina y uracilo al interior en forma de nucleótidos.
d) Proteínas: hay proteínas que se transportan fuera de la célula. Las proteínas requieren un transporte
especial, por translocasas.
TEMA 4: NUTRICIÓN MICROBIANA 2
MEDIOS DE CULTIVO
Son preparaciones nutritivas estériles, líquidas/sólidas, usadas en el laboratorio para el crecimiento, transporte o mantenimiento de microorganismos. Para el crecimiento deben contener una mezcla equilibrada de nutrientes a la concentración adecuada y deben reflejar el ambiente natural. Para seleccionar/identificar microorganismos específicos.
- Medio definido (sintético): composición química exacta conocida. (Fotolitoautrótrofos). Empleado con frecuencia en investigación.
- Medio complejo: muy nutritivo. Se desconoce la composición química exacta de algunos ingredientes. Puede satisfacer requerimientos nutricionales desconocidos (bacterias exigentes). Algunos ejemplos son; caldo nutritivo, caldo de triptona y soja, y agar MacConckey.
F 0 E 0Medios sólidos: agar (1 y 2%, normalmente al 1,5%). El agar es un polimero sulfatado rico en galactosa y ácido glucurónico (algas rojas). Es un buen agente solidificante; funde a 100ºC, sin endurecer hasta 40-42ºC. La mayoría de los microorganismos no lo degradan.
F 0 E 0Medios semisólidos (en tubos): agar (0,2-0,3%) e inoculación con asa de picadura.
*Otros agentes solidificantes: gél de sílice.
MEDIOS DE CULTIVO
Los medios se dividen en función de su finalidad, pudiendo ser:
- Selectivos: contienen algún componente (sales biliares, colorantes) que dificulta o inhibe el crecimiento de bacterias no deseadas, permitiendo el desarrollo de las que se buscan al no verse afectadas. [agar endo; eosina-azul de metileno; macConkey, agar verde brillante (enterobacterias)].
- Diferenciales: diferencian entre grupos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa según sus características biológicas. [agar-sangre (hemolíticos/no hemolíticos)], [agar MacConkey], y [agar-manitol-salado]
- Enriquecidos: contienen factores de crecimiento añadidos para favorecer el crecimiento de un microorganismo concreto pero sin perjudicar a otros. [agar-sangre].
H₂O, reacción catalizada por un catalizador que contiene pastillas de Pd. Una tira indicadora anaerobia de azul de metileno pierde el color en ausencia de O 2. Este sistema también se puede llevar a cabo con una bolsa de plástico
Si se trabaja con organismos anaerobios, se utiliza una cabina especial anóxica que lleva guantes incorporados y permite trabajar desde el exterior.
MANTENIMIENTO Y CONSERVACIÓN
a) Resiembras periódicas a medios frescos: en tubos de agar inclinados a intervalos variables según el
microorganismo. La resiembra consiste en coger un poco de una población e inocularlo en otro tubo.
b) Presevación de cultivos con una capa de aceite mineral estéril : ayudan a retrasar la deshidratación. La
viavilidad depende del tipo de microorganismo, generalmente de años (15-20).
c) Liofilización: implica desecar rápidamente por sublimación las células que se mantienen congeladas en un
medio de alto vacío. Así, le quitamos el H₂O a los microorganismos sin aplicar calor, y entran en un estado críptico latente. La presión atmosférica actúa como una especie de émbolo que empuja a las moléculas de H₂O, impidiendo su movimiento debido a la energía cinética de las moléculas. Los microorganismos recuperan su actividad biológica al añadir H₂O. Están en un estado llamado gliófilo : en este estado, los microorganismos se pueden conservar durante años, incluso décadas.
d) Conservación a muy bajas temperaturas: en N₂ líquido (-196ºC); el inconveniente es que el H₂O intracelular
se convierte en hielo que puede causar cortes y dañar a la célula. Por ello se añade glicerol , DMSO (dimetilsulfóxido). Así se evita la formación de microcristales que pueden dañar la estructura celular.
Todos los cultivos que se conservan bien liofilizados, también se conservan correctamente con N₂ líquido más algunos en los que no es adecuada la liofilización.
CULTIVOS TIPO Y COLECCIONES DE MICROORGANISMOS
Cepario: colección de especies microbianas mantenidas en el laboratorio (bien identificadas) para distintos estudios: enseñanza, investigación, industria. Cutivo tipo: el que se hace del microorganismo “representativo” de la especie (patrón de referencia).
- Colecciones de cultivos de microorganismos: - NCTC; Nacional Collection of Type Cultures. - ATCC; American Type Cuture Colelction. - CECT; Colección española de Cultivos Tipo.
