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FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA Y MALOLÁCTICA
INTRODUCCIÓN
Sin microorganismos no hay vino ya que son los responsables de la transformación del
mosto de la uva en vino. En concreto son las levaduras las que por medio de un
proceso bioquímico denominado fermentación alcohólica (F.A.) transforman los
azúcares del mosto de la uva en etanol, CO 2
y otros compuestos químicos y con ello
el mosto en vino.
Desde principios del siglo XX se sabe que en la elaboración de algunos vinos pueden
intervenir, además de las levaduras, otros microorganismos cuya misión es
transformar el ácido málico del vino en ácido láctico. Esta transformación, que es
denominada fermentación maloláctica (F.M.L.) y que es llevada a cabo por diversas
especies de bacterias lácticas, es considerada una fermentación de suavización
del vino que conviene a todos los vinos tintos y a aquellos vinos blancos cuyo contenido
en ácido málico sea muy elevado (Bravo, F., 1995; Herrero y García, 1997).
Actualmente sabemos que, si bien los agentes causantes de la transformación del
zumo de la uva en vino son microorganismos, que consideramos por ello
beneficiosos, también existen microorganismos que causan alteraciones en el vino
y que consideramos por ello perjudiciales (Biol et al. , 1992; Suárez e Iñigo, 1 992;
Bourgeois y Larpent, 1995). Los microorganismos relacionados con el vino pueden
ser distribuidos en 4 grupos (Suárez e Iñigo, 1992):
- Las levaduras, que son las encargadas de realizar la F.A
- Las bacterias lácticas, que llevan a cabo la F.M.L.
- Las bacterias acéticas, que junto con algunas levaduras y algunas bacterias
lácticas son causantes de alteraciones en los vinos
- Los mohos, algunas de cuyas especies pueden desarrollarse sobre la uva y
en las vides causando mermas importantes en la cantidad y en la calidad de la
uva.
2 - LAS LEVADURAS
2.1 CARACTERÍSTICAS GENERALES
Son hongos unicelulares pertenecientes en su mayor parte al grupo de los
Ascomicetos, es decir, al grupo de hongos capaces de formar esporas contenidas en
el interior de un asca.
Se hallan diseminadas por toda la naturaleza. Llegan a la uva por el viento y los
insectos siendo retenidas en la pruina, una sustancia cérea que recubre la piel de la
uva. De ahí pasan al mosto cuando se rompe el grano de uva en las operaciones
enológicas de estrujado y prensado.
Vistas al microscopio las distintas especies presentan formas muy variadas. Las hay
elípticas (con forma de huevo) como las especies del género Saccharomyces;
esféricas como Torula; alargadas como Torulopsis stellata y apiculadas (con forma de
limón) como Hanseniaspora (Peynaud, 1989). Su morfología es uno de los caracteres
utilizados en su clasificación, como también lo son entre otros su forma de
reproducción y sus características bioquímicas (Barnett et al., 1990; Navarre, 1994; De
Rosa, 1997).
Su reproducción puede ser vegetativa (asexual) por gemación generalmente o por
escisión. Cuando las condiciones son adversas la mayor parte de las levaduras
pueden reproducirse sexualmente generando ascosporas.
Entre las diversas características bioquímicas utilizadas en la clasificación de las
levaduras podemos citar (Quesada y Cenis, 1995; Suárez, 1997):
- El tipo de azúcares que pueden fermentar
- El rendimiento en alcohol, las hay que para producir 1 grado de alcohol
consumen de 17 a 18 g de azúcar, otras en cambio con menor rendimiento
metabolizan de 21 a 22 g.
- Su poder alcohológeno, o grado máximo de alcohol que pueden alcanzar,
algunas detienen su actividad a los 5% Vol mientras que otras llegan a 17 o
18% Vol.
