Apunts 08/09, Apuntes de Biotecnología Vegetal

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Biotecnologia Vegetal

Apunts

MªAlba Cornadó Panadés

3r Biotecnologia (2008/2009)

TEMA 1. GENOMA DE PLANTAS: ORGANELOS SEMIAUTÓNOMOS

TEMA 3. COMUNICACIÓN MOLECULAR EN LAS INTERACCIONES ENTRE PLANTAS Y

TEMA 7. CULTIUS VEGETALS IN VITRO: CULTIVOS DE CÉL·LULAS, DE TEJIDOS Y DE ORGANOS

**1. ESTÍMULS QUÍMICS 72

2. REQUERIMENTS NUTRICIONALS DE LES PLANTES: MEDIS DE CULTIU 74 2.1. Protoplasts manipulats 75** 2.1.1. Regenerar la planta 75 2.1.2. Mantenir cèl·lules en suspensió 75

• 1. NÚCLEO
• 1.1. Paradoja del valor C
• 1.2. Sintenia
• 1.3. DNA repetitivo
  • 1.3.1. En tándem
    • 1.3.1.1. Centrómeros
    • 1.3.1.2. Telómeros
    • 1.3.1.3. Genes ribosomales
    • 1.3.1.4. DNA satélite
  • 1.3.2. Dispersas
    • 1.3.2.1. Retrotrasnposones
    • 1.3.2.2. Transposones
      • 1.3.2.2.1. Aplicaciones de los transposones
        • 1.3.2.2.1.1. Transposón tagging
• 1.4. Tipos de mapas
  • 1.4.1. Mapa genético (RFLP = diferentes marcadores)
  • 1.4.2. Mapa físico
  • 1.4.1. Mapa citogenético
• 2. PLÁSTIDOS
• 2.1. Cloroplasto
  • 2.1.1. Genoma del cloroplasto
  • 2.1.2. Control expresión cloroplasto
• 2.2. Genoma mitocondrial
  • 2.2.1. Subgenomas
  • 2.2.2. Infertilidad
  • 2.2.3. mRNA editing
• 3. ORGANISMOS MODELO
• 4. ARRAY
• 1. PLÀSMIDO TEMA 2. FORMACIÓN DE TUMORES EN PLANTAS. INDECCIÓN POR AGROBACTÉRIUM.
• 1.1. Elementos del plásmido
• 1.2. Transformación
• 1.3. Estructura T-DNA
  • 1.3.1. Genes
    • 1.3.1.1. Locus shi
      • 1.3.1.1.1. Vías de síntesis de Auxinas y citoquininas
    • 1.3.1.2. Locus Roi
    • 1.3.1.3. Región Vir
• 1.4. Aplicaciones
  • 1.4.1. Método general
    • 1.4.1.1. Sobreexpresión constitutiva
    • 1.4.1.2. Construcción antisentido
    • 1.4.1.3. Promotor inducible
    • 1.4.1.4. Co-supresión
• 1. DEFENSAS PREFORMADAS PATÓGENOS MICROBIANOS
• 1.1. SAPONINAS
• 1.2. GLUCOSINONATOS
• 2. DEFENSAS INDUCIDAS
• 2.1. Genes Avr
• 2.2. Genes R - Grupo - Grupo - Grupo - Grupo - Grupo
  • 2.2.1. Estructura de las proteínas de resistencia
    • Grupo
    • Grupo
    • Grupo
    • Grupo
  • 2.2.2. Mecanismo de funcionamiento
• 3. SEÑALIZACIÓN DE LAS REACCIONES DE DEFENSA
• 3.1. ROS
• 4. HORMONAS IMPLICADAS EN LA DEFENSA
• 4.1. SA
• 4.2. JA
• 4.3. EtOH
• 5. GENES DE DEFENSA
• 5.1. Genes PR y de defensa
  • 5.1.1. Vía JA
  • 5.1.2. Vía SA
• 6. INMUNIDAD SISTÉMICA
• 6.1. Injertos
• 6.2. Aplicaciones
• 1. DETECCIÓ DE LA LLUM TEMA 4. MECANISMOS DE REGULACIÓN GÉNICA Y ADAPTACIÓN MEDIOAMBIENTAL
• 1.1. Creixement en la foscor: Planta etiolada
• 1.2. Creixement amb la llum
