UNIVERSITAT DE VALÈNCIA
DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR
GRADO EN QUÍMICAS
PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y QUÍMICA
BIOLÓGICA
Curso 2015-2016
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Bioquímica 05 2016, Exámenes de Bioquímica
Cuadernillo laboratorio bioquimica 2016
Tipo: Exámenes
2015/2016
1 / 19
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UNIVERSITAT DE VALÈNCIA
DEPARTAMENT DE BIOQUÍMICA I BIOLOGIA MOLECULAR
GRADO EN QUÍMICAS
PRÁCTICAS DE BIOQUÍMICA Y QUÍMICA
BIOLÓGICA
Curso 2015 - 2016
V
máx
Km( 1 +[I]/KI)
Km
sin I
con I
v
[S]
E + S ES E + P
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KI
ÍNDICE
Consideraciones generales 1 Guión de prácticas Práctica 1: Actividad enzimática fosfatasa alcalina 2 Práctica 2: Obtención y cuantificación de DNA 7 Práctica 4: Metabolismo de hidratos de carbono 13 Práctica 3: Análisis de estructuras de proteínas y ácidos nucleicos CONSIDERACIONES GENERALES Seguridad y trabajo en el laboratorio Los laboratorios están considerados como sitios de trabajo peligrosos y los usuarios deben ser conscientes de los riesgos potenciales y de cómo actuar en un caso de urgencia. Es necesario llevar bata, preferiblemente de algodón, para protegerse de los productos químicos. Como protección personal se utilizarán, cuando sea necesario, gafas de seguridad, guantes y máscara. En el laboratorio no se debe comer, ni beber, para evitar el peligro de un envenenamiento por contacto accidental con algún producto venenoso. Es necesario limpiar el material antes y después de usarlo. El material de vidrio debe ser manipulado con precaución para evitar roturas. Nunca deben pipetearse las disoluciones con la boca, sino con ayuda de una propipeta. No pipetear nunca directamente del frasco de agua destilada. Se recomienda fijarse en el nombre de las disoluciones y productos antes de utilizarlos. Hay que manejar con precaución las sustancias peligrosas: ácidos, disolventes orgánicos y productos tóxicos. Los productos peligrosos no deben verterse en las pilas. En el laboratorio existen recipientes adecuados para la recogida de los residuos peligrosos (bromuro de etidio, etc.). Además de éstos, en el laboratorio también hay recipientes para la recogida de los fragmentos de vidrio en el caso de roturas. Para verter las disoluciones no peligrosas a la pila abrir el grifo y dejar correr el agua antes de tirarla. Elaboración y presentación de resultados El objetivo del trabajo de laboratorio es la comunicación de ideas y resultados de una forma comprensible. La redacción de un trabajo práctico (objetivos, desarrollo, resultados, discusión y conclusiones) es un buen ejercicio para la redacción de una publicación científica. Es necesario llevar un cuaderno de laboratorio que conviene que sea rígido y forrado. Los cuadernos de hojas sueltas (de anillas) son prácticos, ya que permiten la inserción de resultados experimentales, si bien se corre el riesgo de perder hojas. La redacción de los experimentos debe hacerse con suficiente detalle como para permitir su reproducción experimental si fuera necesario. La presencia de esquemas de los aparatos o de los procesos de purificación, junto con figuras que ilustren resultados experimentales (como por ejemplo una electroforesis), puede dar mucha más información que una larga descripción en el texto. Los resultados experimentales se resumen en forma de tabla o de gráfica. Las tablas deben nombrarse ordenadamente en el texto (Tabla 1, Tabla 2, etc.) y deben tener un título. En algunos casos, además, puede resultar interesante dar detalles adicionales en forma de una leyenda colocada debajo del título. Las unidades en que se expresan los resultados deben darse en la parte superior de cada columna (y nunca en cada línea de cifras). Estas unidades deben elegirse de manera que se presente un número limitado de cifras (por ejemplo, una concentración de 0.0072 mol/L se escribe más fácilmente 7.2 expresando la concentración en "mmol/L", o 72 utilizando "10^4 x concentración (mol/L)").