- Productos secundarios de la fermentación
- Resistencia al anhidrido sulfuroso
- Capacidad para asimilar diferentes sustancias nitrogenadas
2. 2 CLASIFICACIÓN DE LAS LEVADURAS
La clasificación de las levaduras es compleja y complicada, aunque el desarrollo de
nuevas técnicas clasificatorias basadas en la Biología Molecular, particularmente en el
análisis de secuencias de ADN, ha permitido separar o reagrupar las especies
(Quesada y Cenis, 1995).
Las levaduras pertenecen al Reino Fungi y dentro de él a la división Eumicota que
agrupa a los denominados hongos verdaderos. Dentro de esta división las levaduras
se incluyen en 2 de las 5 subdivisiones de los Eumicetos (Tabla 1), la Ascomycotina
representada por las levaduras capaces de producir ascosporas, llamadas por ello
esporógenas, y la Deuteromycotina representada por las levaduras incapaces de
formar esporas llamadas por ello asporógenas o no esporógenas. Los géneros de
levaduras esporógenas, englobados todos ellos en la familia Saccharomycetaceae, se
distribuyen en 3 subfamilias. Los de las levaduras no esporógenas constituyen la
familia Cryptococcaceae. Conviene aclarar que los Deuteromicetos constituyen en
realidad un "cajón de sastre" en el que se incluyen levaduras haploides que tienen su
correspondiente fase diploide clasificada en los Ascomicetos. Así por ejemplo la
especie Kloeckera apiculata es la fase imperfecta (o haploide) de la especie
Hanseniaspora uvarum. Por lo tanto, ambas especies son la misma. Asimismo,
conviene reseñar que por debajo de los taxones género y especie las levaduras
pueden ser clasificadas en subespecies y variedades que a menudo adquieren el
rango de especies tras nuevas revisiones taxonómicas, o, por el contrario, varias
especies son unificadas en una sola como subespecies de la misma con lo que la
clasificación se complica aún más y se incrementa el número de sinonimias.
- Torulaspora rosei (S. rosei) tiene un poder alcohológeno de 8 a 14º y su
principal característica es su capacidad para fermentar lentamente los
azúcares con lo que los niveles de acidez volátil producidos son menores.
Entre las levaduras asporógenas, generalmente de primera fase, que se caracterizan
por aparecer al principio de la F.A. y producir gran cantidad de compuestos
secundarios enriquecedores del sabor y aroma del vino, destacan:
- Kloeckera apiculata, es la forma imperfecta o haploide de Hanseniaspora
uvarum. Junto con S. cerevisiae es la levadura más frecuentemente
encontrada en los mostos. Su poder alcohológeno es muy bajo (4-5º) y también
lo es su rendimiento en alcohol (21 a 22 g de azúcar/1º de alcohol). Produce
mucha acidez volátil por lo que no es deseable en las fermentaciones. Se la
elimina fácilmente con el sulfitado dada su baja resistencia al SO 2.
- Candida stellata (Torulopsis stellata, T. bacillaris) tiene un poder alcohológeno
de 10 a 11º y se caracteriza fundamentalmente por aparecer con más
frecuencia en mostos de uvas atacadas de podredumbre
2. 4 UTILIZACIÓN DE LAS LEVADURAS EN VINIFICACIÓN
La fermentación del mosto suele desencadenarse de forma natural y espontánea a
partir de las propias levaduras presentes en el mosto, a este tipo de fermentación se le
denomina fermentación espontánea. Se caracteriza porque en el ranscurso de la
misma intervienen varias especies de levaduras, algunas de las cuales coexisten en el
tiempo y otras se suceden secuencialmente en función de su poder alcohológeno. En
la sucesión de especies primero suelen intervenir las levaduras de primera fase
generalmente asporógenas y luego las de segunda fase en su mayoría esporógenas,
de modo que S. cerevisiae domina durante la mayor parte del tiempo, pudiendo ser
desplazado al final por S. bayanus.