El centro de información y distribución de cultivos tipo en Lausana (Suiza), con ayuda de la UNESCO, procura localizar cualquier cultivo que se solicite. Cooperación e intercambio entre colecciones. La propuesta de una especie nueva obliga a mandar un cultivo a una o más colecciones de cultivos.
TEMA 5: TÉCNICAS DE OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA
FUNDAMENTOS DE MICROSCOPÍA ÓPTICA
Los microscopios se pueden clasificar atendiendo al nº de lentes en simples y compuestos, y en función del principio en el que se basa la amplificación en MO (luz visible: campo claro, campo oscuro, contraste de fases, tridimensional, interferencia, fuerza atómica y confocal), ME (haces de e⁻: transmisión y barrido) y MU (luz ultravioleta: fluorescencia)
Amplificación: poder amplificador ocular x poder amplificador objetivo. Contraste: sólo podremos ver objetos cuando nos encontramos el objeto en un medio diferente. Se logra mediante procedimientos ópticos dependiendo del microscopio, o mediante tinciones para resaltar el objeto del medio. Poder de resolución (PR): es la capacidad de distinguir 2 puntos adyacentes como separados. Depende de; - longitud de onda (λ) de la luz visible usada (0,4μm-0,7μm). A mayor λ mayor PR.
- apertura numérica (AN) = n·senθ. n = índice de refracción del medio que atraviesa el haz, entre cubre y objetivo. θ = mitad del ángulo del cono de luz que entra al objetivo desde la muestra.
- Límite de resolución (LR): distancia mínima que debe existir entre 2 puntos para poder discriminarlos como tales. LR = λ / 2n·senθ
3º; aplicación de colorante(s). 4º; lavado. 5º; observación.
Colorantes : se emplean para la tinción. Son compuestos orgánicos que presentan 2 partes:
- cromóforo; responsable de dar color.
- auxocromo; responsable de dar la carga química. Actúa de puente entre la estructura celular y el cromóforo.
- Tipos de colorantes: - básicos/catiónicos (+); el auxocromo es un catión. Se unen a estructuras con carga -. Son más eficaces a pH neutro o básico. [azul de metileno, safranina, cristal violeta, verde malaquita].
- ácidos/aniónicos (-); el auxocromo es un anión. Se unen a estructuras con carga +. Son más eficaces a pH ácido. [eosina, nigrosina].
- liposolubles; se combinan con lípidos. [negro sudán].
La carga neta externa de la célula es negativa, por ello, los microorganismos se tiñen mejor con colorantes básicos. Los colorantes aniónicos tiñen mejor el medio.
Tinciones simples, diferenciales y específicas Al teñir una célula se producen reacciones de intercambio iónico. Existen 3 tipos de tinciones:
- Tinción simple: destaca la forma del microorganismo y las colonias. Utilizan 1 solo colorante y tiñe por igual a toda la bacteria. Los más utilizados son el azul de metileno , cristal violeta y carbolfucsina.
- Tinción diferencial: emplean siempre más de 1 colorante, y las células se tiñen de manera diferente dependiendo del tipo de microorganismo. Permite observar y establecer diferencias entre los microorganismos dependiendo de sus propiedades de tinción. Ejemplo: tinción de Gram (poder diagnóstico y taxonómico. Se usa como criterio de clasificación.), tinción de ácido alcohol resistente (Ziehl Neelsen).
F 0 E 0TINCIÓN DE GRAM: es el método de tinción más ampliamente utilizado en bacteriología. Se trata de un método de tinción diferencial que divide a las bacterias en dos clases: Gram+ y Gram-. Se basa en la naturaleza de la pared celular.
En el primer paso de esta tinción, el frotis se tiñe con cristal de violeta durante 2 minutos. Se tira el exceso y se aplica una solución yodoyodurada o Lugol-Yodo (actúa como mordiente; intensifica la tinción) durante 1 minuto, se tira el exceso y se decolora el frotis lavándolo con etanol o acetona. Este paso produce el aspecto diferencial de la tinción de Gram. Finalmente, el frotis se tiñe de nuevo con safranina, se aclara con H₂O y se seca. Al darle cristal de violeta ( CV ) se forman complejos de este tinte en el interior de las células. Luego el Lugol-Yodo hace que se fije más la unión del CV con la célula, formando un complejo llamado CV-I, que es más insoluble en H₂O y en alcohol. Las células se decoloran dependiendo de su porosidad. En unos casos se extrae CV-I y en otros no. La decoloración de contraste ( safranina ) se utiliza para células a las que se ha extraído CV-I.