PRÁCTICA 1
REPRESENTACION Y ANÁLISIS DE ESTRUCTURA DE MACROMOLÉCULAS
La información relativa a esta práctica se encuentra en el siguiente link:
www.uv.es/bbm/bqq
PRÁCTICA 2
ESTUDIO DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA FOSFATASA ALCALINA
Las enzimas son catalizadores específicos y potentes que hacen posible la coexistencia de un elevado número de reacciones químicas dentro de la célula. En la mayoría de los casos son de naturaleza proteica, pero también se conocen algunos que son RNA. El mecanismo de cinética enzimática más simple es el representado por la ecuación de Michaelis-Menten, que explica el fenómeno de saturación. Las fosfatasas alcalinas (PA) son enzimas (ortofosfórico-monoéster-hidrolasas), ampliamente distribuidas en organismos tanto procariotas como eucariotas, responsables de eliminar grupos fosfato de una variedad de moléculas como nucleótidos, proteínas y alcaloides. En tejidos animales, se localizan en la membrana y son particularmente abundantes en huesos, hígado, placenta, intestinos y riñón; el aumento o disminución de PAs en plasma sanguíneo tiene significado clínico. La PA de Escherichia coli es un metaloenzima dimérico (Mr del monómero 94 000 ) con 2 átomos de Zn y 1 de Mg por monómero. Se ha determinado la estructura tridimensional de la enzima y se sabe que el residuo de Ser que se fosforila reversiblemente y transitoriamente durante la catálisis se localiza cerca de los sitios de unión de los metales, en un bolsillo donde cabe el fosfato inorgánico, que puede actuar como inhibidor de la reacción. La enzima activa se localiza en el espacio periplásmico y cataliza la hidrólisis inespecífica de ésteres del ácido fosfórico, sustancias que normalmente son incapaces de atravesar la membrana plasmática. La síntesis de la enzima aumenta cuando las células crecen en medios deficientes en fosfato, lo que explica la función de la enzima para suministrar fosfato inorgánico a la bacteria. La acción de la fosfatasa alcalina sobre un sustrato artificial incoloro como el fosfato de p-nitrofenilo origina fosfato inorgánico (Pi) y un producto de color amarillo que absorbe luz visible de 400 nm y con un
coeficiente de extinción molar (ε) de 1,7· 104 M-^1 cm-^1. Aquí utilizaremos la colorimetría, una técnica
espectroscópica, para realizar los análisis cinéticos de una enzima. El objetivo es la obtención de los valores de velocidades iniciales de reacción catalizada por la fosfatasa alcalina de E. coli en ausencia y en presencia de fosfato inorgánico, un inhibidor de la enzima. A partir de la representación gráfica de los dobles inversos (Lineweaver-Burk) se determinarán los parámetros cinéticos (constante de Michaelis , Km, y Vmàx). También se calculará el valor de la constante de disociación del inhibidor (Ki). Protocolo experimental
1. Materiales y reactivos - Colorímetro - Cubetas de plástico de 1 mL (10 por pareja) - Pipetas Pasteur de plástico - Pipetas automáticas: P200 y P - Inhibidor: Fosfato sódico 3 mM (0,5 mL por pareja) - Tampón del medio de reacción: Tris-HCl 2 M pH 8, - Sustrato (1 mM): Fosfato disódico de p-nitrofenilo (Sigma 104-0) conservado a - 20 ºC. Se disuelve 11,1 mg en 30 mL de agua poco antes de utilizarlo (3 mL por pareja de estudiantes). - Enzima fosfatasa alcalina (Sigma P 4377, 100 U). Se mezclan 230 μL de enzima con 35 mL de tampón 10 mM Tris pH 8,0 (2 mL por pareja). 2. Procedimiento Para los análisis cinéticos en ausencia y en presencia del inhibidor se procederá preparando directamente en las cubetas las mezclas de reacción añadiendo en el orden que se indica a la Tabla 1 y Tabla 2, respectivamente, la cantidad (mL) de los componentes de la mezcla.
2. Contesta verdadero o falso, y razona brevemente la respuesta: “La pendiente de la gráfica en la que se representa la velocidad inicial de reacción (vo, M/s ) en función de la cantidad de enzima (M) nos permite determinar la constante de Michaelis.”
3. Considera la reacción catalizada por una enzima A → B, donde A es un sustrato de color amarillo con
una absorción máxima a 420 nm y B es un producto de color verde con un máximo de absorción a 560 mm. (a) Propón dos métodos para determinar la velocidad de reacción enzimática a una concentración fija de enzima y a concentración saturante de sustrato. (b) ¿Qué harías para expresar la velocidad inicial de reacción en moles de B formados x L-^1 x min-^1?
