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UNIVERSIDAD PRIVADA SAN JUAN BAUTISTA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
TEMA: LOS ANTICUERPOS ANTINUCLEARES POR INMUNOFLUORESCENCIA
INDIRECTA
DOCENTE: HERNÁNDEZ APARCANA, NOELIA MELIZA
TRABAJO MONOGRÁFICO PRESENTADO POR:
APARCANA VELARDE, ANDREA NICOLE
BAUTISTA ORMEÑO, VALERIA LORENA
CALLE ESPINOZA, MARÍA FERNANDA
CABRERA MENDOZA, PAUL ALEXANDER
CANDIA LOPEZ, JOEL FERNANDO
CURSO: INMUNOLOGÍA
CICLO: IV
ICA - PERÚ
2022 - II
ÍNDICE
- INTRODUCCIÓN ……………………………………………………………………………....…….
- CAPÍTULO I: MARCO TEÓRICO ……………………………………………….………….…..…
- 1.1. DEFINICIÓN DE ANA y ENA ……………………………………………………...….
- 1.2. CLASIFICACIÓN DE ANA ……………………………………………………………
- 1.3. TÉCNICAS UTILIZADAS PARA SU DETENCIÓN ……………..…….……………
- 1.4. APLICACIONES …………………………………………………………………..……
- 1.5. PATRONES DE ANA DETECTADOS MEDIANTE IF ……………………….…….
- 1.6. REACTIVOS …………………………………………………………………...………..
- 1.7. PROCEDIMIENTO ……………………………………………………………….…….
- 1.8. LIMITACIONES DE LA TÉCNICA ……………………………………………….….
- 1.9. RESULTADO E INTERPRETACIÓN ANA HEP-IF ……………………………..…
- II. CONCLUSIONES ……………………………….………………………………..………....……
- III. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ………………………………………...………….........
CAPÍTULO I: MARCO TEÓRICO
1.1. DEFINICIÓN DE ANA
La prueba de anticuerpos antinucleares es un análisis de sangre que busca detectar anticuerpos antinucleares en la sangre. Los anticuerpos son proteínas que el sistema inmunitario produce para combatir sustancias extrañas, como virus y bacterias. Pero un anticuerpo antinuclear ataca a las propias células sanas. Se llama "antinuclear" porque se dirige al núcleo (centro) de las células. La prueba de los ANA permite diagnosticar enfermedades autoinmunes y descartar otros procesos que tengan signos y síntomas similares. Estos anticuerpos están presentes en casi todos los pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES), y en proporción variable en pacientes con otras enfermedades autoinmunes. Además, es posible que aparezcan en bajas concentraciones en muchas otras enfermedades, o incluso en personas sanas. Es normal tener algunos anticuerpos antinucleares en la sangre. Pero tener muchos puede ser una señal de un trastorno autoinmune. Si tiene un trastorno autoinmune, su sistema inmunitario ataca sus células y tejidos por error. Estas enfermedades pueden causar problemas de salud graves. 1.2. CLASIFICACIÓN DE ANA En circulación pueden estar presentes tres tipos de ANA
- ANA NATURAL: Por ello, es importante establecer valores de referencia ajustados a las poblaciones étnicas que los van a usar como referencia. En un trabajo realizado en el 2005 mostramos la importancia de establecer los valores normales de ANA tomando en cuenta el grupo étnico, el patrón observado y los títulos de los anticuerpos
- ANA INFECCIOSO: Son los que se producen como resultado de procesos infecciosos. En este sentido, los ANA cuyo origen son los procesos infecciosos no se asocian a manifestaciones clı´nicas de enfermedad autoinmune y sus títulos bajan en cuanto se resuelve el proceso infeccioso que les dio origen
- ANA AUTOINMUNES: los cuales reflejan la pérdida de la tolerancia inmunológica y su origen es multifactorial. Su producción depende de carga genética, medio ambiente, cambios hormonales, etc. Estos últimos reflejan la pérdida de la tolerancia inmunológica y su origen es multifactorial, su producción depende de la carga genética, del medio ambiente y de cambios hormonales 1.3. TÉCNICAS UTILIZADAS PARA SU DETENCIÓN Para la identificación de los anticuerpos antinucleares (ANA) por inmunofluorescencia, se emplea una técnica indirecta mediante anticuerpos fluorescentes. Los anticuerpos antinucleares del suero de los pacientes se van a unir a los antígenos correspondientes presentes en las células de cultivo neoplásicas inmortalizadas HEp-2. Una vez unidos, después de un lavado, se incuban con anticuerpos contra las inmunoglobulinas humanas conjugadas con fluoresceína, se lava las proteínas no unidas y se visualizan
por microscopía de fluorescencia. Este método, está diseñado para poder detectar la presencia de ANA en el suero humano o de los animales. Por lo tanto, para poder entender se describirá esta técnica suponiendo que se está investigando Lupus eritematoso sistemático (LES) en un humano. Esta técnica sucederá en dos pasos:
- En primer lugar, en la incubación de la muestra, se aplica suero diluido a las células de la línea Hep-2. Todos los ANA presentes en la muestra a evaluar, se pueden unir al sustrato celular y formar un complejo antígeno-anticuerpo. Otros componentes del suero que no son específicos a los antígenos presentes en la célula, se eliminarán posteriormente mediante lavado.
