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TEMA 4: ENZIMAS
1.- CONCEPTOS GENERALES
1.1.- Naturaleza química y función
En la célula, así como en el resto del organismo, transcurren una multitud de reacciones químicas que proporcionan a la célula energía y los componentes necesarios para su mantenimiento. Estas reacciones son demasiado estables en condiciones normales de manera que son incompatibles con la vida (sin catalizadores tardarían demasiado en producirse). Por eso mismo, los catalizadores son esenciales para la vida.
Los catalizadores que participan en reacciones biológicas se llaman biocatalizadores y se pueden dividir en enzimas (proteicas) y en ribozimas (moléculas de ARN con capacidad catalítica).
Concepto de enzima
Una enzima es una proteína especializada en la catálisis de una reacción química específica. Su modo de actuación, no afecta al equilibrio de la reacción catalizada, sino que reduce la energía necesaria de activación permitiendo que esta dure mucho menos.
Características generales (comunes con los catalizadores)
- NO cambian la Keq de una reacción química
- NO varían la ΔG asociada a la reacción
- (^) Al final de la catálisis recuperan su estado inicial, es decir no se consumen durante la reacción, lo que permite su uso reiterado.
Estructura de las enzimas
Composición proteica (puras o holoenzimas). Las holoenzimas son aquellas que necesitan otras moléculas para ser activas. Estan constituidas por:
- Apoenzima: parte proteica (no es activa por sí sola)
- Cofactor: parte no proteica que activa la apoenzima. Puede actuar permitiendo la unión enzima-sustrato o la catálisis del sustrato. Pueden ser F 0 E 0IONES INORGÁNICOS (como Fe 2+, Mg 2+, Mn2+^ , Zn2+, etc)
COMPLEJOS ORGÁNICOS (coenzimas): la mayoría son derivadas de vitaminas como el NAD pero pueden no serlo como el ATP.
** Cuando una coenzima (de manera más frecuente) o un ión metálico queda unido
covalentemente a la apoproteina recibe el nombre de GRUPO PROSTÉTICO.
Las enzimas presentan un C ENTRO ACTIVO (región de unión al sustrato y donde se produce la catálisis). Este contiene grupos químicos (cadenas laterales de aminoácidos) que fijan al sustrato y grupos químicos específicos implicados en la catálisis. Además, la unión es reversible y se establece mediante enlaces débiles. Este centro activo le proporciona la especificidad a la enzima.
Propiedades propias.
- ESPECIFICIDAD: son muy específicas en cuanto al tipo de reacción catalizada y en cuanto al sustrato. Pueden discernir y discriminar entre moléculas con estructuras similares. - De sustrato : absoluta (solo con un sustrato) o relativa (con un grupo de sustratos) - De grupo: Los sustratos deben poseer los químicos funcionales adecuados. - De óptica: Las enzimas son sensibles a la quiralidad del sustrato. Actúan solo sobre uno de los isómeros
- De acción: absoluta (solo puede realizar un determinado tipo de reacción)
- VERSATILIDAD : facilidad al cambio
- CONTROL: su actividad puede regularse
- EFICIENCIA: A un pH y a una temperatura óptimas tienen una actividad máxima (pasada esta se desnaturalizan como el resto de las proteínas).
