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CAPITULO 9
Mecanismos de reparación del ADN Tipos de daño en el ADN Las lesiones en el ADN pueden ocurrir espontáneamente o pueden estar causadas por la exposición a agentes mutagé nicos. La desaminación, la depurinización y el daño oxida tivo de las bases nitrogenadas son algunos de los daños que se producen en el ADN de forma espontánea. La desamina ción consiste en la pérdida de grupos amino. En condicio nes normales la desaminación de la citosina produce uracilo, base nitrogenada que no forma parte del ADN; esta base se aparea preferentemente con la adenina en lugar de hacerlo con la guanina, produciendo así la conversión de un par de GC en un par de AT (fi gura 9-1A). La depurinización consiste en la eliminación del enlace N-glucosídico entre la base nitrogenada y el azúcar, con la consiguiente pérdida de un residuo de adenina o guanina. Como consecuencia aparecen sitios apurínicos en el ADN que conducen a un daño genético importante, ya que duran te la replicación estos sitios no pueden unir una base com plementaria a la purina original perdiéndose un nucleótido en la cadena de ADN recién sintetizada. En todos los seres vivos el metabolismo normal aerobio produce especies reactivas de oxígeno como los radicales superóxido (O2), peróxido de hidrógeno (H2O2) y radicales hidroxilo, moléculas que causan daños oxidativos en el ADN. Las principales alteraciones que originan estos radi cales libres son la formación de una 8-oxo guanosina y el glicol de timina que bloquean la replicación del ADN si no se reparan (fi gura 9-1B). Agentes alquilantes. Añaden grupos alquilo (etilo o metilo) a las bases nitrogenadas y alteran su patrón de apa reamiento bloqueando la replicación. Uno de los sitios más propensos a la alquilación es el oxígeno del carbono 6 de la guanina formándose O6-metilguanina, que se aparea de modo incorrecto con la timina, provocando transiciones de un par de bases GC por un par AT. Agentes intercalantes. Son compuestos que se inter calan entre los nucleótidos del ADN y producen adiciones de un solo par de nucleótidos. Entre los componentes quí micos intercalantes se encuentran la profl avina, la acridina y el etidio. Cuando estas adiciones se producen en un gen, puede producirse consecuencias importantes en la traducción de su ARNm, ya que altera la secuencia codifi cadora en su marco de lectura correcto. Análogos de bases. Son compuestos químicos con estructura similar a la de las bases nitrogenadas normales y se pueden incorporar al ADN en lugar de éstas. Debido a que los análogos de bases presentan diferencias estructura les con las bases convencionales, se aparean de forma in correcta, lo que provoca errores frecuentes en el proceso de replicación. El 5- bromouracilo (5BrU) es análogo de la timi na que contiene un bromo en el carbono 5. En su forma cetónica, el 5BrU forma un par de base con la adenina, mientras que en su forma enólica lo hace con la guanina. Si se incorpora la forma cetónica del bromouracilo, se produce una transición AT-GC y si se incorpora la forma enólica se produce una transición GC-AT (fi gura 9- 2). Energía ionizante. La exposición del ADN a la luz ultravioleta (UV) produce dímeros de pirimidinas, sobre todo de timinas, cuando hay dos timinas consecutivas en la misma cadena de ADN. La luz UV produce que se formen enlaces covalentes entre dos pirimidinas contiguas, lo que interfi ere con la unión normal de las bases nitrogenadas con la cadena complementaria. La radiación UV induce también transiciones GC–AT, transversiones, mutaciones con cam bio de
marco de lectura, duplicaciones y deleciones (véase el capítulo 8). La radiación ionizante produce daño directo en las bases nitrogenadas del ADN e induce la gene-ración de especies reactivas de oxígeno. Además, produce roturas del enlace N-glucosídico que conducen a la formación de sitios apurínicos, así como rompimientos en la doble cadena del ADN, responsables de efectos letales en la célula. Estas lesio nes ocasionan cambios permanentes en el ADN que pue den alterar la secuencia codifi cadora o reguladora de un gen e impedir el uso del ADN como plantilla para la replicación y transcripción. Sistemas de reparación del ADN Para minimizar el daño del material genético el organismo dispone de diversos sistemas de reparación que se activan dependiendo del tipo de daño provocado en el genoma. Estos mecanismos de reparación se pueden clasifi car en cuatro categorías: reparación directa, reparación por esci sión, reparación de emparejamientos erróneos (aparea mientos incorrectos) y reparación de roturas de doble cadena. Reparación directa La reparación directa involucra sistemas que eliminan directamente el daño en el ADN inmediatamente después de producidos. Este tipo de reparación no es muy común, ya que hay algunos daños en el ADN irreversibles. La