Aislamiento de peroxisomas, Apuntes de Biología

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PRÁCTICA 5.

Aislamiento de

peroxisomas.

PRÁCTICA DE BIOLOGÍA. GRADO EN QUÍMICA

ELOISA DE LOS ÁNGELES GALAN GARCIA

Aislamiento de peroxisomas.

Nombre: Eloísa de los Ángeles Galán García. Curso: 1 Química

Objetivo:

El objetivo de esta práctica es el aislamiento de peroxisomas de hígado, que se va a llevar a cabo, en función del homogenado del hígado por centrifugación diferencial, todo ello para comprobar que el aislamiento que se ha realizado determinará la actividad de la enzima (catalasa), que se encuentran en los orgánulos. Por otro lado, también así poder entender porqué se utiliza el peróxido de hidrogeno como desinfectante y el uso de la catalasa en alimentos como antioxidante.

Introducción:

La centrifugación diferencial es una muy utilizada para el aislamiento de diferentes componentes celulares, como membranas. Se basa en las diferencias de forma y densidad que presentan los distintos componentes Para la de esta se parte de un homogéneo celular que se centrifuga, de manera secuencial, a diferentes velocidades y tiempos, fraccionando los diferentes componentes celulares. La fuerza se puede calcular mediante la siguiente ecuación: R.C. F=1,119x10-5(rpm)^2 r donde rpm indica las revoluciones por minuto del rotor y r es la distancia (en cm) de la desde el eje de El radio usado es la distancia desde el centro del eje de al medio del tubo de Las fuerzas creadas a baja velocidad son (600 x g) y precipitan largas o densas (por ejemplo. enteras, nucleicos, restos de gran A altas velocidades, en que las fuerzas creadas pueden ser bastante grandes x g), precipitan y solamente las muy altamente solubles. En el siguiente esquema (figura 1) se puede observar un proceso de centrifugación diferencial:

Se decanta el sobrenadante en otro tubo Falcón se pipetea 1 ml en el eppendorf y se marca como S2, se le añade 5 ml de tampón y se vuelve a coger 1 ml y se agrega a otro tubo que se va a marcar como P2. En último lugar se centrifuga el sobrenadante durante 20 minutos a 12000 rpm y cuando esta centrifugación finaliza el sobrenadante se decanta. Se pipetea 1 ml en otro tubo el cual se va a macar como S3; se le añade 5 ml de tampón al precipitado y se toma 1 ml para colocarlo a un eppendorf y llamarlo P3. Resultados: ∆ bs (t=0) ∆ bs (t=30’’) ∆ bs ∆ bs 30 ∆ ∆ bs ∆ E H 0,908 1, HB 0,828 X S 1 0,499 0, S1B 0,425 X S 2 1,425 1, S2B 1,252 X S 3 0,673 0, S3B 0,614 X P 1 2,241 2, P1B 2,420 X P 2 0,714 0, P2B 0,461 X P 3 0,633 0, P3B 0,364 X Según la ley de Lambert-Beer: ∆A= Ɛ∙c∙----------> Ɛ = coeficiente de extinción molar ( 43,6 M-1∙ cm-1) --------------------->c= concentración --------------------->l=paso de la luz Por lo cual su actividad enzimática va a ser: C(AE)= (|∆ABS|/(∆t∙Ɛ∙l))∙(Vf/Vm)∙FD∙10- FD= Vf Vm en los factores que no se diluyen va a ser el valor 1, Muestra H (|∆ABS|= ∆ABSF- ∆ABSI =1,236-0,908 = 0,328 nm

∆t = ∆tF - ∆tI = 30-0=30 segundos C(AE)= (|0,328|/(30∙43,6∙l))∙(2,5/1)∙5∙10-3^ = 3,13.10- FD= Vf Vm

1 ml 0,2 ml

Muestra S (|∆ABS|= ∆ABSF- ∆ABSI =0,277-0,499 = -0, C(AE)= (|0,114|/(30∙43,6∙l))∙(2,5/1)∙5∙10-3^ = 2,12.10- FD= Vf Vm

1 ml 0,2 ml

Muestra P (|∆ABS|= ∆ABSF- ∆ABSI = 2,105-2,241= -0,136 nm ∆t = ∆tF - ∆tI = 30-0=30 Segundo C(AE)= (|0,136|/(30∙43,6∙l))∙(2,5/1)∙5∙10-3= 1,3∙10- FD= Vf Vm

1 ml 0,2 ml

Muestra S (|∆ABS|= ∆ABSF- ∆ABSI =1,344-1,425= -0,081 nm ∆t = ∆tF - ∆tI = 30-0=30 Segundo C(AE)= (|0,081|/(30∙43,6∙l))∙(2,5/1)∙1∙10-3= 1,55∙10- Muestra P (|∆ABS|= ∆ABSF- ∆ABSI = 0,617-0,714= -0,097nm ∆t = ∆tF - ∆tI = 30-0=30 segundos C(AE)= (|0,097|/(30∙43,6∙l))∙(2,5/1)∙5∙10-3= 9,27∙10- FD= Vf Vm