1.2.- Nomenclatura y clasificación de las enzimas
1.2.1.- Nomenclatura La nomenclatura de las enzimas es una serie de 4 dígitos: X (clase). X (subclase). X (grupo químico específico). X (grupo químico específico)
1.2.2.- Clasificación de las enzimas Las enzimas se clasifican según la reacción que catalizan, así tenemos:
- Oxireductasas: Catalizan reacciones de óxido-reducción al adicionar o sustraer hidrógenos o electrones. EJ F 0 E 0catalasa (H 2 O 2 + H 2 O 2 F 0 E 0O 2 +2H 2 0)
- Transferasas: funcional (aldehídos,aminos,…) de un donante a un aceptor. No interviene agua. A-X + B F 0 F 3A + B-X Catalizan la transferencia de un grupo EJ F 0 E 0aminotransferasa o quinasa ( transfieren un grupo fosforilo del ATP a la molécula sustrato)
- Hidrolasas: T ransferencia de un grupo funcional al agua. Hidrólisis de enlaces mediante una molécula de H 20 EJ F 0 E 0A-B + H 2 O F 0 F 3A-OH + H-B
- Liasas: adición de grupo (amino,CO 2 ,agua) a dobles enlaces o formación de dobles enlaces por eliminación de grupos. EJ F 0 E 0 deshidratasas, descarboxilasas,SINTASAS, … A=B + X F 0 F 3AXB
- Isomerasas: Catalizar reacciones que implican una reorganización intramolecular EJ F 0 E 0MUTASAS (de un grupo funcional), EPIMERASAS (inversión a nivel de carbono asimétrico), …
- Ligasas: unión de dos grupos químicos a expensas de la hidrólisis de un enlace de alta energía, es decir, formación de enlaces con escisión de ATP. A + B + ATP F 0 E 0A-B + ADP + Pi C + D + ATP F 0 E 0C-D + ADP + PPi EJ F 0 E 0Sintetasas, carboxilasas…
- Oxireductasas: Catalizan reacciones redox (de transferencia de e -^ ). EJ F 0 E 0NAD peroxidasas, catalasa (catálisis del peróxido de hidrógeno)
1.2.3. Importancia de las enzimas
- La medida de la actividad enzimática en fluidos biológicos o tejidos sirve para el diagnóstico
de muchas enfermedades.
- Muchos fármacos actúan como inhibidores de la actividad enzimática
- Catalizan la mayoría de las reacciones biológicas relevantes para la vida
- Permiten un control coordinado de las rutas metabólicas
Dice que tanto la enzima como el sustrato sufren una alteración en su estructura por el hecho físico de la unión (el centro activo es complementario al estado de transición). De esta manera el sustrato se une al centro activo mediante enlaces débiles. Cuando se forman estos enlaces se libera una cantidad de energia (energia de unión) que disminuye la energia necesaria para llevar el sustrato al estado de transición. Posteriormente el sustrato tambié es forzado a adquirir una conformación más cercana a ala del estado de transición, mientras que la enzima sufre un cambio conformacional que contribuye a la especificidad de la interacción y que facilita la orientación. Finalmente el sustrato se convierte en producto. Esto fue demostrado con la hexoquinasa
Factores que contribuyen a rebajar la energía de activación en una reacción catalizada por una enzima: F 0 E 0
PREGUNTA TIPO EXAMEN
- Formación de enlaces entre enzima y sustrato
- Formación de estados de transición alternativos con menor energía de activación
- Orientación adecuada entre los grupos reactivos, facilitándose la adquisición del estado de transición
- MECANISMOS ESPECÍFICOS 2.1.4.- Mecanismos específicos.
- Catálisis general ácido-base Muchas reacciones suponen la formación de intermediarios cargados e inestables que tienden a descomponerse en reactivos, no pudiendo así reaccionar. Los intermediarios cargados se pueden estabilizar captando o transfiriendo protones para formar una especie que se descompone en productos más fácilmente que en reactivos. Varias cadenas laterales de aa pueden actuar de modo similar como dadores y aceptores de protones en el sitio activo de una enzima F 0 E 0Catálisis ácida: Cuando la enzima transfiere un protón al sustrato. F 0 E 0Catálisis básica: Cuando la enzima remueve un protón del sustrato Así, por ejemplo la Histidina es un aa bastante frecuente en el centro activo (pKa cadena lat.=6-7), de modo que se desprotona fácilmente a pH fisiológico.
- Catálisis covalente Algunas enzimas aumentan la tasa de reacción al formar complejos ES transitorios unidos mediante enlaces covalentes.
- Catálisis por iones metálicos.
- Sirviendo de enlace con el sustrato, lo cual permite su adecuada orientación en el sitio activo.
- Actúan como mediadores en las reacciones de óxido-reducción.
- Cambian la polaridad de ciertos enlaces del sustrato y favorecen el ataque nucleofílico.
- Estabilizan las cargas en un estado de transición inestable.