- El siguiente paso, es la incubación del conjugado. Para ello, la anti-inmunoglobulina es marcada con isotiocianato de fluoresceína (Anti-IgG-FITC). En esta etapa, el Anti-IgG-FITC interacciona con los ANAs, si están presentes. Esto formará un complejo antígeno-anticuerpo- conjugado. El exceso de conjugado se eliminará mediante lavado. Los resultados del ensayo se pueden visualizar en un microscopio de fluorescencia debidamente equipado. 1.4 APLICACIONES La inmunofluorescencia indirecta para la detección de anticuerpos (IFA) ha sido ampliamente utilizado para detectar la presencia de anticuerpos antinucleares (ANA) en el suero de pacientes que padecen lupus eritematoso sistémico (LES) y otros trastornos del tejido conectivo clínicamente similares. Asimismo, los ANA pueden estar asociados a numerosos síndromes de lupus inducidos por fármacos. Los ANA están compuestos principalmente por anticuerpos IgG; sin embargo, también pueden detectarse ANA compuestos por IgA e IgM. En la actualidad se emplean diferentes fuentes de material nuclear como sustrato, como, cultivo celular de tejido embrionario de animal o humano, pero aún son muy empleados los sustratos de hígado y riñón de ratón, dependiendo de los anticuerpos que se estén investigando. Además, se puede llegar a detectar positividad cuando hay presencia de diferentes anticuerpos, cómo el centrómero, CREST, esclerosis sistémica progresiva. El resultado de la inmunofluorescencia se reporta por medio de patrones en núcleo, nucleolo, citoplasma y aparato mitótico. Por lo tanto, los anticuerpos que nos interesa estudiar se muestran en la Tabla 1. En particular en LES, los patrones que con más frecuencia se encuentran son AC-1, AC-4 y AC-5. Tabla 1. Frecuencia de anticuerpos antinucleares específicos en diferentes enfermedades
1.6. REACTIVOS
Cuando se utilizan reactivos comerciales (kits) contiene suficiente para hacer número de pruebas indicadas en la etiqueta caja de carga. Conjugado y control contienen biocida combinado como Proclin (0,05% v/v) y azida de sodio (<0,1% p/v) como conservadores.
- Portaobjetos con sustrato de HEp-2 para ANA: portaobjetos de 12 pocillos con secante
absorbente y bolsa desecante.
- Control positivo (suero humano): producción tinción homogénea positiva de núcleos celulares, Manzana verde. Un vial de 0,5 ml, tapa roja.
- Control negativo (suero humano): no se producirán trazas nucleares detectables. Un vial de 0, ml,tapa verde.
- Diluyente: dos botellas de 30 ml con tapón. verde contiene solución salina tamponada con fosfato.
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS) contiene NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 8 mM Na2HPO4 y KH2PO4 2 mM): pH 7,2 ± 0,2. Para preparar PBS, volcar el contenido un paquete de PBS por litro de agua destilada, o desionizado Revuelva hasta que se disuelva toda la sal. completamente disuelto. cuatro paquetes, suficiente para preparar 4 litros. lo sé se puede tapar y almacenar a 2-25ºC durante aproximadamente hasta 4 semanas.
- Medio de montaje (Glicerol tamponado): Dos viales con punta de gotero de 3.0 mL, de tapa
blanca.
Materiales adicionales
- Pipetas Pasteur, serológicas pequeñas capilares o automáticas.
- Puntas de pipetas descartables.
- Tubos de ensayo pequeños, de 13 x 100 mm o similares.
- Gradillas para tubos de ensayo.
- Placa de tinción ideal para lavar los portaobjetos entre pasos de incubación.
- Cubreobjetos, de 24 x 60 mm, grosor N.º 1.
- Agua destilada o desionizada.
- Microscopio de fluorescencia.
- Bureta graduada de 1 litro.
- Cronómetro de laboratorio.
- Lavabo de eliminación y desinfectante (10 % de lejía doméstica - 0,5 % de hipoclorito de sodio).
1.7. PROCEDIMIENTO
- Quitar diapositivas de su lugar mantener frío y dejar caliente a temperatura ambiente (20 - 25°C).