4. Con el objeto de determinar la velocidad inicial de la reacción enzimática S →P se ha medido la
variación de la absorbancia a 530 nm (máximo de absorbancia de S) en función del tiempo, obteniéndose los resultados que se muestran en la siguiente tabla. Utilizando los datos de la
tabla, y sabiendo que el ε1M^ del sustrato de la reacción es
- 000 M-^1 cm-^1 , mediante la representación gráfica correspondiente calcula la velocidad inicial de la reacción. t (min) A 530 1 1, 2 0, 3 0, 4 0, 5 0,
NOTAS
- Muestras de electroforesis: Disoluciones de DNA plasmídico nativo y lineal (fragmentado con endonucleasas de restricción), de DNA del fago λ y de una mezcla de DNAs de diferentes tamaños (DNA patrón: GeneRuler 1kb plus DNA ladder, SM1334, Fermentas) preparadas en disolvente de muestras de electroforesis.
- Disolvente de muestras de DNA (6X): 0,25% (p/v) azul de bromofenol, 0,25% (p/v) xileno- cianol y 30 % (v/v) glicerol en tampón Tris-HCl 60 mM, EDTA 6 mM, pH 7,5; y disolvente 2X. 2. Procedimiento
2.1. Obtención del DNA
2.1. a. Obtención del DNA cromosómico de timo de ternera
En un primer paso se procede a la ruptura de las estructuras celulares, seguidamente se disocian los
complejos nucleoproteicos utilizando una disolución concentrada de NaCl, un detergente y disolventes
orgánicos. Por último, se purifica el DNA por precipitación.
Se homogeneizan 12 g de timo de ternera troceado con 150 mL de tampón Tris 0.01 M, pH 7.5, en un homogeneizador Osterizer (5-10 min, posición BLEND del aparato o bien, al nº 1 durante 7 minutos). Se transvasa a un erlenmeyer de 250 mL y se agita durante 5 min. Se añaden 17 mL de SDS al 10% (p/v) en etanol al 50% (v/v) con el objeto de conseguir una concentración final en SDS del 1% (p/v). Se agita con suavidad durante 5-10 min. A cada uno de los grupos se le da 10 mL de esta mezcla con el objeto de continuar la extracción. A cada alícuota de 10 mL se le añade, en un erlenmeyer de 100 mL, 1 volumen (10 mL) de cloroformo: alcohol isoamílico (3:1, v/v). Una vez bien tapado el erlenmeyer se agita con la mano enérgicamente, durante 10- 15 min hasta obtener una mezcla homogénea. Se centrifuga en un tubo a 4000 rpm durante 10 min. La fase acuosa superior opalescente se traspasa a un erlenmeyer de 100 mL. Se añaden 20 mL de NaCl 10% (p/v) y se mezcla. Se añade 1 volumen (unos 25 mL) de etanol frío y se enrollan las fibras de DNA sobre una varilla de vidrio.
2.1. b. Obtención de un DNA plasmídico de Escherichia coli
Se utiliza un método rápido de extracción, que consiste en romper las estructuras celulares y degradar
el RNA en un primer paso, produciendo después la desnaturalización de las distintas macromoléculas.
Esto permite separar el DNA plasmídico por centrifugación. Con este procedimiento se obtiene en muy
poco tiempo un DNA plasmídico parcialmente purificado, que puede ser analizado mediante
electroforesis en gel de agarosa, e incluso digerido con endonucleasas de restricción.
En un tubo eppendorf se prepara un cultivo de la cepa bacteriana de E. coli que contiene el plásmido Bluescript (pBS) de 3.0 kpb, inoculando una colonia en 1.5 mL de medio LB con ampicilina. Se incuba a 37 °C durante 16 h. El cultivo obtenido se centrifuga a 5000 rpm durante 5 min, a temperatura ambiente, en una microcentrífuga. Se decanta el sobrenadante y el sedimento celular se resuspende en 50 μL de tampón de lisis. Se agita brevemente con el vortex, y se incuba a 95 °C durante 1 min. Se pasa a hielo y se incuba 1 min. Finalmente se centrifuga durante 20 min en la microcentrífuga, a máxima velocidad, y a temperatura ambiente. Se toma el sobrenadante, con cuidado de no arrastrar el sedimento, y se pasa a un microtubo eppendorf limpio. Para analizar el DNA obtenido mediante electroforesis en gel de agarosa (véase apartado 2.2) se toma una alícuota de 5 μL, se pasa a otro microtubo, y se le añaden 5 μL de disolvente de muestra (2X).
1.2. Electroforesis de DNA en gel de agarosa
La agarosa es un polímero lineal que se extrae de algas y que está constituido por la unidad disacárida
básica: D-galactosa-3,6-anhidro-L-galactosa. Los geles de agarosa se utilizan como soportes
restrictivos de electroforesis debido a su elevada porosidad.