En ocasiones la conjunción de un sulfitado excesivo y bajas temperaturas retardan el
inicio de la fermentación. En estos casos, y en aquellos en los que el enólogo desea
conducir la F.A. con un tipo concreto de levaduras, se recurre a la adición de levaduras
al mosto. Se pueden emplear o bien levaduras autóctonas, preparando lo que se ha
dado en llamar un pie de cuba, o bien levaduras comerciales. En el primer caso se
parte de una fracción pequeña de la propia vendimia, las uvas más sanas, cuyo mosto
se deja fermentar espontáneamente. Cuando la fracción está en plena fermentación
puede ser utilizada como inóculo para el resto del mosto. En el segundo caso se suele
recurrir al empleo de las denominadas levaduras secas activas (LSA). Bajo el aspecto
de polvos secos, que a menudo deben ser rehidratados en agua tibia antes de su
utilización, las LSA son levaduras deshidratadas generalmente pertenecientes a las
especies S. cerevisiae y S. bayanus.
1 - LA FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
Podemos definir la F.A. como el proceso bioquímico por el cual las levaduras
transforman los azúcares del mosto en etanol y CO 2 (Zambonelli, 1988; Navarre,
1994). Para que la F.A. tenga lugar, el mosto ha de hallarse en condiciones de
limitación de oxígeno.
En condiciones de aerobiosis las levaduras se multiplican abundantemente con un
rendimiento en biomasa muy alto ya que se consigue 1 g de levadura por cada 4 g de
azúcares consumidos.
En anaerobiosis las levaduras realizan la F.A., es decir degradan los azúcares de
forma incompleta generando etanol, CO 2 y energía. En estas condiciones el
rendimiento en biomasa es de tan sólo 1 g de levadura por cada 100 g de azúcares
consumidos.
3.1 MECANISMO BIOQUÍMICO DE LA FA
Figura 1. Bioquímica de la FA
Ácido láctico : Procede de la hidrogenación del pirúvico, aunque puede tener su
origen en intervenciones bacterianas.
Acetoína, diacetilo y 2 - 3 butanodiol.: Son los metabolitos del ciclo diacetilo-
acetoínico. Siempre presentes en el vino, en exceso transmiten sabores lácteos y
amargos no deseables. Tienen su origen en la condensación y descarboxilación de
2 moléculas de ácido pirúvico.
Otros compuestos: Con origen en los azúcares se forman diversos ácidos
cuantitativamente minoritarios como cítrico, propiónico, fumárico y fórmico. Con
origen en las sustancias nitrogenadas se forman alcoholes superiores como
isoamílico e isopropílico que proceden de la desaminación y descarboxilación de
los aminoácidos. Por combinación entre ácidos y alcoholes se generan ésteres
con fuerte repercusión en el buqué final del vino, siendo el acetato de etilo el que
tiene una repercusión mayor.
3. 3 FACTORES QUE INFLUYEN EN LA FA
Existen diversos factores tanto físicos como químicos que inciden positiva o
negativamente en el transcurso de la F.A., ya sea actuando sobre el desarrollo de las
levaduras, ya sea incidiendo directamente sobre la propia F.A. (Navarre, 1994). Los
más relevantes son los siguientes:
La temperatura: A mayor temperatura la F.A. transcurre más rápidamente, sin
embargo es menos pura. Se produce menos etanol y más cantidad de compuestos
secundarios que a menudo no conllevan mejora de la calidad del vino. Por otro
lado las levaduras tienen en los 30ºC su temperatura óptima de desarrollo. Por
encima de los 35ºC la actividad decrece rápidamente y en torno a los 45ºC mueren.
Por debajo de 10ºC la mayor parte de las levaduras indígenas son inactivas.
