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Se presenta de una forma general las etapas involucradas en los procesos de separación en sistemas biotecnológicos
Tipo: Apuntes
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Memoria presentada para optar al grado de Doctor en Ciencias Químicas por Benevides Costa Chitunda Pessela
A los Doctores Félix García Ochoa y Miguel Ladero Galán, por haberme permitido estar en numerosas ocasiones en su laboratorio de investigación, en el Departamento de Ingeniería Química de la Universidad Complutense de Madrid y por toda la ayuda prestada. Quiero también agradecer sinceramente primero al Doctor Eugenio Muñoz Camacho y después al Dr. Gabriel Pinto, por haber aceptado la tutoría de esta Tesis. Un recuerdo muy especial para Teresa Pérez de Prada, por su amistad, compañía y ayuda prestada, durante las largas y difíciles jornadas de laboratorio. Mil gracias. Un recuerdo entrañable para todos mis compañeros, que de forma directa o indirecta han hecho posible que esta tesis salga adelante; del Instituto de Fermentaciones Industriales, Felisa, Friki, Águeda los Santos, José " el segoviano", los portugueses Luis Soares y Anabela Almeida, Adolfo, Javi, Juan Luis, Loli, Mariluz, la Dr^. Mar Villamel, Antonio, Alberto, el Dr. Guillermo Santamaría, la Dra. Marta Calvo "la gallega por las charlas en portugués-gallego", Julián, Maria; de Química de Polímeros, Marisa Carrascoso, del Centro de Investigaciones Biológicas, Auxi, Begoña, Blanca, Beatriz, Virginia, Chello, Manolo, Dani; del instituto de Catálisis y Petroleoquímica, "la Doctora" Gloria, Glorita, "el Esnortado" Palomo, "la ataca" Olga, "las tranquilas" Rosa y Mari Carmen Ceínos, mi maestra del power point y de la presentación de esta Tesis, a ella un especial Gracias; "las Uruguayas" Lorena y Valeria, los Chilenos Lorena Wilson y Rodrigo, de Colombia, Claudia, las Italianas "la Berlus" Silvia y Tristana, "Don" Manuel de Salamanca, los Brasileños Celia Galváo y Paulo Tardioli, Carmen "Luisa" de Galicia y en especial á Cesar Mateo, por las grandes discusiones de Fútbol, y por haber aprendido con él la poca soltura que tengo en la preparación de soportes para inmovilizar y purificar proteínas. Un recuerdo muy especial para toda mi familia, principalmente a mi madre, por haber soportado todos los sacrificios posibles para que hoy esté donde estoy. A Carmen y a David un recuerdo entrañable por estar siempre a mi lado en momentos buenos y también en los malos. Por último, a mis compatriotas de Angola, Mario Brito, que conmigo ha compartido muchos momentos malos y buenos desde que los dos llegamos a este País, a Joáo Luis por compartir conmigo muchos días duros en la dirección de los estudiantes de Angola en España. A todos ellos les estaré eternamente agradecido. Mil perdones a todas aquellas personas amigas que por algún lapsus no aparecen en estas páginas. A TODOS GRACIAS.
