Bionergentica tema 5, Apuntes de Bioquímica

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Tema 5

Teoría quimiosmótica

Bioenergética

Grado en Bioquímica y Ciencias Biomédicas Curso 2014- Prof. Carlos García Ferris 1

Quimiosmosis y síntesis de ATP 2

ATP

H

- ATPasa Na

- ATPasa

antiportador Na

/H

Fuentes primarias de energía hν, S respirables, O 2

centros de reacción fotosintéticos

complejos respiratorios

bacteriorrodopsina

complejos respiratorios

descarboxilasas

W

W

W

W = químico, osmótico, trabajo eléctrico, y/o calor

fosforilación a nivel de sustrato

Fuentes primarias de energía S fermentables Eur J Biochem (1992) 208:203-

H+

Na+

La teoría quimiosmótica de Peter Mitchell

• Teoría quimiosmótica : Peter Mitchell (1920-1992) propuso en 1961 que el intermediario de alta energía no era un compuesto fosforilado, sino un gradiente electroquímico de un ión acoplador ( H+ ), dando lugar al acoplamiento quimiosmótico.
• La teoría química estaba enraizada en la bioquímica clásica , mientras que la teoría quimiosmótica lo estaba en la fisiología clásica de membranas.
• Introdujo el concepto de metabolismo vectorial , en contraposición a la visión escalar de la bioquímica clásica.
• La teoría fue presentada inicialmente como una hipótesis , antes incluso de disponer de evidencias experimentales , y se alza como un monumento al método científico.
• Fue un punto de inflexión en la historia de la bioenergética: reemplazó gradualmente a la teoría química.
• Dio lugar a la llamada “ OX PHOS war ”: durante 15 años muchos bioquímicos, que habían estado implicados en la búsqueda del intermediario, se opusieron a esta teoría.
• Según Racker fue difícil de entender para algunos bioquímicos: ! “… Mitchell’s ideas, his ‘hypothetical proton gradiente and imaginary membrane potential’ resembled the ‘pronouncement of a court jester or of a prophet of doom’ ”.
• Peter Mitchell recibió el Premio Nobel de Química en 1978. ! “… for his contribution to the understanding of biological energy transfer through the formulation of the chemiosmotic theory .” Nature (1961) 191:144-148^4

Una revolución más allá de la bioenergética

• “Peter Mitchell's 1961 paper introducing the chemiosmotic hypothesis started a revolution which has echoed beyond bioenergetics to all biology, and shaped our understanding of the fundamental mechanisms of biological energy conservation, ion and metabolite transport, bacterial motility, organelle structure and biosynthesis, membrane structure and function, homeostasis, the evolution of the eukaryote cell, and indeed every aspect of life in which these processes play a role. The Nobel Prize for Chemistry in 1978, awarded to Peter Mitchell as the sole recipient, recognized his predominant contribution towards establishing the validity of the chemiosmotic hypothesis, and ipso facto, the long struggle to convince an initially hostile establishment.” Crofts, A. (1992) Peter Mitchell Obituary, Photosynthesis Research 5 Peter Mitchell y Jennifer Moyle

Membranas transductoras de energía 7

• Las membranas transductoras de energía contienen un par de bombas de H+^ que actúan en la misma dirección, una de las cuales impulsa a la otra a funcionar en dirección inversa.

! Una bomba primaría utiliza electrones ( e− ) o fotones ( h ν) para bombear H+^ desde el compartimento

N (negativo) hasta el P (positivo). ! Una bomba secundaria , la ATP sintasa , que se muestra actuando en dirección de hidrólisis de ATP,

puede revertir su dirección sintetizando ATP impulsada por la fuerza protón-motriz (Δ p ) al volver

los H+^ desde el lado P al lado N. P , Positive side N , Negative side P N P N P N P (^) N P N N N P^ P Nicholls & Ferguson (2013)

Membranas transductoras de energía: bacterias respiradoras y arqueas

• En bacterias la transducción de energía está asociada con la membrana plasmática , que encierra el citoplasma (lado N ). ! En bacterias Gram-negativas la membrana plasmática está separada de la capa de peptidoglicano y de la membrana externa por el periplasma (lado P ), ausente en Gram-positivas donde el lado P es el exterior.
• En arqueas el mecanismo de transducción de energía también está asociado a la membrana plasmática. 8 Nicholls & Ferguson (2013) P , Positive side N , Negative side Intact Gram-negative bacteria

N

P

Membranas transductoras de energía: bacterias fotosintéticas

• Varios tipos de bacterias emplean la energía de la radiación electromagnética para impulsar el bombeo de H+ : bacterias púrpura del azufre y no del azufre, bacterias verdes del azufre y no del azufre, y cianobacterias.
• La membrana transductora de energía en las bacterias fotosintéticas es la membrana plasmática (membrana interna), que en ocasiones está altamente invaginada.
• El citoplasma es el lado N , mientras que el periplasma es el lado P.
• En arqueas las halobacterias llevan a cabo un original mecanismo de transducción de energía impulsado por la luz basado en la bacteriorrodopsina , una bomba de H+^ impulsada por la luz. 10 Nicholls & Ferguson (2013) Purple bacterium P , Positive side N , Negative side

N

P

P

Membranas transductoras de energía: cloroplastos

• En los cloroplastos la conservación de energía se produce en las membranas de los tilacoides donde la luz impulsa el bombeo de H+^ desde el estroma (lado N ) hasta el lumen tilacoidal (lado P ).
• La ATP sintasa se sitúa sobre la membrana de los tilacoides y se orienta hacia el estroma del cloroplasto, donde produce ATP que se empleará en la fijación de CO 2 (no se exporta al citosol).
• A diferencia de las mitocondrias, en los cloroplastos el principal componente de la fuerza protón-motriz es el gradiente químico (ΔpH), siendo muy pequeño el potencial de membrana (Δ ψ ).
• Los cloroplastos intactos pueden aislarse en un medio isotónico, y al romperse liberan los tilacoidales ( preparación de membranas tilacoidales ). 11 P , Positive side N , Negative side Nicholls & Ferguson (2013) Chloroplast