El oxígeno: El proceso de fermentación en sí, requiere de oxígeno. En las
condiciones de vinificación, el oxígeno se halla presente en las primeras horas de
fermentación, en la fase exponencial de crecimiento y las levaduras pueden
sintetizar esteroles en concentraciones suficientes como para asegurar su
supervivencia. Pero la presencia de oxígeno justo al final de la multiplicación de las
levaduras, también repercute sobre la formación de esteroles por parte de las
mismas.
Diacetilo
2 Pirúvico Acetoína
2 - 3 Butanodiol
Los esteroles son compuestos químicos que provienen del metabolismo glucídico;
los más importantes de esta familia de compuestos son el ergosterol y el
lanosterol. En función de la temperatura, los esteroles aumentan la fluidez o la
rigidez de dicha membrana.
La cantidad de esteroles (ergosterol+lanosterol) formados en presencia de oxígeno,
son el doble de los que se formarían en su ausencia. Además, el oxígeno favorece la
biosíntesis de lípidos, esteroles y ácidos grasos insaturados, que forman parte de la
composición de la membrana celular, asegurando la integridad de la levadura, así
como su permeabilidad frente al alcohol, por otro lado, favorece la asimilación de los
aminoácidos por la levadura y eso incide positivamente en el desarrollo aromático.
Los nutrientes: Uno de los aspectos más importantes a interpretar de la composición
de la uva es su contenido en nitrógeno amínico y amoniacal. Este parámetro nos da
valiosa información sobre el perfil de vino que podemos obtener y cómo tratar la
población de levaduras.
Las necesidades de las levaduras están directamente relacionadas con la cantidad de
azúcar a fermentar, podemos tomar un valor medio de 0,8 mg de NFA necesario por
cada gramo de azúcar a fermentar.
Debemos saber que no todos los nutrientes tienen el mismo efecto. Los inorgánicos o
sales amoniacales como el DAP son consumidos rápidamente estimulando la
multiplicación celular dando picos de temperatura importantes. Los nutrientes
complejos y orgánicos, además de contener micronutrientes, tienen una asimilación
más lenta ofreciendo una fermentación más regular y completa, aunque requieren más
esfuerzo de incorporación al citoplasma, la levadura los metaboliza más fácilmente.
Para iniciar cualquier FA necesitamos tener más de 150 mg/L de NFA; de lo contrario,
no tendremos una buena multiplicación de la levadura. Si precisamos corregir lo
indicado, son las sales amónicas las adecuadas por tener una incidencia directa sobre
la multiplicación celular.
Deficiencias de NFA (<120 mg N/L) implica fermentaciones lentas que se traducen en
la aparición de moléculas sulfurosas.
Exceso de NFA (>500 mg N/L) implica fermentaciones muy rápidas, con el
consiguiente aumento de temperatura y acidez, y la aparición de aminas biógenas y
carbamato de etilo.
Los compuestos químicos de acción negativa: Por un lado, la acumulación de los
propios productos de la F.A. pueden ralentizarla. Por otro lado, esos mismos
compuestos junto a otros presentes en el mosto de forma natural (taninos) o artificial
(pesticidas, SO 2 , etc.) pueden actuar como inhibidores del crecimiento de las
levaduras.
el ácido tartárico y el glicerol y elevar la acidez volátil causando con ello las
enfermedades del vino que se citan en un apartado posterior, dentro de ellas
predominan los lactobacilos. La F.M.L. suele desencadenarse espontáneamente al
finalizar la F.A. o algún tiempo después cuando las condiciones sean favorables a
las bacterias lácticas (Bravo, 1995). Si la F.M.L. no conviene a un vino puede
impedirse trasegando y sulfitando el vino tras finalizar la F.A. Con ello se evita
además de la F.M.L. los riesgos de enfermedades causadas por las "bacterias
perjudiciales". Si por el contrario se desea que un vino pase la F.M.L. y esta no se
desencadena, pese a ser favorables las condiciones, habrá que adicionar
"bacterias útiles" al vino. Entre las distintas formas de inóculo se citan: a) La
mezcla de estos vinos con otros en plena F.M.L.; b) La utilización de las lías de
vinos que acaben de pasar la F.M.L.; c) La utilización de cultivos puros
comerciales. En este último caso el mercado proporciona diferentes preparados
entre los que se está imponiendo el empleo de cepas de Oenococcus oeni
seleccionadas por su resistencia al bajo pH, al alto grado alcohólico y por su
posibilidad de adición directa al vino sin reactivación previa.