índice i
6.- p-GALACTOSIDASAS DE TERMÓFILOS g
PROTEÍNA QUIMERA IMAC/p-GALACTOSIDASAS DE Thermus sp. CEPA T2. ' 1.1. INTRODUCCIÓN 9 1.2. OBJETIVOS Y PLAN DE TRABAJO 15 1.3. MATERIALES Y MÉTODOS 15 1.3.1 .MATERIALES 15 1.3.1.1. CEPAS BACTERIANAS 15 1.3.1.2. PLÁSMIDOS 15 1.3.2. MÉTODOS 16 1.3.2.1. CONDICIONES DE CRECIMIENTO Y CONSERVACIÓN DE LAS CEPAS. 16 1.3.2.2. COLNAJE Y SECUENCIACIÓN 16 1.3.3. ENSAYOS ENZIMATICOS 17 1.3.4. INFLUENCIA DEL pH, Y LA TEMPERATURA EN LA ACTIVIDAD ENZIMATICA 17
índice iií
2.5.2.5.2. Por cromatografía de afinidad a queiatos metálicos empleando soportes con baja densidad de grupos reactivos. 36 2.5.2.5.2.1. Adsorción. 36 2.5.2.5.2.2. Desorción. 37 2.5.2.5.2.3. Efecto de la desorción del catión metálico del soporte en la actividad de la enzima purificada. 37 2.5.2.6. DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN PROTEICA Y DE SU PESO MOLECULAR. 37 2.5.2.7. ENSAYOS EN LA ULTRACENTRIFUGACIÓN ANALÍTICA. 38 2.5.2.7.1. Equilibrio de Sedimentación. 38 2.5.2.7.2. Velocidad de Sedimentación. 40 2.6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 42 2.6.1. Purificación de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. cepa T2, por tratamiento térmico. 42
2.6.1.2. Purificación de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2, por cromatografía de afinidad a queiatos metálicos en soportes poco cargados. 43 2.6.1.3. Desorción de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2, adsorbida a soportes quelato. Purificación en soportes inmovilizados con queiatos de cobre. 44
2.6.1.4. Purificación de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. 12, en soportes inmovilizados con queiatos de cobre y adsorción selectiva con 25 mM de imidazoi. 44 2.6.1.5. Estudio del efecto del tiempo de incubación en la adsorción de la proteína IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., 12. 45 2.6.1.6. Purificación de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp., T2, en soportes inmovilizados con queiatos de cobalto y níquel. 46 2.6.1.7. Determinación del coeficiente de extinción molar. 47 2.6.2. EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN DE LA PROTEÍNA SOBRE SU ESTADO DE ASOCIACIÓN. 49 2.6.2.1. Equilibrio de sedimentación. 49 2.6.2.2. Velocidad de sedimentación. 49 2.7. CONCLUSIONES 50
CAPITULO 3.- INMOVILIZACIÓN Y ESTABILIZACIÓN DE IMAC/p- GALACTOSIDASA DE Thermus sp. T2 52
3. INTRODUCCIÓN 52 3.1. NECESIDADES DE LA INMOVILIZACIÓN 53 3.1.1. Inmovilización sobre soportes preexistentes 53 3.1.2. Inmovilización covalente 54 3.1.3. Epóxidos 55
índice iv
3.4.2.1.1. Los soportes sepabeads IDA-epóxido, sepabeads-IDA- cobalto. 61 3.4.2.1.2. Soportes sepabeads-etilendiamina(EDA)-epóxido 61 3.4.2.1.3. Soportes sepabeads-boronato epóxido 61 3.4.2.2. PREPARACIÓN DE DERIVADOS SOBRE SOPORTES EPÓXIDO. 62 3.4.2.3. INMOVILIZACIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL. 62 3.4.2.4. BLOQUEO CON GLICINA 62 3.4.2.5. ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MULTIMÉRICAS POR INMOVILIZACIÓN MULTISUBUNIDADES. ENTRECRUZAMIENTO CON DEXTRANO ALDEHIDO. 63 3.4.2.6. ESTUDIO DE LA ESTABILIDAD TÉRMICA DE LOS DERIVADOS 63 3.4.2.7. NUEVOS SOPORTES FLEXIBLES PARA INMOVILIZACIÓN REVERSIBLE DE PROTEÍNAS. ADSORCIÓN Y DESORCIÓN DE LAS PROTEÍNAS 63 3.5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 64 3.5.1. Estudio de la estabilidad de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. T2 en las condiciones de interés para su inmovilización - estabilización. 64 3.5.2. ESTABILIZACIÓN DE LOS DERIVADOS POR INMOVILIZACIÓN COVALENTE MULTIPUNTUAL. 65 3.5.3. DISEÑO DE ESTRATEGIAS PARA LA ESTABILIZACIÓN DE ENZIMAS MULTIMÉRICAS. 66 3.5.3.1. Estabilización de la IMAC/p-galactosidasa de Thermus sp. 12, por inmovilización multisubunidades. 67