P

N

Analogía del circuito de protones con un circuito eléctrico 13
Ambos circuitos tienen generadores de diferencia de potencial (la batería y la cadena respiratoria, respectivamente).  Ambos potenciales (diferencia de voltaje y Δ p ) pueden ser expresadas en milivoltios.  Ambos potenciales pueden ser empleados para realizar trabajo útil (encender una bombilla y para sintetizar ATP respectivamente).  El flujo de corriente en ambos circuitos (amperios o flujo de protones, J H+) viene definido por la ley de Ohm (es decir, corriente = voltaje / resistencia, I=V/R ) (si bien la corriente protónica se comporta de forma no óhmica a voltajes elevados).  La velocidad de conversión química en la batería (o en la cadena respiratoria) está estrechamente ligada a la corriente de electrones (o protones) que fluye en el resto del circuito, que a su vez depende de la resistencia del circuito.  Ambos circuitos pueden ser cortocircuitados (por, respectivamente, un trozo de alambre conductor o un protonóforo – un agente que hace que las membranas sean permeables a los protones).  Los potenciales (diferencia de voltaje y Δ p ) disminuyen conforme aumenta la corriente (amperios o flujo de protones, J H+). electrical circuit proton circuit Nicholls & Ferguson (2013)

Regulación del circuito de protones
Circuito abierto , corriente nula (no respiración), potencial (Δ p ) máximo.  Circuito cerrado , circuito completo, la corriente fluye (se produce respiración), se realiza trabajo útil (síntesis de ATP), el potencial (Δ p ) es menor que el máximo (disminuye ligeramente).  Cortocircuito introducido, energía disipada, bajo potencial (Δ p ), la corriente (respiración) es alta (máxima). ! Los protonóforos causan un cortocircuito de la fuerza protón-motriz (Δ p ), con el consumo tanto del potencial químico y eléctrico. ! Una translocación indirecta de protones puede ser inducida en las membranas mediante la combinación de uniportador para un ion, junto con un antiportador electroneutro del mismo ion en intercambio con un protón, por ejemplo valinomicina y nigericina. 14 Nicholls & Ferguson (2013) electrical circuit proton circuit

Los ionóforos afectan a Δ p disipando Δ ψ y/o Δ pH 16 Si la bomba primaria (cadena respiratoria) no funciona no se genera fuerza protón-motriz (Δ p ). Si la cadena respiratoria funciona se genera fuerza protón-motriz, que consta de un componente químico (ΔpH) y de un componente eléctrico (Δ ψ ). En presencia de un desacoplador (FCCP) Δ p colapsa (tanto ΔpH como Δ ψ ), y la bomba primaria funcionará a máxima velocidad (cortocircuito). H + FCCP H + e − e − H + nigericina H + K + H + valinomicina K + e − e − H + valinomicina K + nigericina H + K + cadena respiratoria membrana H + e − ΔpH Δ ψ

Δ p

ΔpH

Δ p

Δ ψ ΔpH

Δ p

Δ ψ

Δ p

ΔpH Δ ψ

Δ p

ΔpH Δ ψ

Δ p

ΔpH Δ ψ 1 2 3 4 5 6 Δ p = − 59 ΔpH + Δ ψ En presencia de valinomicina Δ ψ colapsa, pero no ΔpH que incluso aumentará al incrementarse el funcionamiento de la bomba primaria para compensar la pérdida de Δ ψ y mantener Δ p. En presencia de nigericina ΔpH colapsa, pero no Δ ψ que incluso aumentará al incrementarse el funcionamiento de la bomba primaria para compensar la pérdida de ΔpH y mantener Δ p. En presencia de valinomicina y nigericina Δ p colapsa (tanto ΔpH como Δ ψ ), siendo equivalente a un desacoplador (cortocircuito).

Síntesis de ATP impulsada por una fuerza protón-motriz artificial: cloroplasto Proc Natl Acad Sci (1966) 55: 170- Succinate 17

Síntesis de ATP impulsada por una fuerza protón-motriz artificial: mitocondria

• Se incuban mitocondrias aisladas, en ausencia de sustratos oxidables, en un tampón a pH 9 con KCl 0,1 M.
• La lenta entrada del tampón y KCl hace que finalmente la matriz se encuentre en equilibrio con el medio.
• Se cambia el tampón del medio a uno de pH 7 que contiene valinomicina pero no KCl. ! El cambio genera Δ pH : una diferencia de dos unidades de pH a través de la membrana interna de la mitocondria. ! El cambio genera Δ ψ : el flujo de K+^ al exterior, llevado a cabo por la valinomicina , a favor de Δ μK+ (inicialmente solo potencial químico) pero sin contraión crea un desequilibrio de cargas a través de la membrana (potencial de membrana correspondiente a su potencial de equilibrio de Nernst) negativo en el interior.
• La suma del potencial químico (Δ pH ) y el potencial eléctrico (Δ ψ) constituye la fuerza protón-motriz (Δ p ) necesaria para permitir la síntesis de ATP en ausencia de sustrato oxidable. Lehninger^19

Experimentos de reconstitución: demostración de la hipótesis quimiosmótica J Biol Chem (1974) 249:662-663 20 Garrett and Grisham (2010) Biochemistry , 4th^ ed