- Abra el sobre protector y retire los portaobjetos. Sin presión en los aviones a través del defensor.
- Identificar cada pocillo con el suero del paciente y los controles adecuados.
- Preparar una dilución 1:40 (10 μL de suero + 390 μL de diluyente o PBS), 1:80, 1:160, 1:320, etc de cada suero de paciente. a) Se pueden preparar diluciones de muestra inicial utilizando diluyente. b) Los controles positivos se pueden titular hasta aprox. punto final para usar como control semicuantitativo (1 min de reacción). En tales casos, el control debe diluirse dos veces en diluyente o PBS. Probablemente configurar el punto final de propagación e imprimir vial de control positivo (± uno solución). c) Durante la titulación de la muestra del paciente La predilución debe prepararse en diluyente o PBS y todos los diluyentes los siguientes se deben preparar en diluyente o Especialmente PBS.
5. Con un dispensador adecuado, poner de 20 a 40 μL de cada control y cada suero de paciente
diluido en los pocillos correspondientes.
- Incubar los portaobjetos a temperatura ambiente (20 - 25° C) durante 20 - 30 minutos.
- Enjuagar con delicadeza los portaobjetos con PBS.No dirigir un chorro de PBS hacia el interior de los pocillos de prueba.
- Enjuague los portaobjetos en intervalos de 2 a 5 minutos, cambie el PBS entre lavados. los portaobjetos se pueden remojar cada lavado durante cinco minutos.
- Elimine cada diapositiva de PBS. Correderas inversas y ranuras para llaves Se suministra con agujeros para papeles. seco mover pasando a través de tela absorbente trasero.
10. Agregar de 20 a 40 μL de conjugado en cada pocillo, hasta que lo cubra completamente y
ponerlo inmediatamente en la cámara de incubación.
- Repetir los pasos 6 a 8
- Aplique de 3 a 5 gotas de medios de instalación en cada portaobjetos, cierre con cuidado y evitar la formación de burbujas de aire, baje con cuidado la tapa de un lado a otro del tobogán.
13. Examine los portaobjetos inmediatamente con un microscopio de fluorescencia adecuado. Si
no puede ver la diapositiva se puede guardar inmediatamente hasta 48 horas a temperatura de 2 a 8°C. 1.8. LIMITACIONES DE LA TÉCNICA
- Es una herramienta para el diagnóstico de laboratorio, sin embargo, no es la única prueba diagnóstica. Se puede realizar determinación de Anticuerpos anti-Smith, anti-centrómero, anti-
- Patrón AC- 19 Se asocia con los antígenos: PL-7, PL-12, proteína P ribosomal. Patologías asociadas: Síndrome anti-sintetasa, Polimiositis/Dermatomiositis (PM/DM), Lupus eritematoso sistémico juvenil y neuropsiquiátrico. II. CONCLUSIONES
- La determinación de anticuerpos antinucleares (ANA) mediante inmunofluorescencia indirecta (IFI) es la principal prueba de tamizado inicial cuando se sospecha de enfermedades autoinmunes. Sin embargo, la presencia de ANA puede no ser necesariamente de origen autoinmune ya que pueden ser naturales o infecciosas.
- Los patrones de inmunofluorescencia indirecta de los anticuerpos antinucleares no son específicos para una enfermedad determinada, por lo que se requiere complementar estas pruebas con las de autoanticuerpos antinucleares específicos, guiándose siempre del contexto clínico. III. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- Amparo, O. V., Fernando, S. T. L., Carmiña, G. R., & Lilia, S. G.https://cobico.com.ar/wp- content/archivos/2019/05/Trabajo-Bioq.-Clarisa-Pascual-para-publicar.pdf
- Caibedes J. Ñúnez Álvarez C. Anticuerpos antinucleares. Reumatol clin. [en línea] 2010; 6(4): 224 - 230. Disponible en: https://www.reumatologiaclinica.org/es-anticuerpos-antinucleares- articulo-S1699258X
- Javier Zepeda C. Anticuerpos antinucleares de una familia diversa. Rev med Hond [en línea] 2002; 70: 189-193. Disponible en: http://www.bvs.hn/RMH/pdf/2002/pdf/Vol70- 4 - 2002 - 8.pdf
- Pérez-Campos M. L Pérez-Campos E. Hernández-Huerta M. T. Pérez-Campos M. E. Matias- Cervantes C. A. Anticuerpos antinucleares por inmunofluorescencia indirecta. Mens. Bioquim. 2022; 46: 58-66.
- Sistema de prueba ANA HEp-2. zeus scientific. [en línea]; 2019. Disponible en: https://www.zeusscientific.com/content/resources/FA2400%2520IFA%2520ANA%2520HEp
- 2%2520Spanish%2520Package%2520Insert.pdf