4.4.3. Estudio de los cursos de iiidróiisis de lactosa 89 4.4.3.1. Hidrólisis de lactosa en leche y en suero de quesería. 90 4.5. CONCLUSIONES 91 CAPITULO 5. CONTROL TÉCNICO Y ECONÓMICO DE PROCESOS INDUSTRIALES QUE OPERAN CON p-GALACTOSIDASAS 92
5.5 Análisis económico de la subsitución del proceso de producción de lecfie baja en lactosa con lactasa libre, por un derivado inmovilizado de la misma enzima 97 5.5.1 Ventajas tecnológicas de la utilización de lactasa de Thermus sp. T2 en la producción de leches bajas en lactosa 98 5.6. Análisis de mercado. Demanda del producto 98 5.6.1. Costes y precios 98 5.6.2. Descripción del proceso productivo 99 5.6.2.1. Por cambio de tecnología: Lactasa libre a derivados inmovilizados 99 5.7. Inversión total del proyecto 99 5.8. Ingresos por ventas de la leche producida con enzima libre 100 5.9. Producción de leche baja en lactosa por hidrólisis con un derivado de lactasa inmovilizada a soportes sólidos preexistentes 100 5.10 Viabilidad industrial y valoración económica 101 5.11 Producción industrial de leche baja en lactosa, por sustitución de un reactor con lactasa inmovilizada, por otro que opera con un enzima de mayores prestaciones tecnológicas 102 5.12 CONCLUSIONES 107 DISCUSIÓN GENERAL Y CONCLUSIONES 108 BIBLIOGRAFÍA 113
Abreviaturas
Kb lacl PCR LB
X-Gal IPTG CECT ATCC v/v Epi IDA IMAC
Ag BCL SDS Epi-x-IDA-Me
His IFI CIB MAPA VAN TIR
BgaA IMAC/p-galactosidasa DQO
Resistencia a ampiciiina Miles de pares de bases Gen represor del operón lactosa Reacción en cadena de la polimeraza Luria Bertani 5-bromo-4-cloro-3-indolil-p-D-galactopiranósido lsoprpopil-p-D-1-tiogalactopiranósido Colección Española de cultivos tipo Colección Americana de cultivos tipo volumen/volumen Epiclorhidrina Ácido Inmino diácetico Cromatografía de afinidad a quelatos metálicos orto-nitrofenii-p-D-galactosido orto-nitrofenil Kilodaltons Agarosa Beads Cross Linked Dodecil sulfato Sódico Soporte activado con epiclorhidrina con x jamóles de quelatos metálicos por mlilitro de gel. Histidina Instituto de Fermentaciones Industriales Centro de Investigaciones Biológicas. Ministerio de Agricultura Pescas y Alimentación Valor Actual Neto Tasa Interna de Retorno p-galactosidasa considerada nativa p-galactosidasa quimera con el dominio IMAC Demanda Química de Oxígeno
Introducción General 2
benignas donde los biocatalizadores sean estables durante muchos ciclos de reacción y los substratos tengan una elevada solubilidad, etc. Esta conversión de INTERESANTES PROCESOS POSIBLES en REALIDADES INDUSTRIALES SOSTENIBLES es un problema realmente apasionante, pues nos obliga a optimizar procesos químicos difíciles (regioselectivos, esteroespecíficos, etc) sobre compuestos químicos poco manejables (p.e. substancias bioactivas lábiles y difíciles de disolver) y catalizados por bio-macromoléculas a su vez lábiles y muy complejas (las enzimas).
Así pues, parece bastante obvia la necesidad de mejorar enormemente las propiedades de las enzimas y los sistemas de reacción antes de que se pueda explotar masivamente su enorme potencial industrial.