Cuando se aplica un campo eléctrico a través de un gel de agarosa, el DNA que está cargado
negativamente a pH neutro, si bien con una relación q/m constante, se desplaza hacia el ánodo a una
velocidad que depende de diferentes parámetros: el tamaño (número de pares de bases) y la
conformación del DNA (superenrollado, circular, lineal), la concentración de la agarosa (tamaño del
poro), la composición del tampón, el voltaje aplicado, etc.
Se funde la agarosa, preparada al 0.8% (p/v) en el tampón de electroforesis (0.5XTBE). Se preparan 75 mL para todo el grupo. Una vez enfriada a 60 °C se le añade el bromuro de etidio a 0.5 μg/mL y se vierte en el soporte donde formaremos el gel. Sobre este soporte habremos colocado previamente un molde con el objetivo de que, al gelificar la agarosa, se formen los pocillos donde aplicaremos las muestras de DNA. El gel, una vez preparado, se sumerge en la cubeta, de manera que quede completamente cubierto por el tampón (ver figura adjunta). A continuación se aplican las muestras de DNA que contienen:
- DNA plasmídico nativo (superenrollado y, en menor proporción, circular relajado)
- DNA plasmídico lineal (digerido con un enzima que corta en un único sitio)
- DNA plasmídico linearizado y fragmentado (digerido con un enzima que corta en dos sitios)
- Patrón de tamaños de DNA ( GeneRuler 1kb plus DNA ladder, SM1334, Fermentas y fago λHind III)
- Diferentes cantidades de DNA del fago λ
- Una muestra de cada uno de los DNAs plasmídicos obtenidos en la sesión Se conecta la cubeta de electroforesis a una fuente de alimentación a unos 5 V/cm durante aproximadamente 1 h. (o más tiempo, a unos 80 V, hasta que el colorante esté a un dedo y medio del extremo inferior del gel). Finalizada la electroforesis se realiza una foto del gel colocado sobre un transiluminador de luz ultravioleta (UV), con la finalidad de observar la fluorescencia debida a la intercalación del bromuro de etidio entre las bases nitrogenadas del DNA. Justificar la movilidad electroforética de cada una de las formas de DNA plasmídico analizadas (superenrollada, circular y lineal). Estimar el tamaño del plásmido y el de cada uno de los fragmentos obtenidos mediante digestión con las endonucleasas de restricción, comparando con la movilidad del patrón de tamaños moleculares. Estimar la cantidad de DNA plasmídico, comparando para ello con diferentes cantidades de DNA fágico.
CUESTIONES PRÁCTICA 2
1. Explica cómo prepararías 100 mL de las siguientes disoluciones: (a) Cloroformo:alcohol isoamílico 3:1 (v:v) (b) SDS al 10% (p/v) en etanol al 50% (v/v)
2. Explica para qué se usan los siguientes reactivos, instrumentos y técnicas: (a) Gel de agarosa (b) Bromuro de etidio (c) Lámpara de luz UV (d) Etanol (e) Fuente de electroforesis (g) Homogeneizador Osterizer 3. Contesta verdadero o falso, y razona brevemente la respuesta: (a) El bromuro de etidio se emplea para teñir proteínas en electroforesis porque se intercala entre los aminoácidos. (b) El plásmido superenrollado, por ser más compacto y ocupar menos volumen que el plásmido circular relajado, se desplaza más en una electroforesis en gel de agarosa. (c) La forma lineal de un plásmido migra en electroforesis en agarosa con mayor movilidad electroforética que la superenrollada. 4. Has aislado DNA de células bacterianas. Explica brevemente cómo determinarías la concentración de DNA en la disolución. 5. En la figura se muestra un gel de electroforesis en agarosa donde se han aplicado diferentes muestras (en un orden distinto al siguiente):
- Un plásmido nativo (muestra A)
- El plásmido digerido con un enzima de restricción que corta en un solo sitio (muestra B)
- El plásmido digerido con otro enzima de restricción que corta en dos sitios (muestra C)
- Patrón de tamaños moleculares (muestra D) (a) Indica en la figura las carreras correspondientes a las muestras A, B, C y D. Justificando la elección. (b) Justifica la movilidad de los fragmentos de DNA del patrón de tamaños moleculares. (c) ¿Cuál es el tamaño del plásmido? Justifica la respuesta. (d) Indica para la carreras 2, 3 y 4, las características de las moléculas de DNA que dan lugar a cada una de las bandas mostradas (en especial lo que hace referencia a su tamaño y conformación).