4. 2 - LA FERMENTACION MALOLÁCTICA (F.M.L.)
La fermentación maloláctica es una segunda fermentación que, a no ser que se
impida, la sufren los vinos jóvenes cuando ha terminado o está a punto de terminar
la F.A. (Delfini, 1983; Bravo, 1995). Bioquímicamente es un proceso llevado a cabo
por las bacterias lácticas que consiste en la transformación del ácido málico del
vino en ácido láctico más CO2, de ahí el nombre de maloláctica.
Enológicamente va a tener importantes consecuencias para el vino ya que: a) le va
a dar estabilidad, pues mientras haya ácido málico en un vino éste es inestable; b)
le va a proporcionar un afinamiento del gusto debido a que el ácido málico, más
agresivo, da paso al ácido láctico que es más suave; c) se va a producir una
pérdida de acidez debida a que un diácido se convierte en un monoácido. Esta
pérdida de acidez conlleva cambios importantes en las propiedades organolépticas
del vino, tanto en el color como en el sabor y el aroma. Junto a estos cambios,
considerados positivos y deseables en muchos vinos, se producen otros menos
deseables que conviene controlar, son el incremento de acidez volátil, que se de be
básicamente a la transformación del ácido cítrico en ácido acético por las mismas
bacterias lácticas y la aparición de aminas biógenas, debidas principalmente al
desarrollo de pediococos.
4 .3- FACTORES QUE INFLUYEN EN LA F.M.L
El hecho de que se dé o no F.M.L. en un vino joven depende de una serie de factores
que de forma resumida se detallan a continuación (Peynaud, 1989).
El ciclo bacteriano: El ciclo bacteriano pasa por tres fases. Una primera fase de
multiplicación, que coincide con el inicio del encubado del mosto. En ella las bacterias
se multiplican en paralelo con las levaduras. La producción de etanol y el consumo de
nutrientes por parte de las levaduras paraliza el crecimiento de las bacterias que ven
mermada su población desde aproximadamente 105 a 102 bacterias/ml. Sigue una
segunda fase denominada fase de latencia, en la que las bacterias se van adaptando al
nuevo medio en espera de condiciones más favorables para su desarrollo. Esta fase
puede durar desde unos días o unas semanas hasta varios meses. Cuando las
condiciones son idóneas tiene lugar la tercera fase, en realidad una segunda fase de
multiplicación, en la que influyen notoriamente la temperatura y las levaduras que al
finalizar la F.A. mueren y cuando la población bacteriana alcanza valores de 106
bacterias/ml inician la F.M.L. que culmina en general con el agotamiento del ácido
málico presente en el vino. Finalizada la F.M.L. la población bacteriana vuelve a
decrecer para situarse en valores residuales de 102 bacterias/ml.
El pH: El pH influye en la F.M.L. en dos sentidos. Por un lado, actuando sobre la
multiplicación de las bacterias lácticas ya que éstas tienen su pH óptimo de desarrollo
comprendido entre 4.2 y 4.5. Teniendo en cuenta que el pH de un mosto-vino puede
oscilar entre 2.8 y 3.8, cuanto más bajo sea este mayor será la dificultad para el
desarrollo de las bacterias. Por otro lado, el pH determina el tipo de sustrato que van a
metabolizar las bacterias lácticas. En general a pHs más bajos utilizan ácido málico
aunque haya azúcares residuales en el vino y a pHs más altos suelen utilizar con
preferencia los azúcares.