• 1.3. Efecte de la llum
  • 1.3.1. Planta etiolada
• 1.4. Receptors de llum
  • 1.4.1. Fitocroms - Tipus I - Tipus II
    • 1.4.1.1. Estructura del fitocrom
    • 1.4.1.2. Síntesi del cromòfor
    • 1.4.1.3. Gens que codifiquen pel fitocrom
  • 1.4.2. Criptocroms
  • 1.4.3. Fototropines
• 1.5. Gens induïts per la llum
  • 1.5.1. Característiques dels promotors regulats per llum
• 2. ESTRÉS ABIÒTIC
• 2.1. Estrés oxidatiu
  • 2.1.1. Radical hidroxil (OH-)
  • 2.1.2. Antioxidants
    • 2.1.2.1. No enzimàtics
    • 2.1.2.2. Enzimàtics
      • Plantes resistents a situacions desfavorables de creixement.
  • 2.1.3. Ozó (O 3 )
• 2.2. Respostes a estrés hídric
  • 2.2.1. Via de síntesi del Pinitol, poliol osmoprotector i molècula hidrofílica.
    • 2.2.1.1. Connexió amb la via dels metils
  • 2.2.2. Proteïna LEA (Late Embryogénesis Abundant)
  • 2.2.3. ABRE (ABA responsive element)
• 1. FETS COMUNS I DIFERENCIALS EN EL DESENVOLUPAMENT D’ANIMALS I PLANTES TEMA 5. CONTROL MOLECULAR DEL DESARROLLO
• PLANTA. 2. FACTORS MEDIAMBIENTALS PODEN MODIFICAR EL DESENVOLUPAMENT DE LA
• 2.1. Cicle vital de les angiospermes
  • 2.1.1. Meristem Radicular (RAM)
  • 2.1.2. Meristem apical (SAM)
• 2.2. Desenvolupament floral (Arabidopsis)
  • 2.2.1. Flor d’Arabidopsis
  • 2.2.2. Gens implicats en el dsenvolupament floral
• 3. PATRÓ D’EXPRESSIÓ DELS GENS DE DESENVOLUPAMENT
• 3.1. Genes SEPALLATA (experiment)
  • 3.1.1. Model ABCD (sepallata) o del cuasteto
• 3.2. Gens catastrals
• 3.3. Gens d’identitat del meristem
  • 3.3.1. Mutants que tinguin afectada la transició del període vegetatiu al reproductiu
    • 3.3.1.1. Correlació quantitat expressió (RNA) amb capacitat de floració
    • 3.3.1.2. Dominis d’expressió
  • 3.3.2. CO, LFY, TERMINAL FLOWER (TFL)
    • 3.3.2.1. Gens implicats en el meristem de les SC
• 4. SISTEMES D’AUTOINCOMPATIBILITAT (PREVENIR L’AUTOFERTILITZACIÓ)
• 4.1. GSI
  • 4.1.1. Degradació de RNA del pol·len
• 4.2. SSI
• 1. FACTORS NOD TEMA 6. BASES MOLECULARES DE LOS MECANISMOS DE FIJACIÓN DE NITRÓGENO
• 1.1. Síntesi dels factors Nod
• 1.2. Fluxos de Ca2+ provocats pels factors Nod
  • 1.2.1. Gens Nod (bacterians)
    • 1.2.1.1. Factors de transcripció (Nod D, altres)
    • 1.2.1.2. Síntesi dels factors Nod
    • 1.2.1.3. Síntesi de cofactors (nitrogenasa)
  • 1.2.2. Distinció de gens Nod.
• 2. TIPUS DE NÒDULS
• 2.1. Nòduls indeterminats
• 2.2. Nòduls determinats
• 3. NITROGENASA
• 3.1. Regulació dels gens de la nitrogenasa bacteriana per O
• 3.2. Expressió gènica en la planta
• 4. BIOQUÍMICA DE LA FIXACIÓ DEL N
• 1. TRANSFORMACIÓ AMB AGROBACTÈRIUM