Siguiendo los criterios de la evolución natural de las enzimas de organismos termófilos se han ido haciendo termo-resistentes. En este caso el criterio de selección biológica coincide en principio con los intereses de la industria química. Además la termoresistencia de las enzimas de termófilos esta muchas veces asociada con una mayor resistencia a otros agentes inactivantes diferentes del calor, pe., los disolventes orgánicos. En principio las enzimas de termófilos parecen excelentes candidatos como catalizadores industriales. En numerosas ocasiones, las enzimas de termófilos muestran un extraño comportamiento de actividad con la temperatura, presentando muy baja actividad a temperaturas bajas o moderadas (pe. temperatura ambiente). Por ello a pesar de su gran estabilidad, las enzimas de termófilos presentan también algunas limitaciones de aplicación industrial. El estudio de este complejo comportamiento actividad-temperatura y su posible solución constituye uno de los hitos mas interesantes de la biotecnología enzimática pues permitiría el uso masivo de estas enzimas, con una excelente termo-resistencia, en todo tipo de aplicaciones analíticas e industriales. Sin embargo, muchos procesos enzimáticos industriales pueden o deben realizarse a temperaturas altas (reacciones con substratos hidrofóbicos para aumentar su solubilidad, química de alimentos para prevenir contaminaciones y para acoplarse a procesos de esterilización, etc). En estos casos las enzimas de organismos termófilos pueden ser una excelente solución como biocatalizadores industriales. Muchas enzimas de termófilos de interés industrial son enzimas minoritarias dentro organismos difíciles de crecer y por ello hasta hace unos pocos años su aplicabilidad industrial era bastante improbable. Hoy en día, gracias a las técnicas de ingeniería genética, estas enzimas minoritarias de termófilos se pueden super-expresar en organismos hospedantes muy fáciles de crecer y se pueden obtener en muy grandes cantidades susceptibles de ser aplicadas como catalizadores industriales.
Introducción General 3
La super-expresión de enzimas de termófilos recombinantes como proteínas extracelulares en hospedantes mesófilos podría simplificar mucho su extracción y purificación. Estas proteínas recombinantes extracelulares podrían ser extraídas con un elevado grado de pureza a partir del sobrenadante del tanque de fermentación. Posteriormente estas enzimas de termófilos expresadas en organismos mesófilos, se podrían purificar posteriormente por tratamiento térmico: las proteínas de mesófilos precipitarían mayoritariamente durante el tratamiento térmico y en cambio las enzimas de termófilos lo resistirían con facilidad. Este método de purificación es muy sencillo y de bajo coste, podría ser muy útil para purificar enzimas industriales de uso en química orgánica donde la purificación total de la enzima no suele ser necesaria. Sin embargo, si nuestra enzima recombinante es intracelular o si ha de utilizase en química de alimentos, química analítica etc. necesitamos mejorar mucho mas la purificación, hasta obtener enzimas 100 % puras y al mismo tiempo con un precio muy asequible. Por ejemplo, los alimentos son mezclas complejas de muchísimas substancias y necesitamos estar seguros de que la única enzima presente en los birreactores de tratamiento sea la enzima de interés. La presencia de otras enzimas con otras actividades catalíticas (p.e. proteasas, esterasas, lipasas, oxidasas, etc) podría modificar la estructura de otros componentes del alimento y modificar sus propiedades de un modo que nosotros no queremos modificar. La adición de una cola de 6 His en uno de los extremos de una enzima de interés industrial puede ser un método muy interesante de preparar la enzima recombinante para una purificación total por cromatografía de afinidad sobre quelatos metálicos. La adición de una pequeña cola de 6 His es una modificación muy pequeña de la enzima recombinante y en principio no debiera producir cambios importantes en su estructura y su función {actividad- estabilidad, etc). Sin embargo esta cola de 6 His (si queda suficientemente expuesta al exterior de la proteína recombinante) va tener una alta afinidad hacia columnas cromatográficas de quelatos metálicos. En principio, una afinidad mucho mayor que las que poseen las proteínas naturales producidas por el organismo hospedante. Así, a escala laboratorio podríamos adsorber tanto las proteínas naturales como la proteína recombinante a matrices de quelatos metálicos comerciales. Posteriormente se irían eluyendo, p.e., con un gradiente de imidazol, primeramente las proteínas naturales y posteriormente las proteínas recombinantes con un muy elevado grado de pureza. En la presente Tesis Doctoral discutiremos, en uno de sus capítulos, la optimización de estos procesos cromatográficos, pensando en su posible utilización industrial e intentando lograr también la selectividad en el primer proceso de adsorción de la enzima recombinante y las proteínas naturales sobre matrices cromatográficas diseñadas a medida.
Introducción General 5
6.- p-GALACTOSIDASAS DE TERMÓFILOS
En este contexto, la búsqueda de nuevas p-galactosidasas que serán posiblemente nnuy activas y estables a elevadas temperaturas, y que quizás pudieran presentar menores niveles de inhibición por los productos, tendría una especial relevancia. La hidrólisis de lactosa podría realizarse directamente a la salida del esterilizador, a temperaturas de unos 55-60°C, evitando la contaminación microbiana y manteniendo estéril tanto la leche como el derivado, logrando elevadas velocidades de reacción y prolongados periodos de utilización del derivado.