La temperatura: La F.M.L. presenta su actividad máxima entre 20ºC y 25ºC. A 15ºC y
a 30ºC la F.M.L. es lenta, pero mientras que por encima de 30ºC puede llegar a
pararse por completo, por debajo de 15ºC puede continuar siempre que haya
arrancado a temperaturas mayores. En cualquier caso, la F.M.L. debe realizarse a
18ºC como máximo para evitar que las bacterias lácticas ataquen a otros compuestos
distintos del ácido málico e incrementen con ello la acidez volátil.
La aireación: La aireación es tal vez el factor menos importante ya que entre las
bacterias lácticas hay microaerófilas y anaerobias facultativas, por lo tanto, en general
conviene cierta aireación para favorecer el proceso, pero nunca saturación con
oxígeno ya que retardaría la F.M.L. Suele ser suficiente con el oxígeno captado
durante el descube del vino.
Los nutrientes: Las bacterias lácticas tienen mayor número de requerimientos
nutricionales que las levaduras. De hecho, presentan múltiples auxotrofías tanto entre
los aminoácidos y vitaminas, como entre las bases nitrogenadas, requieren además
sales minerales que contengan manganeso, magnesio y potasio. Los vinos no siempre
contienen suficiente cantidad de estos nutrientes, lo que puede provocar retardo o
incluso ausencia de F.M.L.
El grado alcohólico : Las bacterias lácticas del vino son resistentes al etanol, de
hecho, se desarrollan y sobreviven en el vino, sin embargo, a medida que aumenta el
grado alcohólico se dificulta su crecimiento y con ello la F.M.L. Los cocos suelen ser
menos resistentes al grado alcohólico que los bacilos, motivo por el cual el grado
alcohólico suele ser un importante factor a tener en cuenta cuando se utilizan como
cultivos iniciadores preparados comerciales a base de cocos.
El sulfitado: Las bacterias lácticas son muy sensibles al SO2 , tanto más cuanto más
ácido sea el vino. Así por ejemplo en regiones frías, donde el vino suele ser muy ácido,
5 g de SO2 /HL de mosto pueden impedir la F.M.L.; en regiones templadas se
requieren de 10 a 15 g de SO2 /HL de mosto para impedir la F.M.L.; en regiones
cálidas, donde el vino es muy poco ácido, 20 g de SO2 /HL de mosto pueden ser
insuficientes para impedir la F.M.L.
El picado láctico: Se produce como consecuencia de la utilización de los azúcares
residuales de un vino por todo tipo de bacterias lácticas del vino (perjudiciales o útiles)
para generar ácido láctico, acético y manitol lo que transmite al vino un sabor
agridulce. Los vinos en los que se ha parado accidentalmente la F.A. son más
propensos a este tipo de enfermedad.
La vuelta: Consiste en la utilización del ácido tartárico por las denominadas bacterias
perjudiciales (principalmente bacilos) para dar ácido láctico, ácido acético y CO2. El
vino pierde acidez total, concretamente acidez fija, y gana en acidez volátil,
depreciándose notablemente su calidad.
Enfermedad del amargo: Típica de vinos tintos viejos embotellados, se caracteriza
por la aparición en ellos de un sabor amargo que es debido a la transformación del
glicerol en acroleína por las bacterias lácticas y posterior combinación de la acroleína
con los polifenoles del vino.
La grasa: El vino atacado de esta enfermedad presenta un aspecto ahilado y aceitoso,
que es debido a la presencia en el mismo de polisacáridos. Estas moléculas
producidas principalmente por especies del género Leuconostoc forman entramados
que espesan el vino dándole el aspecto gelatinoso que le caracteriza. La mejor forma
de preenir las enfermedades anaeróbicas, es el empleo correcto de las técnicas
enológicas como son el sulfitado, las filtraciones, evitar los azúcares residuales y las
temperaturas elevadas durante la conservación del vino, y la vigilancia constante de
una higiene rigurosa.
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