• 1.1. Seqüències consens bones, LB i RB
• 1.2. T-DNA
• 1.3. Transformació genètica per Agrobactèrium
• 1.4. Protoplast i cultius vegetals
  • 1.4.1. Polietilenglicol (PEG)
  • 1.4.2. Electroporació
  • 1.4.3. Bombardeig (biolística)
• 2. TRANSFORMACIÓ DE MONOCOTILEDÒNIES
• 2.1. Inserció de transgen al cloroplast (té genoma propi)
• 3. SELECCIÓ DE PLANTES TRANSGÈNIQUES: GENS DE SELECCIÓ
• 3.1. Resistència a antibiòtics
• 3.2. Resistència a herbicides
  • 3.2.1. Mecanismes d’acció dels transgens enfront herbicides
• 3.3. Seleccionar
• 4. TIPUS DE TRANSGENS QUE ES PODEN POSAR A LA PLANTA
• 5. REGULACIÓ DE L’EXPRESSIÓ DELS TRANSGENS
• 5.1. Promotors: constitutius, induïbles, específics
  • 5.1.1. Constitutiu
  • 5.1.2. Induïble
    • 5.1.2.1. Estudis
  • 5.1.3. Específics
• 6. PROVES QUE DEMOSTREN QUE UNA PLANTA ES TRANSGÈNICA
• 7. TRANSMISSIÓ DEL TRANSGEN
• 7.1. Eliminació del transgen del genoma vegetal
• 7.2. Construcció del transgen
• 7.3. Tecnologia Terminator
  • 7.3.1. Construcció del transgen terminator
• 1. RESISTÈNCIA A INSECTES TEMA 9. APLICACIÓ DE LA BIOTECNOLOGIA A LA MILLORA VEGETAL
• 1.1. Pesticides
  • 1.1.1. Costos d’aplicació
• 1.2. Transgènica
  • 1.2.1. Grups de plantes transgèniques
    • 1.2.1.1. Control de resistències
• 2. RESISTÈNCIA A VIRUS (PROPIS DE LA PLANTA O OPORTUNISTES)
• 2.1. Sobreexpressió de la proteïna de la càpside dels virus
• 2.2. Silenciament gènic
• 2.3. Sobreexpressió de proteïnes implicades en l’obertura dels plasmodesmes
• 3. RESISTÈNCIA A HERBICIDES
• 3.1. Sobreexpressió dels gens EPSPS
• 4. TOLERÀNCIA A L’ESTRÈS ABIÒTIC
• 5. VARIACIONS EN PLANTES RELACIONADES EN EL CONTROL DE LA MADURACIÓ
• 5.1. Tomàquet Flavr Savr (Calgene, 1994)
  • 5.1.1. Retardar la maduració dels fruits
    • 5.1.1.1. Producció d’etilè a partir de Meteonina
• 5.2. Clavell
• 5.3. Millora de les qualitats nutricionals
  • 5.3.1. Aminoàcids
  • 5.3.2. Olis (àcids greixosos)
  • 5.3.3. Midó: usos industrials (alimentació no)
    • 5.3.3.1. Midó modificat
  • 5.3.4. Modificació de la concentració de lignines
    • 5.3.4.1. Plàstics, propietats aïllants, conservació,...
• 5.4. Golden rice
• 1. MARCADORS MOLECULARS TEMA 10. DIAGNÓSTIC EN BITECNOLOGIA VEGETAL
  • SNP (Single Nucleotide Polimorfism):
  • Indels
• 1.1. Aplicacions:
• 1.2. Tècniques
  • 1.2.1. RFLP (Restriction Fragment Lengh Polimorfism)
  • 1.2.2. RAPDs
  • 1.2.3. AFLPs (Amplified Fragment Length Polimorfism)
    • 1.2.3.1. Fase preselectiva
  • 1.2.4. CAPS (Cleared Amplified Polimòrfic Sequences)
  • 1.2.5. Mapeig genètic
• 1. DOCUMENTS PRÀCTICS TEMA 11. LEGISLACIÓ SOBRE BIOTECNOLOGIA VEGETAL A LA UNIÓ EUROPEA