1 ml 0,2 ml

Muestra S (|∆ABS|= ∆ABSF- ∆ABSI = 0,0622- 0,673= 0,051 nm ∆t = ∆tF - ∆tI = 30-0=30 segundos C(AE)= (|0,051|/(30∙43,6∙l))∙(2,5/1)∙1∙10-3= 9,74∙10- Muestra P (|∆ABS|= ∆ABSF- ∆ABSI = 0,471-0,633= 0,162 nm

pipetear 2,4 ml de tampón fosfato y 0,1 ml de la muestra que se tiene en el eppendorf de H. Este proceso se repetirá con cada uno de ellos, se tiene que tener en cuenta que a los que se le llaman B van a ser el blanco de cada muestra. Luego se tendrá que ir a medir la absorbancia de cada uno de ellos al espectrofotómetro de 240 nm, se tiene que colocar el blanco en la cubeta, cerrarlo y medir su absorbancia en el t=0. A continuación se va a colocar la muestra en la cubeta, se va a añadir 0,5 ml de peróxido de hidrogeno, se lee la absorbancia en t=0 y luego se espera 30 segundos para volver a leer la absorbancia de cada uno de ellos. La muestra en blanco solo se mide una vez en el t=0 s ya que va a ser la misma después de 30 segundos. Se repite el mismo proceso para todos los tubos de ensayo que contiene cada muestra.

Resultados:

1-Explicar las características y función de los peroxisomas. ¿Están en todas las células? Características: Los peroxisomas se caracterizan por su capacidad de cambiar de tamaño y formar nuevos peroxisomas mediante división. También otra característica curiosa e importante es que Gran parte de lo que hay en su interior, en especial las proteínas y enzimas, son sintetizadas en el citosol de la célula a la que pertenecen por medio de ribosomas libres, que son complejos proteicos capaces de mediar la traducción de ARN mensajeros (ARNm) provenientes del núcleo y derivados de la transcripción de un gen determinado. Los peroxisomas cambian de enzimas para cumplir con las funciones metabólicas necesarias de cada célula dependiendo de la función de la célula, siendo una de las más comunes la catalasa. Otra característica muy importante es que no poseen genoma propio, es decir, en su interior no hay ADN ni la maquinaria necesaria para su procesamiento (p,ej:replicación, transcripción y traducción). Funciones: Llevan a cabo reacciones oxidativas de degradación de ácidos grasos y aminoácidos generando H 2 O 2 estas reacciones no proporciona la célula energía útil en forma de ATP pero producen calor que en ocasiones tiene importancia fisiológica. una de las funciones más importantes para los seres vivos, es que intervienen en reacciones de detoxificación, es decir, los grandes peroxisomas de las células hepáticas y renales detoxifican (neutralización y la eliminación de toxinas) diversas moléculas que entran en circulación Por ejemplo casi la mitad del etanol que bebemos es oxidado a acetaldehído por acción de la catalasa.

Son orgánulos citoplasmáticos muy comunes en forma de vesículas, con una sola membrana, y se encuentran en la mayoría de las células eucariotas. 2-La técnica de centrifugación diferencial se puede utilizar para el cálculo de pesos moleculares. Razona la respuesta. No se puede ya que es un método el cual se pueden separar solidos de líquidos de diferente densidad, en todo caso sirve para hacer un aproximamiento, pero no nos vale para saber exactamente los pesos moleculares. 3-Explica los resultados obtenidos. ¿Qué fracción está enriquecida en peroxisomas?

Conclusión

Como se ha podido observar en la práctica, la temperatura es un factor determinante en las reacciones enzimáticas porque acelera o retarda la acción de las enzimas, lo que se evidencia al producirse el burbujeo. La catalasa al igual que las demás enzimas, para que puedan trabajar oportunamente deben encontrase en un pH neutro y a temperatura ambiente.

Bibliografía

Alonso de León, Milagros T.; Garay Durba, Magalys, autor.; Izquierdo Pérez, Nelson, autor.; Cancino Gutiérrez, Adrián E, editor.; Torricella Morales, Raul G, corrector. La Habana: Editorial Universitaria, 2009 Sánchez González, Dolores Javier.; e-libro, Corp.; Trejo Bahena, Nayeli Isabel. México D.F.: Editorial Alfil, 2006 Gupta, Dharmendra K. editor.; Palma, José M. editor.; Corpas, Francisco J. editor 1st ed. 2016., Cham: Springer International Publishing : Imprint: Springer,