fo torreactivación es el mecanismo de organismos procariotes mediante la enzima fotoliasa para reconocer los dímeros de pirimidinas producidos por la luz UV. Esta enzima se une al dímero de timina y utiliza la energía de la luz para romper los enlaces covalentes entre las pirimidinas, con lo que logra que vuelvan a formar complementariedad con la cadena antiparalela (fi gura 9-3). Otro tipo de enzimas que participan en este sistema de reparación son las alquiltransferasas, enzimas que eliminan los grupos alquilos de la guanina y restauran la estructura original, sin la necesidad de alterar el esqueleto del ADN. Sistemas de reparación por escisión: reparación por escisión de bases y reparación por escisión de nucleótidos Reparación por escisión de bases El sistema de reparación por escisión de bases (base excision repair, BER) elimina del genoma las bases dañadas que se producen por alquilación, radiación ionizante, oxidación y desaminación. En este sistema intervienen las enzimas denominadas ADN glucosilasas, de las cuales existen por lo menos ocho tipos distintos específi cos para cada lesión. La reparación se realiza hidrolizando el enlace glucosídico entre la base nitrogenada y el azúcar, con lo que se elimina la base dañada. Esta rotura genera sitios apurínicos o apirimi dínicos reconocidos por una AP endonucleasa 1 (APE-1) que rompe el enlace fosfodiéster adyacente. Posteriormente, la ADN polimerasa β adiciona los nucleótidos para rellenar el hueco generado empleando la cadena que no está dañada como molde. El fragmento recién sintetizado forma el enla ce fosfodiéster faltante para su ligación gracias a la ligasa (fi gura 9-4). Reparación por escisión de nucleótidos El sistema de reparación por escisión de nucleótidos (nucleotide excision repair, NER) reconoce cualquier lesión que provoque una distorsión importante en la doble cadena del ADN. Implica en primer lugar el reconocimiento del daño en la secuencia del ADN; posteriormente, una endo nucleasa hidroliza los enlaces fosfodiéster a cada lado y varios pares de bases de distancia de la lesión, y se elimina el fragmento de ADN de cadena sencilla que presenta la lesión. El hueco que
el represor LexA, lo que facilita su autoproteólisis; esto induce la transcripción de los genes que contienen la caja SOS (fi gura 9-8). Con ello, aumentan los niveles de las pro teínas lexA, recA, UvrA, UvrB y UvrD. Por tanto, el primer mecanismo de reparación que se activa en respuesta a SOS es la reparación por escisión de nucleótidos (NER), que tra tará de corregir el daño sin un encendido total de la vía SOS. Si el sistema NER no es sufi ciente para la reparación del ADN, las concentraciones de LexA disminuyen y se expresan genes como sulA, umuD y umuC (UV-induced mutagenesis). La proteína SulA se une a FtsZ (molécula indis pensable para el inicio del ciclo celular) y detiene la división celular. Con ello, se induce al sistema de reparación Umu DC dependiente de mutagénicos. Reparación de roturas de doble cadena Reparación por recombinación homóloga Es un sistema de reparación preciso que actúa durante la fase S del ciclo celular. Durante el proceso de replicación, este sistema se induce por la necesidad de tener una copia de ADN correcta que sirva como molde para restaurar la información perdida en la cadena dañada. En este sistema de reparación están involucrados los genes que pertenecen al grupo de epistasia de RAD52 (radiation sensitive mutant 52), como RAD50, RAD51, RAD52, RAD55, RAD57, RAD y el complejo MRN formado por MRE11 (meitoic recombination 11), RAD50 y NBS1 (Nijmegen breakage syn drome 1). Además, intervienen otros genes, como BRCA1 y BRCA2 (cáncer de mama 1 y 2). En humanos, RAD51 des empeña un papel primordial en los mecanismos de recom binación homóloga para la reparación de roturas en la doble cadena del ADN. La recombinación homóloga implica gas to e hidrolisis de adenosín trifosfato (ATP) para el inter cambio de la cadena de ADN, por secuencias homólogas. El primer paso para la reparación por recombinación homólo ga involucra la activación del gen de la ataxia-telangiectasia mutado (ataxia telangiectasia mutated, ATM) que recluta el complejo MRN para que se una al ADN y, por su acti vidad de exonucleasa 5’-3’, procesa los extremos donde ocu rrió el daño dejando expuestos los extremos 3´ en forma de cadena sencilla. A continuación, la proteína de replicación A (RPA) se une al ADN de cadena sencilla e interactúa con RAD52; éste es desplazado por BRCA2, que atrae a RAD51. Por último, RAD51 se une a la cadena sencilla y forma una nucleoproteína fi lamentosa con el ADN. Con ayuda de RAD54 invade la hélice homóloga que sirve como molde para restaurar el fragmento dañado (fi gura 9-9). Alteracio nes en las proteínas que participan en este sistema provo can el síndrome de Bloom, la ataxia-telangiectasia y la anemia de Fanconi, que se