de la proteína.

Hay muchas proteínas nucleares que no se sabe la secuencia NLS, incluso puede ser que se de la señal por

fosforilación. Las NLS no se eliminan de la proteína como en el caso del cloroplasto y la mitocondria donde

se delecciona la secuencia señal dando la proteína madura y más corta.

La replicación del genoma nuclear está asociado con el ciclo de división celular, por tanto solo se replica

cuando se divide la célula.

Hay 4 fases, más o menos largas dependiendo de las especies:

• 2 son definibles anatómicamente

o Fase S: Replicación del DNA

o Fase M: Formación del huso y de separación de cromosomas (división del núcleo pero no

del citoplasma)

• G1: Crecimiento. La célula se divide cuando llega a un tamaño determinado, sino, en determinadas

divisiones muere.

Antes de entrar en fase S la célula pasa por un “check point” donde se mira:

o Tamaño de la célula

o DNA no haya sufrido daños que suelen ser daños medioambientales

Daño pequeño  Reparación

Daño grande  Apoptosis

• G2: Después de esta también se da un “check point”

o DNA replicado

Mucho daño  Apoptosis

Poco daño  Se queda en el “check point” se repara y posteriormente sigue.

De metafase a anafase también hay otro punto de control por proteínas

quinasas que pueden activar mecanismos de reparación:

• Huso esté formado correctamente
• Bien unido al centrómero
• Bien unido a las cromátidas.

1.1. Paradoja del valor C

No hay correspondencia directa entre la cantidad de DNA de un microorganismo y la complejidad de este.

Valor C: Cantidad de DNA por genoma haploide (ojo!! Nosotros diploides y otros organismos poliploides)

La mayor parte de DNA de plantas es repetitivo, pero el número de genes es parecido al de los animales,

aunque el diseño anatómico es más sencillo. No se sabe muy bien el porque de esta cantidad de DNA, una

de las posibilidades seria la adaptación por copia de DNA por si se daña siempre se encuentra otra copia.

1.2. Sintenia

Hay una correlación génica entre especies con poca diferencia evolutiva. Hay genes que

tendrán la misma organización y estarán en el mismo lugar en grandes proporciones

del genoma.

1.3. DNA repetitivo

1.3.1. En tándem

1.3.1.1. Centrómeros

Hay DNA repetitivo que tiene funciones conocidas como

por ejemplo los centrómeros, que son repeticiones de DNA

en tándem (no esta disperso por el genoma), igual que los

telómeros. Estas son secuencias muy conservadas y que no

se transcriben.

• FISH se puede usar para la detección de DNA

repetitivo en tándem para poder ver la fluorescencia, sino no seria detectable.

1.3.1.2. Telómeros

Secuencia telomérica: Impide que los extremos de los cromosomas sean “stiky” (pegajosos) y se puedan

unir.

1.3.1.3. Genes ribosomales

Son cientos de miles de copias de la unidad de repetición que contiene 3 de los 4 genes ribosomales.

Esto se trascribe a partir de un cierto punto por un RNA policistrónico para la estructura (no se traduce!). La

trascripción se inicia a la vez de los cientos de miles de puntos dados la alta demanda de ribosomas por el

organismo.

Con hibridación in situ se pueden hacer mapas citogenéticos.

Ejemplo Arabidopsis

Es un organismo diploide de 5 cromosomas (2*5).

La localización de los centrómeros se puede distinguir en los diferentes cromosomas y además se pueden

ver los telómeros.

Se ha localizado el rRNA en el cromosoma 4 y parte del cromosoma 2.

Ejemplo Semilla de maíz (=color, =familia de transposones)

1.3.2.2. Transposones

Estos se mueven de una zona a otra.

Los elementos básicos que los constituyen son:

• 1 o más secuencias codificantes, pero para que se mueva

necesita la secuencia de una transposasa.

• En los extremos hay secuencias repetidas inversas (IR) de

unos 10 nts.

La trascripción se cataliza por la transposasa del propio elemento de

diferentes maneras.

Ejemplo Transposón

Formación de un elemento libre que se introduce en otro lugar del genoma.

Esto crea secuencias repetidas dispersas por el genoma debido al corte (huellas) del transposón que es

característico del transposón que ha estado.

La actividad del transposón puede cambiar el fenotipo (ejemplo).

Al principio la semilla es purpura por el gen C (síntesis de

xantocianina), pero si el transposón cae en el medio de este gen,

la semilla será de color blanco. Si el transposón se va de ahí el gen

C recupera su función.

Las manchas provienen de las células las cuales provienen de un

gen C que ha recuperado su función.

1.3.2.2.1. Aplicaciones de los transposones

De los transposones de las plantas se han creado aplicaciones como:

1.3.2.2.1.1. Transposón tagging

Se aprovecha el hecho de que el salto del transposón

inactiva el gen y por tanto se puede usar para buscar

genes que se pueden observar en el fenotipo/genotipo de

la planta

Ejemplo Buscar genes de resistencia a patógeno

Existen Ecotipos que nos permiten controlas la trascripción

de los transposones.