- (^) CINÉTICA DE LAS REACCIONES ENZIMÁTICAS
3.1. Cinética química. Velocidad y orden de la reacción
La cinética es la rama que estudia cómo afectan las velocidades de las reacciones. La velocidad de una reacción, se define como la aparición de producto (o desaparición de reactivo) a lo largo del tiempo. Depende de la [S], [E], pH, temperatura, fuerza iónica, activadores e inhibidores.
La velocidad inicial es el parámetro cinético para la reacción en un situación fácilmente especificada (concentraciones de cada reaccionante conocidas) que no depende de la concentración de esos reaccionantes ****La reacción inversa no tiene lugar, ya que a t=0 no hay productos presentes.**
La velocidad máxima depende de [E] total no de [S] “Vo= k2 [ES] Cuando [ES]= [E]total Vo= Vmax = k2 [E]total”
3.2 Efectos de los cambios de concentración del sustrato en la V inicial.
La velocidad cambiará aumentando de manera proporcional en bajas concentraciones
El orden de una reacción, se define como la relación entre la velocidad de transformación y la concentración de sustrato. Presenta valores de 0 a 3 (más de 3 es muy poco frecuente, pero posible). El orden de la reacción siempre coincide con el nº de reaccionantes.
Las enzimas presentan cinéticas de saturación a [S] elevadas : en un primer tramo de la reacción, la Velocidad de ésta reacción aumenta linealmente con la [S] (orden 1). A mayores [S], la V (^0) incrementará cada vez menos con incrementos iguales de [S] (orden 2) hasta que se alcance un punto en el que aunque añadamos más S, la V 0 NO variará (orden 0), es decir, se habrá alcanzado la Vmáx de la reacción. _Bajo condiciones de saturación, todas las moléculas de enzima intervienen en la formación del complejo ES._**
3.3 Efecto de la concentración de enzima en la V inicial
Vo= Vmax = k2 [E]total La actividad de una enzima se puede estudiar in vitro, bajo condiciones
controladas. Sí se
trabaja a pH y Tª constantes y bajo unas concentraciones de sustrato saturables, al variar la concentración de enzima, podremos observar como aumenta la [P] de la reacción. 3.3 Cinética de Michaelis-Menten
E + S F 0E 0ES F 0E 0 E + P Para conocer la velocidad en la proporción de enzima unida al sustrato, en esta
ecuación era muy difícil de aislar [ES], por eso Michaelis y Menten desarrollaron una fórmula para hallar
la velocidad en función de parámetros que se pueden conocer.
**** Vmax y Km es constante**
Se da en situaciones donde hay mucho más sustrato que enzima.
El modelo cinético de Michaelis-Menten parte de los siguientes supuestos:
- Existe un exceso de sustrato. La [S] es siempre mucho mayor a la [E] (^) total
- En el inicio de la reacción NO hay producto. De este modo, k (^) -2 ~ 0
- La [ES] en el estado estacionario se mantiene constante: la velocidad de formación de ES = v.
desaparición de ES K 1 [E] [S] = k-1 [S] + k-2 [S]
Así, finalmente se obtiene la ecuación de Michaelis-Menten, que relaciona la V 0 a la que trabaja una
enzima con la concentración de sustrato.
Km = Vmáx [S] / V 0 [S] V (^) máx= V 0 (·/+)[S] · K (^) m/[S]
_ También cabe destacar que V_** (^) máx de Michaelis-Menten es un valor teórico que nunca se
alcanza en la práctica
3.4 Representación gráfica de la Vo frente a la [S]según la ecuación de Michaelis-Menten
Cuando la [S] << Km Vo= Vmax·[s] /km
Cuando la [S] >> Km Vo= Vmax
Cuando la [S] = Km Vo= ½ Vmax
De manera que podemos deducir que el valor de km coincide con la concentración de sustrato a la cual el enzima trabaja a la mitad de la velocidad máxima. (no es = a la mitad de la V. Max.)
matemáticas se cambia la curva hiperbólica por una recta generada a partir de la inversa (1/x) de los valores.