describirán más adelante. Unión de extremos no homólogos Este sistema es uno de los que pueden participar cuando se producen roturas en la doble cadena de ADN. El compo nente principal de este sistema es la proteína de cinasa dependiente de ADN (ADN-PKcs), que consta de tres subunidades: KU70, KU80 y la subunidad catalítica ADN PKcs. Estas subunidades reconocen los cortes en el ADN y mantienen los extremos en proximidad para su procesa miento y reunión. Para que se lleve a cabo el alineamiento de los extremos es necesario el complejo ARTEMIS/ADN PKcs, con actividad de nucleasa y el complejo XRCC4/liga saIV, que se encarga del paso fi nal de la ligación (fi gura 9-10). Este proceso puede tener varios errores, ya que úni camente une los extremos rotos, lo que conlleva la pérdida de nucleótidos en el punto de unión. Este proceso se lleva a cabo principalmente en mamíferos; sin embargo, también se ha encontrado en algunas procariotas, lo que sugiere que está muy conservado evolutivamente. Enfermedades humanas asociadas al funcionamiento de los sistemas de reparación
Muchas de las anomalías cromosómicas que generan enfer medades en la especie humana aumentan con la edad, pues los mecanismos de reparación tienden a fallar con más fre cuencia. Sin embargo, también existen síndromes de inesta bilidad cromosómica cuyo patrón de herencia es autosómico recesivo, caracterizados por una alta frecuencia de altera ciones cromosómicas en edades tempranas. Estas enferme dades implican defectos en los mecanismos de reparación del ADN. Los síndromes clásicos de inestabilidad cromosó mica son: síndrome de Bloom, anemia de Fanconi, ataxia telangiectasia, xeroderma pigmentoso, los cuales presentan anormalidades estructurales de los cromosomas, como roturas, puentes intercromosómicos, tétradas, entre otras. La expresión clínica de cada una de estas entidades es varia ble y se observa un incremento en la frecuencia de neopla sias. Síndrome de Bloom Presenta características clínicas, como eritema telangiectá sico en la cara, antebrazos y el dorso de las manos, fotosen sibilidad, enanismo, manchas café con leche, alteraciones esqueléticas y neoplasias. A nivel celular se presentan inter cambios entre cromátidas hermanas, roturas cromosómi cas y reordenamientos. Las células son hipersensibles a la luz UV, la hidroxiurea (HU) y agentes alquilantes. El síndro me de Bloom lo causan mutaciones en el gen BLM, que codifi ca una proteína de la subfamilia RecQ de las ADN helicasas dependientes de ATP. Estas proteínas participan en la reparación, replicación y reparación por recombina ción homóloga. BLM es un miembro del complejo BASC y contiene otros miembros que participan en los procesos de reparación, replicación y recombinación, como PCNA, RAD51, BRCA1, ATM y el complejo MRN. También actúa en la respuesta temprana al daño celular y promueve el pos terior reclutamiento de proteínas de reparación en las hor quillas de replicación. Anemia de Fanconi Es una enfermedad genética autosómica recesiva ligada al sexo, caracterizada por un conjunto de malformaciones congénitas, aplasia medular progresiva, con una prevalen cia de 80%, y predisposición tumoral – más de 60% de los cánceres son hematológicos. Entre las alteraciones más frecuentes destacan la baja estatura, anomalías esqueléti cas en antebrazos, dedos, cadera y rodillas, malforma ciones renales y cardiacas, manchas café con leche, microcefalia, retraso mental leve e hipogonadismo en varones. La prevalencia de la anemia de Fanconi es de 1 a 5 nacimientos por cada millón de habitantes y se encuentra con una frecuencia de 0.3 a 1%, aunque estas cifras depen den del grupo étnico de que se trate así como del grado de consanguinidad. La anemia de Fanconi es una enfermedad con heteroge neidad no sólo clínica sino también genética. Existen al menos 11 genes diferentes involucrados en la FA (FANCA, FANCB, FANCC, FANCD o BRCA2, FANCD2, FANCE, FANCF, FANCG, FANCI, FANCJ, FANCL). Los defectos en cualquiera de los genes de anemia de Fanconi conllevan inestabilidad genómica y un riesgo elevado de presentar leucemias y carcinomas. El descubrimiento de BRCA2 como uno de los genes de la anemia de Fanconi fortalece el papel de esta enfermedad en el procesamiento de roturas de doble cadena mediante recombinación homóloga. Ataxia-telangiectasia Es un síndrome genético con un complejo fenotipo clínico. Las principales características clínicas son degeneración neuronal progresiva, telangiectasia ocular, inmunodefi cien cia, hipogonadismo, envejecimiento prematuro, inestabili dad genómica y predisposición al cáncer. A nivel celular, se presenta inestabilidad cromosómica, hipersensibilidad a las radiaciones, defectos en los puntos de control del ciclo celu lar, acortamiento telomérico y alto nivel de especies reacti vas de oxígeno. La ataxia-telangiectasia es causada por defectos en el gen