1. Con la planta provocamos la transposición.

2. Hacer un screening en una gran cantidad de

progenie que contengan el fenotipo que buscamos.

3. Para saber si es un efecto directo se puede usar el

transposón como sonda y entonces se pueden mirar las

secuencias flanqueantes y se podrá saber el gen.

4. Volver a provocar la trascripción del gen y ver si se recupera el fenotipo salvaje (las secuencias

repetidas en principio no afectan).

5. Esto es fundamental para buscar patrón embriogénesis.

1.4. Tipos de mapas

1.4.1. Mapa genético (RFLP = diferentes marcadores)

En este se pueden interpretar las distancias génicas. El posicionamiento se basa en el posicionamiento en

la descendencia, ya que marcadores que se segregan juntos es porque no pueden recombinar.

Estas distancias a veces no están en relación directa con la localización in situ de estas.

1.4.2. Mapa físico

Se hacen usando clones de la genoteca genómica del organismo (ha de permitir la ordenación, por lo tanto

hay partes que deben ir solapadas) y los marcadores.

Ente el mapa genético (RFLP) y el físico si que hay una correlación y será mejor cuanto más denso sea (con

la menor distancia posible). Así se puede obtener la secuencia completa y ordenada.

1.4.1. Mapa citogenético

2.1. Cloroplasto

La expresión es diferencial dependiendo de:

• Tejido
• Presencia o no de luz

El genoma es siempre igual y su estructura es básicamente circular (= procariota). Es muy conservado; con

dos regiones y organización típica (amarillo y verde que es copia única o dos regiones de repetición

invertida) (azul= contienen información de ribosomas).

2.1.1. Genoma del cloroplasto

El genoma es poliploide (muy repetido)

Ejemplo Copias jóvenes, hasta 100 copias en 1 cloroplasto.

El numero de genes esta entre 101 y 150, allí esta codificada toda la

maquinaria de traducción (tRNA, rRNA y proteínas ribosómicas).

La replicación no esta asociada a la división pero su maquinaria esta

codificada en el núcleo.

De los complejos funcionales siempre hay parte codificada en el

genoma y parte en el núcleo.

Rubisco: La parte grande se codifica en el cloroplasto y la pequeña

en el núcleo.

Se han de sintetizar por separado y ensamblarse.

Con frecuencia los genes de cloroplasto están codificados como operones (psb  membrana de los

tilacoides).

Es como una mezcla entre procariota y eucariota porque hay intrones. Hay genes codificados en las dos

cadenas (procariota). RNA no tiene cola poliA ni estructura en el extremo 5’ (procariota).

2.1.2. Control expresión cloroplasto

Es dona a nivell transcripcional y traduccional, el trascripcional es el

mes estudiat.

La expresión de un gen no tiene que traducirse pero si trascribirse,

Ejemplo: dominio grande rubisco.

En la oscuridad hay bajos niveles de RNA pero este no se traduce, o

se traduce poco porque RNA produce loops que no deja que este de

traduzca.

En presencia de luz hay una proteína traducida en el núcleo (nRNA

blinding proteín) que se une al RNA y cambia su estructura

permitiendo unir el ribosoma. Esta proteína no solo se traduce en

presencia de luz y nos enseña como se une la regulación entre cloroplasto y núcleo.

2.2. Genoma mitocondrial

Es muy grande comparado con otros.

En el reino animal, como mas evolucionado mas se pierde el genoma mitocondrial,

pero en plantas pasa al revés, el genoma es muy grande y no hay un único genoma si

no que, encontramos distintas moléculas de este (circulares o lineales).

Es difícil saber lo grande que es el DNA mitocondrial porque no se ha podido aislar un DNA circular grande

porque no esta o porque se rompe durante la manipulación. (=color =sRI sec Rep Inv)

2.2.1. Subgenomas

Se pueden formar diferentes subcirculos o subgenomas

según el número de repeticiones y posición de las

diferentes secuencias repetidas invertidas. Esto puede

dar distintas recombinaciones.

Hoy en día no se sabe como es el DNA mitocondrial, se

supone de datos experimentales. Los genomas lineales

que se pueden encontrar, son independientes del

genoma general.

Todas las partes de traducción se encuentran en el organelo. No tienen poliA ni estructura CAP.

Las promotores de los genes también se parecen mas a los procariotas. Tampoco hay intrones.