Para calcularlo: 1- Nos darán unas velocidad y unas concentraciones, calcular la Vmax y la Km 2 - Si no nos dan el inverso, lo calculamos (1/x) y en papel milimetrado la representamos 3- Sabremos el inverso de Km y Vmax. Finalmente del inverso sacamos el número. (SAT)
_ poner unidades y qué representamos y dejar espacio antes del eje de las y_*
- Parámetros enzimáticos
a) Eficacia catalítica (Kcat): El número de recambio es el número de moléculas de sustrato
convertidas en producto por unidad de tiempo, cuando la enzima está saturada. K cat = Vmax / [E]Total
b) Eficiencia catalítica (Kcat/Km): constante cinética de segundo orden que describe la velocidad de la catálisis y la afinidad ES. La enzima es más eficiente cuanto más cercana sea su concentración a K1 (velocidad de unión ES) porque la enzima no va a catalizar aquello que no se le ha unido. Normalmente la enzima no está saturada y por eso es eficiente. _ Para saber [E] tengo que calcular la V. Max. Para asegurarse que la concentración de sustrato es saturada, hay que trabajar 10 veces el valor de Km._** c) Una unidad internacional. La actividad enzimática se expresa en unidad internacional que es la cantidad de enzima que cataliza la
transformación de un micromol de sustrato en un minuto ( μ mol/min). La
actividad enzimática es igual a la concentración de enzima d) La actividad específica Es la actividad de la enzima dividido por los mg de proteína (micromols/min·mg). Esta aumenta duran la purificación de una enzima, es decir, cuanto más puro es, mejor ya que más gramos de proteína tenemos. La purificación consiste en no estar mezcladas con muchas otras enzimas diferentes, cosa que dificultaría la unión al sustrato.
- REGULACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA. 4.1 Factores que afectan a la actividad enzimática 4.1.1 Concentración del sustrato Lo mejor es trabajar a concentraciones saturables de sustrato para que así todas las enzimas estén unidas a un sustrato y la actividad enzimática, así como la velocidad sean máximas.
4.1.2 Concentración de enzima La velocidad de la reacción es proporcional a la concentración de enzima, es decir cuanta más encima haya mayor será la velocidad. Esto pasa hasta cierto punto en el que el sustrato se agota, entonces la V se mantendrá constante. Trabajar a concentraciones saturables no se recomienda porque pequeños cambios de sustrato no se verán reflejados en la velocidad. Lo mejor es trabajar con una [E] similar a la Km
4.1.3 pH Un cambio en el pH puede causar la ionización de grupos implicados en la catálisis o en la interacción E-S, o una variación en la conformación de la Enzima. Estos cambios, afectan a la velocidad de la reacción y afinidad de la enzima por su sustrato específico, así como a la estabilidad de la proteína enzimática.
Las enzimas presentan un pH óptimo, donde su grado de actividad es mayor. A partir de este valor, su actividad va decreciendo a medida que nos acercamos a valores de pH más bajos/altos, hasta que llega un punto en que la proteína se desnaturaliza y la actividad se pierde por completo.
_ Desviaciones de pocas décimas del pH óptimo pueden afectar drásticamente a la actividad enzimática. Las enzimas trabajan mejor a su pH fisiológico. Así, por ejemplo la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2._**
4.1.4 Efecto de la Temperatura
En general, los aumentos de Temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10ºC de incremento, la velocidad de la reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin embargo, al ser proteínas, a partir de ciertas Temperaturas, se empiezan a desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama T óptima. Por encima de esta T, el aumento de velocidad de la reacción debido a la T es contrarestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la desnaturalización térmica y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.
_ Esta propiedad no es relevante para las enzimas del cuerpo humano, ya que la T del cuerpo se mantiene constante._**
4.1.5 Presencia de inhibidores
Un inhibidor es una sustancia o compuesto que hace disminuir la actividad enzimática a través de interacciones con el centro activo u otros centros de la enzima, excluyendo los factores anteriores que no son inhibidores.
