¡Descarga bloc problesmes 3-4 y más Apuntes en PDF de Bioquímica solo en Docsity!
3. Enzimologia
3.1.- Molts productes d'ús quotidià, com són ara detergents, pasta dentrifícia, bombons farcits de xarops i cervesa, contenen enzims afegits. Proposa els diferents tipus d'enzims probablement continguts en aquests productes discutint llurs possibles funcions.
3.2.- El tofu és un producte present a les llavors de la soja amb un alt contingut proteic i que és molt emprat pels orientals en alimentació. Es prepara mitjançant un tractament tèrmic que elimina els potents inhibidors de tripsina presents a la soja. Explica les raons per les quals en la preparació del tofu es fan aquests tractaments.
Substrat velocitat relativa
I L-Leu-L-Ile 100
II D-Leu-Gly 0
III L-Ala-L-Leu 10
3.3.-* La leucina aminopeptidasa catalitza la hidròlisi d'enllaços peptídics. La taula presenta les dades de velocitat relativa per a tres substrats. (a) Per què s'observa tan gran diferència d'activitat entre el substrat I i II? (b) i entre I i III?
3.4.-* En un determinat enzim, un residu d'Ala està localitzat en una butxaca on s'uneix el substrat. Una mutació que consisteix en la substitució d'aquest residu per un de Gly no afecta l'activitat de l'enzim. Tanmateix si l'Ala és substituïda per Glu, això porta una pèrdua completa d'activitat. Suggereix una explicació a les anteriors observacions.
3.5.-* Considera un enzim que segueix la cinètica de Michaelis-Menten. Km és un paràmetre cinètic que no varia en un assaig d'activitat enzimàtica. Quin assaig faries, amb l'objectiu de comprovar el que acabem de dir, i emprant una representació de Lineweaver-Burk?
3.6.- Calcula la proporció entre les concentracions de substrat requerides per tal d'aconseguir una saturació del 80% i del 10%, respectivament, suposant un enzim amb cinètica de saturació hiperbòlica. ([S] 1 :[S] 2 = 36)
3.7.-* La figura adjunta representa una cinètica típica de Michaelis-Menten. Per a cadascuna de les frases següents indica a quina regió (A, B, C) s'aplica millor. Justifiqueu breument les respostes.
(a) el centre actiu està ocupat pel substrat la major part del temps (b) el centre actiu es troba lliure la major part del temps (c) és el rang de [S] en el qual funcionen la majoria dels enzims in vivo (d) inclou el punt d'abscisa K m (e) la velocitat està limitada principalment pel nombre de centres catalítics (f) la velocitat està limitada pel nombre de molècules de S
3.8.-* Suposeu que un enzim segueix una cinètica de Michaelis-Menten amb una K m = 1 mM. La velocitat inicial és 0.1 mM/min a concentració de substrat 10 mM. ¿Es duplicaria la velocitat incial si la concentració de substrat fóra 20 mM?
3.9.-* Comenta la frase: "Si l'enzim té un nombre de recanvi de 100 s -1 significa que necessita 100 segons per a transformar un mol de substrat"
v, F 0 6 Dmol/min
[S], M
3.10.- Per tal d'estudiar la dependència de la velocitat d'una reacció catalitzada per un enzim amb la concentració de substrat, s'afegeix una quantitat constant d'enzim a una sèrie de mescles de reacció que contenen concentracions diferents de substrat. Les velocitats inicials de reacció es determinen mesurant la quantitat de substrat consumit o de producte produit per unitat de temps. Considerant açò i els valors que hi figuren a la taula: (a) Quina és la Vmàx d'aquesta reacció? (b) Per què v és constant a concentracions de substrat per damunt de 2.0·10 -3 M? (c) Quina és la concentració d'enzim lliure a una [S], de 2.0·10 -2 M?
3.15. Suposa que la glucosa es pot convertir en una altra substància mitjançant un enzim. La taula següent recull, per aquest cas hipotètic, les velocitats de la reacció per a diferents concentracions de glucosa.
[glucosa]
(M)
v 0
(mmols·L-1^ ·min -
1.0·10-5^150
2.0·10-5^256
1.0·10-4^600
3.0·10-4^770
5.0·10-4^818
a) Introdueix aquestes dades de velocitat inicial enfront de la concentració de glucosa i uneix els punts mitjançant una corba suau. Analitzant la corba, determina quina serà la V màx i Km de l'enzim que catalitza aquesta reacció. b) Utilitza un altra representació gràfica per a determinar de nou la V màx i Km de l'enzim. Quins valors són més fiables? Per qué?