7.- LA BIOTECNOLOGÍA ENZIMATICA: UNA NUEVA Y COMPLEJA ÁREA DE LA INGENIERÍA Y TECNOLOGÍA QUÍMICA PARA EL DESARROLLO DE NUEVOS PROCESOS Q U Í M I C O S INDUSTRIALES MÁS EFICACES, MÁS SELECTIVOS Y MÁS SOSTENIBLES.
Las enzimas catalizan procesos químicos y su posible utilización industrial para el diseño de nuevos procesos químicos más efectivos y más sostenibles constituye uno de los retos más apasionantes de la Ingeniería Química actual. Sin embargo el origen biológico de las enzimas y las enormes posibilidades que ofrecen las modernas técnicas de biología molecular y bioquímica para mejorar las propiedades de las enzimas como catalizadores de procesos químicos industriales hace que esta nueva área de la ingeniería química tenga que desarrollarse forzosamente desde un enfoque muy integral y un desarrollo complejo y multidisciplinar. De hecho, es muy significativo el hecho de que hoy en día los Departamentos de Ingeniería Química mas importantes de mundo, cuenten con muy buenos laboratorios de Biología Molecular (POR, ADN recombinante) y de este modo pueden abordar con mayores posibilidades de éxito en el diseño de estos nuevos procesos químicos industriales catalizados por enzimas. La presente Tesis Doctoral pretende incluirse dentro de este esquema de trabajo, nuestro objetivo principal es un problema eminentemente químico: la hidrólisis específica y selectiva de lactosa en leche (modificando solo la lactosa y dejando intactos todos los demás componentes de la leche y produciendo únicamente glucosa y galactosa evitando la formación de subproductos tóxicos). Sin embargo para resolver este problema químico, o al menos para proponer diferentes soluciones a este problema, hemos de utilizar una serie de disciplinas científicas en principio y hasta hace unos años muy distantes entre si: a.- la utilización de técnicas de ADN recombinante para mejorar la producción y purificación del catalizador en forma soluble, b.- el diseño de nuevas fases estacionarias cromatográficas para mejorar la purificación de las enzimas, c - el diseño de nuevos y mejores protocolos de inmovilización y estabilización de estos catalizadores basados en el conocimiento de su reactividad química, así como de sus características estructurales y funcionales.
Introducción General 6
Así pues, esta Tesis, dirigida esencialmente a la solución de un problema de Ingeniería Química precisa de la utilización multidisciplinar de técnicas de Microbiología, Biología Molecular, Ciencia de Materiales, Bioquímica, Biofísica, Química de Proteínas, Enzimología, etc, imprescindibles para efectuar un planteamiento mas efectivo de este "problema de ingeniería química" y lograr unos resultados mas prometedores.
Objetivos Generales 8
i.- Protocolos de inmovilización covalente multipuntual y multisubunidades para lograr que la enzima una vez inmovilizada sobre el soporte sea más estable que la enzima nativa.
ii.- Protocolos de estabilización completa de la estructura cuaternaria de la enzima, para intentar aumentar la estabilidad térmica de la enzima y en todo caso, evitar cualquier liberación de subunidades de la enzima al alimento tratado (lectie).
iii.- Diseño de protocolos combinados para la purificación, inmovilización y estabilización de esta enzima multimérica utilizando una única técnica de inmovilización sobre soportes heterofuncionales quelato metálico- epóxido.
iv.- Diseño de protocolos de inmovilización y estabilización por adsorción física multi- subunidades de la enzima sobre soportes muy rígidos recubiertos de una película polimérica de poli-etilenimina. Aprovechando que esta enzima termófila ya tiene "per se" una estabilidad térmica muy interesante, diseñaremos este nuevo tipo de inmovilizaciones que presentan una importante ventaja económica, ecológica y tecnológica: los soportes se pueden reutilizar indefinidamente sin producir ningún residuo industrial indeseable. Aliora, la enzima, aunque no se desorba de los mismos soportes durante su utilización industrial, si se podría desorber en condiciones moderadamente drásticas (inocuas para el soporte) una vez que alcanzado los niveles de actividad mínimos para su utilización industrial.
d.- Estudio del proceso de hidrólisis de lactosa por los diferentes derivados inmovilizados de la IMAC/p-ga!actosidasa de Thermus sp., T2.