NOTAS
Protocolo experimental
1. Materiales y reactivos
- Levadura de panadería - Tejido hepático de conejo
- Sacarímetro - Centrífuga
- Colorímetro - Baño a 100 °C
- Tubos de vidrio de centrífuga (2) - Pinzas de acero inoxidable y tijeras
- Tubos de ensayo y bolas de vidrio (7) - Pipetas de 1, 2, 5 y 10 mL y propipetas
- Varilla de vidrio - Vaso de precipitados de vidrio de 50 mL
- Tijeras - Pipeta automática de 1 mL y puntas
- Etanol absoluto frío - KOH (300 g/L)
- Na 2 SO 4 saturado - HCl 1.2 M
- NaOH 0.5 M - Glucosa 2.5 mM (0.46 g/L)
- Glucosa al 1% (p/v) (recién preparada) en tampón acetato 0.2 M, pH 5.5 desgasificado
- Tampón acetato 0.2 M, pH 5.5 (6.06 g de acetato sódico y 0.39 mL de ácido acético glacial en 250 mL de agua)
- Reactivo 3,5-dinitrosalicilato (3,5-DNS) (disolver 5 g de 3,5-DNS en 300 mL de agua destilada a 50 ºC mediante agitación; una vez mezclado añadir 50 mL de NaOH 4 M; añadir 150 g de tartrato sódico-potásico y disolver; completar hasta 500 mL y si aparece precipitado filtrar)
2. Procedimiento
2.1. Fermentación alcohólica de la glucosa Se prepara una suspensión de 2 g de levadura en 20 mL de glucosa al 1% (p/v) en un vaso de vidrio de 50 mL. Se mezcla rápidamente con una varilla e inmediatamente después, con ayuda de una pipeta, se vierten 14 mL en el sacarímetro con la precaución de que el tubo esté completamente lleno. Tomar nota de la aparición de burbujas y de la formación de CO 2 (volumen de líquido desplazado en el sacarímetro) a lo largo del tiempo, cada 10 min hasta recoger entre 5-7 mL.
Hacer una representación gráfica de los mL de gas (CO 2 ) producidos (en ordenadas) frente al tiempo (min, en abscisas). Discutir los resultados. 2.2. Cuantificación del glucógeno en tejido hepático En un primer paso, se obtiene el glucógeno a partir del tejido hepático de conejo. A continuación, se procede a hidrolizar este glucógeno con el objetivo de determinar la cantidad de glucosa que contiene mediante reacción colorimétrica con el 3,5-DNS. 2.2. a. Obtención del glucógeno En un tubo de centrífuga, se colocan 0.7 g de hígado. Se añaden 2 mL de KOH, se tapa con una bola de vidrio y se calienta en un baño en ebullición durante 20 min, agitando de vez en cuando la mezcla. Se enfría el tubo en hielo. Se añaden 0.4 mL de Na 2 SO 4 saturado y 5 mL de etanol absoluto frío. Se mezcla bien, tapando el tubo con parafilm. Se deja reposar 5 min en hielo. El glucógeno precipitado se recoge en el sedimento de la centrifugación a 3000 rpm durante 10 min. El sobrenadante se separa por decantación. El glucógeno precipitado se disuelve añadiendo agua: 1 mL. Si es necesario, calentar suavemente hasta la disolución completa del glucógeno. 2.2. b. Hidrólisis del glucógeno A la disolución de glucógeno preparada en el apartado anterior (en el mismo tubo de centrífuga) se le añaden 1.5 mL de HCl 1.2 M, se tapa con una bola de vidrio y se calienta a 100 °C durante 30 min. Una vez enfriado el tubo se añaden 4 mL de NaOH 0.5 M para neutralizar la disolución. 2.2. c. Determinación de la glucosa liberada del glucógeno Se trata de determinar la cantidad de glucosa presente en la muestra de glucógeno hidrolizado utilizando el reactivo 3,5-dinitrosalicilato (3,5-DNS) y comparando la absorbancia a 540 nm de la disolución problema con la de tubos que contienen cantidades conocidas de glucosa (curva patrón, ver la tabla). Volumen (mL) Tubo glucosa 2,5 mM H 2 O mg glucosa A 540 1 0,0 2, 2 0,2 1, 3 0,5 1, 4 1,0 1, 5 1,5 0, 6 2,0 0, Una vez preparados los tubos de la tabla anterior, en otro tubo de ensayo (tubo 7 ) se colocan 2 mL de la muestra de glucógeno hepático hidrolizado. A todos los tubos se les añade 1 mL del reactivo 3,5-DNS, se mezcla bien y se calienta a 100 °C durante 5 min. Tras enfriarse, se diluye añadiendo 3 mL de agua y se lee la absorbancia a 540 nm, utilizando el tubo 1 como blanco. Expresar los resultados en mg de glucosa por g de tejido.