3.16.- Un dels objectius de la biotecnologia actual és la construcció d'enzims més eficients en la catàlisi, emprant tècniques de DNA recombinant. Mitjançant la mutagènesi dirigida hom pot obtenir enzims modificats, respecte l'enzim silvestre, en posicions molt definides de l'estructura i amb noves propietats. Una vegada obtingut l'enzim mutant es procedeix a l'anàlisi dels seus paràmetres cinètics i es comparen amb els de l'enzim sense modificar. Amb aquestes tècniques, l'enzim que catalitza la transformació de la substància A en B (anomenem-lo Es) és modificat a una forma mutant (Em ). La taula següent recull els resultats d'una anàlisi cinètica dels dos enzims davant la variació de la concentració d'A. (a) Si sabem que en els dos casos es va emprar 0.1 F 0 6 Dg d'enzim (Mr = 90000), quina de les dues formes transforma més quantitat de substrat per unitat de temps sota condicions òptimes d'assaig? (b) Determineu gràficament els paràmetres cinètics per a les dues formes de l'enzim. ¿Quina de les dues formes mostra major eficàcia sobre el substrat?
vo ( F 0 6 D moles/min) [A], mM Es Em 0.20 0.25 0. 0.33 0.33 0. 0.50 0.39 0. 0.66 0.43 0. 1.00 0.50 0. [K m (Es ) = 0.31 mM; V màx (Es ) = 0.62 F 0 6 Dmol·min -1; K m (Em ) 0.5 mM; Vmàx (Em ) = 1 F 0 6 Dmol·min-1 ;
eficàcia kcat /K m : 3·10^7 M -1^ (ES ) i 2.9·1 07 M -1^ (Em )].
3.17.-* El teixit hepàtic embrionari conté un enzim que catalitza la reacció: S F 0 A EP. El fetge dels adults també conté aquesta activitat. A la taula es mostren dades cinètiques d'ambdós enzims:
vo, nmol/min [S], M Extracte adult, E 1
de fetge embrionari, E 2 2.5x10- 5 1.54 6. 5.0x10- 5 2.86 10. 7.0x10- 5 3.78 11. 1.0x10- 4 5.0 13. 2.0x10- 4 8.0 16.
3.0x10- 4 10.0 17.
(a) Determina gràficament els paràmetres cinètics (K m i Vmàx ) de les dues activitats enzimàtiques. Quines conclusions pots traure sobre la naturalesa de les activitats E 1 i E 2 a partir de l'anàlisi de les gràfiques anteriors? (b) En aquest experiment s'utilitzaren 10 μL d'una dissolució de l'enzim E 1 de 250 μg x mL -1. Calcula el nombre de recanvi d'aquest enzim sabent que la Mr és de 75000. [E 1 Km 0.33 mM, Vmàx 20 nmol·min- 1 ; E 2 K m 0.055 mM, V màx 20 nmol·min-1 ; n.r. 10 s -1]
produïda per minut ( F 0 4 4A/min) per a cadascuna de les concentracions de substrat utilitzades.
[A], mM (^) v 0 F 0 4 4A/min 2.5 0. 5.0 0. 10 0. 20 0. 40 0. (a) Determina els paràmetres cinètics de l'enzim, V màx i Km (b) Sabent que en aquests experiments s'ha utilitzat 1 nmol d'enzim, pots calcular el nombre de recanvi de l'enzim? En cas que no, quina dada o experiment addicional caldria?
[Vmàx = 0.53 ∆A/min; K m 7.69 mM]
3.22.-* De quina forma afecta a un enzim de Michaelis un inhibidor irreversible? ¿I un de reversible? ¿Podries usar la diàlisi per tal de distingir els dos tipus d'inhibidors?