Clases
Inhibidor reversible: sustancia que establece un equilibrio con la enzima libre, con el complejo enzima-sustrato o con ambos, al unirse mediante enlaces DÉBILES (de manera que no alteran su estructura y así es posible recuperar la actividad enzimática al eliminar el inhibidor por diálisis o simple
dilución). *La inhibición aumenta con la [I] pero no con el tiempo.
- Competitiva: El inhibidor se fija al centro activo de la enzima libre, impidiendo la fijación del sustrato.
- No competitiva: El inhibidor se fija a la enzima sin tener en cuenta si hay o no sustrato unido, pero SÍ que impide la actividad catalítica.
- Inhibidor irreversible: sustancia que se une mediante enlaces covalentes modificando químicamente y de modo PERMANENTE la enzima. De este modo, NO se puede recuperar la actividad enzimática al retirar el inhibidor y la inhibición aumenta con la [I] y con el tiempo, pudiendo llegar a ser total. (E + I F 0 E 0E´) Competitiva Las fijaciones de sustrato e inhibidor son mutuamente exclusivas, de modo que el complejo EI no es productivo. Las [S] muy altas reducen la inhibición ya que las posibilidades de EI son menores que las de ES, Normalmente, los inhibidores competitivos son sustancias que se parecen mucho al sustrato, de modo que se pueden unir a la enzima formando el complejo EI uniéndose de forma tan específica como el sustrato.
Efectos cinéticos Km = Vmax
Sin embargo, cabe destacar que en realidad la Km de la E-S no varía , por el hecho de ser una constante. Sin embargo, en presencia de Inhibidor, al necesitar más [S] para alcanzar la ½ de la V (^) máx, se produce un aparente desplazamiento (hacia la derecha en la representación de la ec. de Michaelis-Menten). Cuanto + potente es el inhibidor F 0 E 0+ F 0 E 9Km (aparente)
Cuanto más pequeño sea el valor de Ki (constante del inhibidor), mayor será la potencia y eficacia del Inhibidor.
F 0 E Aki F 0 E 0F 0 E 9potencia Inhibidor EJ: Quimioterapéuticos o antibacterianos como sulfamidas.
A. A CORTO PLAZO :
- Disponibilidad de sustratos y cofactores Aquí dentro encontramos la compartimentación subcelular de las enzimas que consiste en la separación espacial de enzimas, sustratos y moléculas reguladores en diferentes regiones, permitiéndole a la célula usar de forma eficaz recursos relativamente escasos (en cada tipo de enzima se amplifica una señal) ; y la asociación multienzimática que son asociaciones de enzimas que realizan funciones complementarias, actuando de modo secuencial, catalizando reacciones consecutivas (el producto de una reacción es el sustrato de la siguiente). La eficacia de la reacción aumenta al favorecer el encuentro de la enzima y el sustrato. Dentro de este último grupo podemos encontrar agregados o complejos multienzimáticos , en el que varias enzimas se agrupan para constituir un complejo único (complejo de la piruvato deshidrogenasa); enzimas asociadas a membranas y ordenadas en función de su participación en la vía (cadena de transporte de electrones); enzimas multifuncionales o conjugados multienzimáticos , que son moléculas de enzimas asociadas covalentemente. Generalmente estas enzimas no funcionan fuera del complejo (ácido graso sintetasa)
- Regulación alostérica
La actividad catalítica está modulada por la unión reversible no covalente de compuestos (moduladores alostéricos) en un lugar diferente al centro activo (centro alostérico). La fijación provoca un cambio conformacional de la enzima.
- los positivos o también llamados activadores al interactuar con la enzima permitirán que con concentraciones de sustrato menores obtengamos mayores velocidades de reacción debido a que incrementan la acción de la enzima, el centro alostérico en donde se une un efector positivo se conoce como centro activador (la curva se desplaza hacia la izquierda Fig.2) •
- los negativos o inhibidores son aquellos que cuando interactúan con la enzima disminuyen su actividad, el centro alostérico al que se unen se le conoce como centro inhibidor. Los efectores alostéricos negativos , (inhibidores) desplazan el equilibrio hacia la forma T de la enzima, mientras que los positivos (activadores) favorecen la conformación R
Distinguimos a su vez, dos tipos de regulación alostérica:
- Interacción homotrópica: el mismo sustrato es a la vez el modulador. Es decir, el ligando afecta a la unión de otra molécula de ligando. Este concepto coincide con el de cooperatividad. El ligando se une al centro activo de la enzima, que ha de poseer como mínimo 2 subunidades, es decir este tipo de regulación se puede encontrar en enzimas oligoméricas, pero NO en monoméricas.