Se estudia el proceso de hidrólisis de lactosa por diferentes derivados inmovilizados de esta p-galactosidasa termófila. Se estudiará la hidrólisis de disoluciones modelo de lactosa y de diferentes derivados lácteos (leche, suero de queserías, etc.). En todos los casos se prestará especial atención a la inhibición de la hidrólisis enzimática por los productos de la reacción (galactosa y glucosa). Se evaluarán estos efectos inhibitorios en la enzima soluble y en los diferentes derivados inmovilizados de la enzima. Una inhibición muy fuerte (similar a la que se produce con las p-galactosidasas comerciales existentes) limitaría la aplicabilidad industrial de la enzima en estos procesos ya que hace muy difícil la eliminación total de la lactosa.
e.- Escalado económico comparativo de procesos industriales que operan con lactasas libres y procesos que operan con derivados inmovilizados de lactasas. Se estudia la viabilidad del cambio de procesos tradicionales que operan con lactasas libres por otros que lo "deben" hacer con derivados inmovilizados de la enzima de termófilo. Se analizan parámetros económicos que puedan predecir la viabilidad o no de su aplicación. Se hace un pequeño estudio de los costes de inversión que deben acompañar este cambio.
Capitulo 1 - Extracción 9
IMAC/p-GALACTOSIDASA DE Thermus sp. CEPA T2.
En este capítulo se describe el trabajo realizado dentro del marco de la presente tesis doctoral, consistente en el empleo de técnicas de microbiología molecular e ingeniería genética para la producción de la quimera proteica IMAC/p-galactosidasa en el microorganismo mesófilo Escheríchia co//cepa MC 1116, a partir de la p-galactosidasa (EC 3.2.1.23) del microorganismo termófilo Thermus sp. 12.
El gen de la p-galactosidasa de Thermus sp. T2 liabía sido clonado y expresado con anterioridad en Escheríchia coli por otros autores, con fines científicos y no comerciales (Koyama y col., 1990). Este antecedente permitía augurar el éxito en la producción de diclio enzima de un termófilo en un mesófilo, lo cual fue tenido muy en cuenta por nosotros para los trabajos posteriores realizados con él, incluidos en la presente memoria. Además, este hectio permitiría reducir costes de producción de la enzima, caso de que la experimentación se desarrollase con éxito ya que la incubación de Escheríchia coli MC 1116 es más sencilla por no tiacerse a 70°C, que es la temperatura óptima de crecimiento de Thermus sp. 12, y por no requerirse medios de cultivo microbiológicos especiales para dicha cepa. La cepa de la que provenía dicfio gen, Thermus sp. 12, fue aislada con anterioridad por otros autores en aguas termales del Parque Nacional de Yellowstone, mostró una temperatura óptima de crecimiento de 70°C, en agitación y pH 7,7 y actividad p-galactosidásica, con un óptimo a 80°G y pH 5 (Ulricii y col., 1972). La cepa, por sus características morfológicas y de cultivo, fue en principio adscrita a la Thermus aquaticus, en principio única especie reconocida de este género según Brock (1984). Recientemente ha sido propuesta su adscripción a la especie Thermus oshimai" (Ishiguro, M. y col. 2001), en base al estudio comparativo de la secuencia del ARN 16S. La cepa Thermus sp., 12 se encuentra depositada en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC 27737).
El gen de la p-galactosidasa de Thermus sp. 12 (Koyama y col., 1990), fue empleado para desarrollar un procedimiento para producir la p-galactosidasa de Thermus sp. T2 en E. coíi, y purificaria en un solo paso cromatográfico (Vián y coi., 1998). Así se pensó resolver al mismo tiempo las dificultades tecnológicas que, como hemos mencionado anteriormente, tienen las p-galactosidasas comerciales en el sentido de su falta de pureza.
Para llevar a cabo el desarrollo del sistema anterior se estudió la secuencia de nucleótidos que codifica para la producción de la p-galactosidasa de Thermus sp. 12. Se partió del plásmido pOS103. Como ya ha sido comentado, previamente se sabía que el plásmido