3.23.-* L'alumne A, estudiant en el laboratori la cinètica de la quimotripsina amb un substrat adient, ha obtingut els següents valors experimentals: Km = 4.9 mM, Vmàx = 1.50 x 10-7 mM/min. L'alumna B, pel contrari, ha trobat els següents valors amb el mateix substrat i les mateixes condicions de temperatura i pH: K m = 5.0 mM, V màx = 7.0 x 10 -7 mM/min. Al comparar els resultats, A exclama: "Hem descobert que la quimotripsina té almenys dos isoenzims". L'alumna B li contesta: "No necessàriament, podria ser que la concentració d'enzim fos diferent". A quin dels dos li dones la raó? ¿Com podríem resoldre la discrepància? Aquests mateixos estudiants es plantejaren investigar l'efecte d'una substància inhibidora de l'activitat quimotripsina. Explica amb detall com faries l'experiment i com podries determinar el tipus d'inhibició. Nota: Cal considerar tots els factors que haurien de controlar durant la mesura de l'activitat enzimàtica.
3.24.-* El virus de la Immunodeficiència Humana I (HIV-I) codifica una proteasa monomèrica (Mr 21.500) què és essencial per a l'empaquetament i la maduració del virus. Aquesta proteasa catalitza la hidròlisi d'un pèptid amb una k cat de 1.000 s -1 i una Km de 75 mM. (a) Què significa que el valor de K m siga 75 mM? (b) Calculeu Vmàx per a una concentració d'enzim de 0.2 mg/mL (c) Un compost sintètic (I) que només es diferencia del pèptid substrat de la proteasa en que els enllaços peptídics -CO-NH- estan substituïts per -CH 2 -NH-, no és hidrolitzat per la proteasa sinó que té una acció inhibidora. En les mateixes condicions experimentals que les emprades amb el substrat natural, en presència del compost I, a una concentració de 2.5 μM, la V màx és de 9.3 mM/s, mentre que el valor de K m és més alt. Quin tipus d'inhibidor és I? L'acció inhibidora d'I, està d'acord amb la seua estructura? Justifiqueu la resposta. (d) Feu sobre una única gràfica les represetacions que origina l'equació de Michaelis- Menten en el cas de la reacció no inhibida i de la inhibida. (e) Les representacions dels valors inversos de velocitat enfront dels inversos de concentració de substrat, us permet calcular els valors dels paràmetres cinètics Vmàx i K m? I diagnosticar el tipus d'inhibició? Justifiqueu les respostes.
3.25.-* El metanol és molt tòxic degut a que es transforma metabòlicament en formaldehid per l'acció de l'alcohol deshidrogenasa. Part del tractament mèdic per a l'enverinament amb metanol consisteix a subministrar grans dosis d'etanol. Explica per què penses que aquest tractament és efectiu.
3.26.- L'enzim 6-fosfogluconat deshidrogenasa catalitza la descarboxilació oxidativa de l'àcid 6-fosfoglucònic, d'acord amb la següent reacció:
6-fosfoglucònic + NADP + F 0 A E ribulosa-5-fosfat + CO 2 + NADPH + H+
Amb les dades cinètiques de la taula, determineu l'efecte del rosa de bengala sobre l'activitat enzimàtica. La concentració de l'àcid 6-fosfoglucònic es manté constant i es varia la d’NADP+.
v o, unitats arbitràries [NADP+]·10 5 , M control +rosa de bengala 1.5x10- 5 M 2 2.12 1. 3 2.70 1. 4 2.94 1. 6 3.33 2. 10 3.85 2.
3.27.-* Els resultats de dos estudis sobre l'activitat catalítica de la glicogen sintasa es mostren a la taula. Els assaigs es feren mantenint constant la concentració de l'acceptor poliglucosa i variant la d'UDP-glucosa, en presència i en absència d'ATP. Determina gràficament el tipus d'inhibició i el valor de Ki. [K i 0.44 mM]
[UDP-glucosa],(mM) (^) vo, μ mols glucosa incorporada· min- 1 sense ATP amb ATP 2.5 mM 0.8 10.0 2. 1.4 12.5 3. 3.3 22.0 6. 5.0 25.0 10.
3.28.-* L'enzim malat deshidrogenasa del citosol catalitza la reacció:
L-malat + NAD + F 0 A Eoxalacetat + NADH + H +
Aquest enzim ha estat aïllat i purificat del cor de porc, estudiant-se l'efecte que sobre l'activitat enzimàtica tenen l'AMP i la nicotinamida. Els assaigs s'han fet a 25 oC contenint el medi d'incubació de l'enzim, concentracions variables de substrat, en tampó borat sòdic 50 mM, pH 7.5 i oxalacetat 5 mM. La velocitat de reacció s'ha mesurat seguint la variació de l'absorció del NADH a 340 nm.