- Interacción Heterotrópica: el modulador es una molécula diferente del sustrato, es decir, es el efecto que produce un ligando sobre la fijación de otra molécula DIFERENTE. El modulador NO se une al centro activo, si no al centro regulador. Las enzimas cuya actividad puede ser regulada mediante éste mecanismo puede ser monoméricas ( subunidad) pero sobretodo son oligoméricas (varias subunidades).
_ El alosterismo se define como el fenómeno estructural, mientras que la cooperatividad como el funcional)_**
- Cinética de las enzimas alostéricas (se usa como constante comparativa K0.5 en lugar de Km) La velocidad de las vías metabólicas está controlada por enzimas reguladoras moduladas alostéricamente (regulan la velocidad de flujo de una ruta metabólica).. Dos tipos: - E. alostericos K : (no son michaelianos pero son similares ya que pueden aumentar la afinidad o disminuirla). Afecta a la K0.5 pero no a la Vmax. - E. alostericos V : No afecta a la K0,5 pero sí a la V (^) máx
_ La mayoría de enzimas alostéricas dan lugar a una curva de saturación sigmoidea cuando se representa V 0 frente a [S], en lugar de la curva hiperbólica típica de las enzimas no alostéricas (aunque si es positiva lo parece)_**
- Inhibición por producto final: la enzima reguladora (normalmente la primera de la vía) es inhibida de forma específica por el producto final de la ruta metabólica (siempre que el producto final o intermediarios se acumulen en exceso). Es decir, el producto es un modulador negativo de la enzima. Ej: Síntesis de Isoleucina (Ile).
- Regulación cruzada: A partir de la ruta normal, se sintetiza un producto (F), que actúa como modulador positivo (o negativo) de una enzima, de modo que se seguirá una ruta metabólica alternativa, para sintetizar un producto I (que actuará de igual modo que F). La combinación de estos dos productos, dará lugar a otro producto final Z = (F+I).
- Regulación Covalente
- Reversible: Se modulan por la modificación covalente transitoria que consiste en la unión o separación de un grupo químico unido con un enlace covalente a la molécula enzimática. Es una modulación muy rápida que también la pueden sufrir los alostéricos. o la actividad. __* Des/Fosforilación, adenilación, uridilación, ADP-ribosilación , metilación, ubiquitinación.
- Irreversible Se sintetizan en una forma catalíticamente inactiva, llamada proenzima o zimógeno. Para pasar a la forma activa esta debe sufrir una proteólisis parcial, en la que pierde un fragmento de su molécula y varía su conformación (solo cuando es necesario) _ Proinsulinas o caspasas_* EJ: digerimos las proteínas (ej tripsina) en el intestino delgado. Las formas inactivas se sintetizan en el páncreas que libera estos enzimas que llegan al intestino. En el intestino se tienen que activar con quimiotripsina por ejemplo (rompiendo por hidrolisis un enlace peptídico). Se libera este péptido y ya tenemos la tripsina activa.
B. A LARGO PLAZO: (modificamos los niveles de la enzima) Síntesis y degradación (inactivando ciertos genes o simplemente degradándolas)
- Regulación transcripcional (síntesis del ARNm y maduración y vida media del ARNm)
- Regulación traduccional (síntesis de la proteína)
- Regulación postraduccional (Degradación de la proteína)
Algunos genes están siempre activados, de modo que existen proteínas constitutivas que se expresan
siempre en la célula y que mantienen su síntesis y su degradación constante; otras proteínas, sin
embargo, necesita la acción de un inductor para activar su síntesis, de modo que si éste no está
presente, la síntesis de la proteína NO ocurrirá. Ej: ciclooxigenasa (ante una inflamación se
produce su síntesis)