Gram- Gram+
Cv y Lugol-Yodo Aclarar con etanol-acetona Safranina y aclarado
Se distinguen 2 tipos de células: - Gram positivas: violetas (primer colorante).
- Gram negativas: rosas o rojas (segundo colorante).
F 0 E 0TINCIÓN ÁCIDO ALCOHOL RESISTENTE: es otro método importante de tinción diferencial. Hay algunas bacterias difíciles de teñir, pero que una vez teñidas es difícil decolorarlas. Se trata de teñirlas con un tratamiento más fuerte: calentando una mezcla de fucsina básica y fenol ( método de Ziehl-Neelsen ). Una vez que la fucsina básica ha penetrado en la célula con la ayuda del calor y el fenol, las células ácido-alcohol resistentes no se decoloran fácilmente con una solución acidoalcohólica, permaneciendo de color rojo.
Se diferencian 2 tipos de células: - Ziehl-Neelsen positivas: moradas, no se decoloran
- Ziehl-Neelsen negativas: azules, se decoloran. Todas las ZN+ son Gram+, pero no todas las Gram+ son ZN+.
- Tinciones específicas o selectivas: tiñen partes específicas de las células: - flagelos. - paredes celulares: tinción de Wirtz para bacterias esporuladas.
F 0 E 0TINCIÓN DE FLAGELOS: el flagelo se engrosa y después se añade un colorante. El método Leifsen Gray utiliza fucsina básica.
F 0 E 0TINCIÓN DE ENDOSPORAS: Bacillus forma esporas en el interior. La posición de la endospora nos da el taxón al que pertenece. Wirtz; difícil de teñir y decolorar. Se tiñe con verde malaquita usando calor. Se lava la preparación y se añade safranina para que se tiña el resto de la célula. Las endosporas quedan verdes, y la célula rosa.
***Tinción negativa (para cápsulas): no son verdaderamente tinciones. Se tiñe todo el fondo pero no la bacteria. Ejemplo: tinción de Fleming , consistente en utilizar tinta china que se añade al medio haciéndolo opaco a la luz y no penetra en las bacterias. Mezclan las bacterias con tinta china o partículas de colorante (microsina).
Existen microorganismos que al aplicárseles tinciones mueren por toxicidad. Para observar organismos vivos a veces hay que utilizar las tinciones negativas o indirectas.
Una determinada tinción simple o directa es el azul de metileno o de Loeffler , que es también una tinción específica o selectiva. Hay unos componentes en procariotas que son los corpúsculos metacromáticos o gránulos de volutina o polifosfatos. Si hacemos que el azul de metileno entre dentro de las células, nos marcará en determinados puntos de la célula los acúmulos de polifosfatos. Una tinción simple se utiliza como específica en este caso.***
MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA
Se emplea haces de e⁻ que actúan como un rayo de luz o fuente de radiación que puede enfocarse al igual que la luz de un microscopio óptico. Lo que observamos no es la imagen directa sino una fotografía, que puede ser aumentada. Esta microscopía presenta mayor poder de resolución en cuanto a capacidad de nitidez, lo que permite estudiar con mayor detalle la morfología microbiana.
ASPECTO MO ME
Aumento práctico mayor 1000-1500 > 100000 Resolución máxima 0,2μm 0,05nm hasta 0, Fuente de radiación luz visible haces de e⁻
Lentes de vidrio
electromagnéticas colocadas simétricamente respecto al eje axial que enfoca el haz de e⁻, a través de un tubo en el que se ha hecho vacío, sobre la muestra (una sección ultrafina). Fuente de contraste absorción de luz diferencial dispersión de e⁻ Medio de desplazamiento aire alto vacío
Montaje de la muestra portaobjetos
rejillas metálicas. Tratamiento previo de las muestras: fijación, deshidratación, inclusión con resina (polimerización), corte con ultramicrotomo (0,1-0,5nm), aumento de contraste con metales pesados y montaje sobre rejillas de Cu.
- Microscopio electrónico de transmisión: es un microscopio óptico invertido. El haz de e⁻, procedente de un filamento de tungsteno calentado se enfoca sobre la muestra con el condensador. Como los e⁻ no pueden atravesar una lente de vidrio, se emplean electroimanes para concentrar ese chorro de e⁻ sobre la muestra. La columna que contiene las lentes y la muestra deben estar en condiciones de vacío para obtener una imagen clara porque los e⁻ se desvían al chocar con las moléculas de aire. La muestra dispersa los e⁻ que pasan a su través, y