A 340 /min [NADH], mM control nicotinamida , 200 mM
AMP,
20 mM 0.200 1.250 0.833 0. 0.100 1.080 0.625 0. 0.066 0.909 0.476 0. 0.050 0.833 0.400 0. 0.040 0.800 0.333 0.
Determineu la Km per al NADH. Calculeu K i per ambdós inhibidors. En funció de llur estructura, discutiu l'acció inhibidora. [Km = 0.033 mM; K m(i)(Nicotinamida) = 0.12 mM; K m (i)(AMP) = 0.17 mM, K i (Nicotinamida) = 75.9 mM; K i(AMP) = 4.8 mM]
3.29.-* Una preparació de glutamat-deshidrogenasa (Mr 60.000) conté 10 mg de proteïna per mL. Si 20 F 0 6 DL d'aquesta preparació s'assajen variant les concentracions de glutamat, en absència i en presència d'un inhibidor, s'obtenen els resultats que s'hi indiquen a la taula:
(a) Calcula els valors de Vmàx i Km en absència i en presència d'inhibidor (b) De quin tipus d'inhibició es tracta? (c) Calcula el nombre de recanvi
vo- 1 , min·mmol- 1 [S]- 1 , mM- 1 sense I [I] = 2 mM 1 0.2 0. 2 0.3 1. 3 0.4 1. 4 0.5 2.
[Vmàx ( F 0 B 1I) 10 mmol·min -1 ; Km 1 mM; Km (i) 5 mM; n.r. 50 s-1 ]
al·lostèricament i manifesten una característica estructural especial que no presenten els enzims regulats de forma no al·lostèrica. Quina és aquesta característica i com fa possible que els enzims regulats de forma al·lostèrica siguen controladors més efectius que els que són inhibits només pels seus productes de la reacció?
3.34.-* La figura següent presenta alguns resultats corresponents a la mesura de l'activitat de l'aspartat transcarbamoïlasa (línia contínua).
(a) Podem dir que l'enzim presenta cooperativitat respecte al substrat (Asp)? (b) Quina informació pots obtenir sobre l'estructura tridimensional de l'enzim? (c) Dibuixa sobre la mateixa gràfica la cinètica de l'enzim en presència d'un efector positiu i d'altre negatiu que afecten l'afinitat de l'enzim pel substrat Asp. (d) Com podries explicar la corba corresponent a l'assaig emprant l'enzim prèviament escalfat a temperatura moderada (línia discontínua)?
3.35.-* La figura mostra la variació de la velocitat de reacció de l'enzim piruvat quinasa en funció de la concentració de substrat en absència (corba A) i presència (corba B) de fructosa-1,6-bisfosfat (F-1,6-BP). (a) A què podem atribuir la cinètica sigmoide? (b) Com influeix F-1,6-BP sobre l'activitat de l'enzim? (c) Quin mecanisme pot explicar l'efecte que s'observa de F-1,6-BP sobre l'activitat?
3.36.- Els diferents isoenzims de la lactat deshidrogenasa (LDH) són tetràmers amb dos tipus de cadenes polipeptídiques (A i B), cadascuna d'elles de Mr 33.500. Aquests isoenzims d'LDH tenen diferents valors de V màx i Km per al piruvat (vegeu la figura). L'isoenzim predominant en múscul esquelètic conté quatre cadenes tipus A la qual cosa afavoreix la ràpida transformació de piruvat en lactat, mentre que al cor predomina la forma que conté quatre cadenes B què afavoreix la ràpida transformació de lactat en piruvat.
(a) Què són isoenzims? (b) Quina és la M r de l'holoenzim d'LDH (c) Quantes formes isoenzimàtiques són teòricament possibles? (d) Compara els valors dels paràmetres cinètics dels isoenzims que es mostren a la figura. Quin dels dos és més eficaç?
4.11.- La taula recull el contingut (%) de G i C de diverses mostres de DNA aïllades de diferents espècies així com les temperatures de fusió (Tm ) corresponents. (a) Representeu una gràfica que il·lustre aquests resultats. (b) Usant la gràfica formuleu una expressió que relacione la temperatura de fusió d'una mostra amb el seu contingut de G+C. (c) Durant una investigació s'obtingueren dues mostres més de DNA amb un percentatge de G+C de 41.8% i 39.6%, respectivament. Calcula la T m.
4.12.- Durant la manipulació de fragments de DNA sovint es tallen en troços més petits emprant endonucleases de restricció. Les de tipus II tallen específicament determinades seqüències palindròmiques. Escriu la cadena complementària i identifica la seqüència palindròmica del polidesoxinucleòtid esquematitzat a continuació. Consulteu un text per tal de conéixer quin enzim pot tallar aquesta seqüència i com ho faria. 5' TGTAAGCTTCTTGA 3' 4.13.- El cromosoma d' E. coli conté 4.60 x 10 6 bp. (a) Si la velocitat de replicació d'una sola forqueta replicació és de 1000 pb/s, quant tardarà en replicar-se el cromosoma sencer del bacteri? (b) Sota condicions molt favorables, el temps de generació d' E. coli és 20 min. ¿Com és possible això si la forqueta de replicació no pot anar a més de 1000 bp/s i només hi ha un origen de replicació? [35 min]
4.14.- El genoma d' E. coli conté alguns "punts calents" on les mutacions ocorren amb una freqüència superior a d'altres llocs del cromosoma. Alguns d'aquests es caracteritzen per la presència de la base 5-metilcitosina. Considerant l'elevada tendència a desaminar-se d'aquesta base, per què la seua presència dóna lloc a mutacions freqüents?
4.15.- A diferència de la DNA polimerasa, la RNA polimerasa no té activitat correctora. Per què aquesta mancança no disminueix la viabilitat cel·lular? Si un organisme tinguera un enzim que emprara un RNA com a motlle per a sintetitzar el DNA, quin efecte tindria això sobre la taxa de mutació de l'organisme?
4.16.- El genoma d' E. coli té aproximadament 4.6 Mbp i conté uns 2000 gens. El genoma d'un mamífer pot tenir unes 3 Gbp i es transcriuen uns 50000 gens. Si un gen mitjà en el bacteri té 2.000 bp de llargària, calcula el percentatge del genoma bacterià que no es transcriu. Calcula la proporció del genoma de mamífers que constitueixen els exons, suposant que la grandària dels seus productes gènics és també 2 kb. [més d'un 95% del genoma bacterià es transcriu; els exons representen un 3.3% del genoma de mamífer]
4.17.- La RNA polimerasa és un exemple de proteïna que s'uneix a DNA. Citeu-ne d'altres. També és un exemple d'enzim amb subunitats catalítiques i reguladores. Citeu-ne d'altres.
4.18.- La cordicepina 5'-trifosfat és un anàleg de l'ATP amb la següent estructura: Suposant que aquest compost és reconegut per la RNA polimerasa, quin efecte pot tenir l'addició d'aquesta droga a un cultiu de bacteris? I a un cultiu de cèl·lules animals?
4.19.- Enumereu tres característiques del tRNA que el diferencien del mRNA i del rRNA.
4.20.- La RNasa P és una ribonucleoproteïna responsable de la maduració dels precursors dels tRNA. El tractament de la RNasa P amb proteases no afecta la seua activitat mentre que la capacitat catalítica es perd totalment en presència de RNasa A. Expliqueu-ho.
4.21.- L'anèmia falciforme és una malatia genètica causada per una mutació en el gen que codifica la cadena F 0 6 2 de l'hemoglobina humana. En les cèl·lules malaltes trobem un polipèptid que en la posició 6 té una Val en compte del Glu que hom pot trobar a l'hemoglobina normal. Quin canvi en el gen justifica més probablement aquesta substitució?
4.22.- El mRNA que especifica la cadena F 0 6 1de l'hemoglobina humana conté la següent seqüència: ...UCCAAAUACCGUUAAGCUGGA... El tetrapèptid C terminal codificat per part d'aquesta seqüència és: -Ser-Lys-Tyr-Arg En l'hemoglobina Constant Spring, la regió corresponent de la cadena F 0 6 1és: -Ser-Lys-Tyr-Arg-Gln-Ala-Gly-... Quina és la possible mutació que origina l'hemoglobina Constant Spring?
4.23.- Oligonucleòtids amb la seqüència Shine-Dalgarno bloquen la traducció en bacteris però no en cèl·lules eucariòtiques. Per què?
