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UNIVERSIDAD DE CARABOBO
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE BIOANÁLISIS “PROF. OMAIRA FIGUEROA”
SEDE ARAGUA
INMUNIDAD CELULAR INFLAMATORIA GRANULOMATOSA
FIBROGÉNICA HEPÁTICA E INTESTINAL EN UN MODELO
EXPERIMENTAL MURINO EN ETAPAS TEMPRANAS DE LA INFECCIÓN
POR Schistosoma mansoni Proyecto de investigación presentado como requisito para aprobar la Asignatura por: Bolívar Génesis C.I. 27. 611. Bolívar Milagros C.I. 26.280. Tutor científico: Profa. Eva Velásquez Tutor metodológico: Prof. José Romero
INDICE
2.1.9. Modelo experimental murino en el estudio de la esquistosomiasis
1. RESUMEN
La esquistosomiasis, causada por el parásito Schistosoma mansoni , es una enfermedad parasitaria que genera una respuesta inflamatoria granulomatosa fibrogénica en los tejidos hepático e intestinal. Esta patología se caracteriza por la formación de granulomas alrededor de los huevos del parásito, lo que desencadena una compleja interacción entre diversas células del sistema inmune y del tejido conectivo. En el proceso patológico, las células inmunes inflamatorias (neutrófilos, eosinófilos, monocitos y linfocitos) interactúan con macrófagos, fibroblastos y células estrelladas hepáticas (HSCs). Esta interacción juega un papel crucial en la progresión de la fibrosis y podría contribuir al desarrollo potencial de cáncer hepático, colorrectal y de vejiga. Las células estrelladas hepáticas activadas, localizadas en los bordes fibróticos de los granulomas hepáticos, son particularmente relevantes en la fibrogénesis. Estudios previos sugieren que una baja activación de estas células podría limitar la progresión de la fibrosis, mientras que su alta activación está vinculada al desarrollo de cáncer. La investigación en modelos experimentales murinos busca caracterizar la respuesta inmunitaria inflamatoria granulomatosa durante las etapas iniciales de la infección por S. mansoni. Este enfoque permitirá identificar, describir y comparar las respuestas inmunitarias inflamatorias granulomatosas
en los tejidos hepático e intestinal, analizando la interacción entre las células inmunes y los distintos estadios del parásito.Este estudio podría contribuir significativamente al diseño de estrategias terapéuticas innovadoras para el control de la esquistosomiasis y sus complicaciones relacionadas con el cáncer. Palabras clave: Esquistosomiasis, granulomas hepáticos, células estrelladas hepáticas, fibrogénesis, respuesta inmunitaria CAPITULO I PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA La esquistosomiasis es una enfermedad parasitaria tropical causada por gusanos trematodos sanguíneos del género Schistosoma. Las principales especies de Schistosoma que causan infección en los seres humanos son: Schistosoma mansoni , responsable de la esquistosomiasis intestinal y hepática en África, La Península Arábiga y Sudamérica. Schistosoma haematobium , agente causal de la esquistosomiasis genitourinaria en África y La Península Arábiga. Schistosoma japonicum , causante de la esquistosomiasis intestinal y hepatoesplénica en China, Filipinas e Indonesia (Gryseels et al ., 2006). Es una enfermedad desatendida que afecta principalmente a zonas tropicales y subtropicales. Se estima que 779 millones de personas tienen riesgo de contraer la infección a nivel mundial. Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), para el año 2021, se consideró que 251,4 millones de personas requirieron tratamiento para esquistosomiasis intestinal (OMS 2023). Se estima que
como prevención, evitando de esta manera la reemergencia de schistosomiasis en dichas zonas (Alarcón de Noya et al ., 2006; Cavalcanti et al ., 2013; McManus et al ., 2018; OMS 2023). La patología es causada por la respuesta inmune del hospedador a los huevos de Schistosoma mansoni atrapados en los tejidos y el consecuente reclutamiento de las células inmunes inflamatorias que se alojan en el tejido del hospedador, primordialmente en el hígado e intestino conformando los granulomas, y eventualmente fibrosis periovular crónica en los individuos infectados. Esta respuesta inflamatoria, está asociada a los linfocitos T, CD4+ principalmente a la estimulación de citoquinas IL-4 e IL-13. La gravedad de la enfermedad fibro-obstructiva crónica depende de la intensidad de la infección y la cantidad de antígenos liberados, siendo fundamental un manejo temprano para prevenir complicaciones (Burke et al ., 2009; Chuah et al ., 2014). La respuesta inmune de las células T, CD4+ tipo Th1 en las etapas tempranas de la infección a los esquistosómulos y los gusanos adultos se caracteriza por el aumento de la expresión de las citoquinas proinflamatorias IL-1, IL-12, Factor de necrosis tumoral (TNF-α) y el Interferón gamma (IFN-), (Pearce et al ., 2002; Wynn et al ., 2004; Wilson et al ., 2007). La respuesta inmune cambia a una respuesta Th pronunciada de la sexta a la octava semana, después de la infección, una vez que la hembra grávida deposita los huevos en los tejidos. Esta respuesta Th2 se caracteriza por la producción de altos niveles de citoquinas: IL-4, IL-5, IL-10, IL-13 y la síntesis de Inmunoglobulina E (IgE), (Pearce et al ., 2002). A medida que la infección progresa a una
fase crónica, la respuesta Th2 es modulada, con la consecuente reducción en el tamaño de los granulomas recién formados. Esta inmunomodulación podría estar siendo inducida por la IL-10 y el factor de crecimiento y transformación beta (TGF-β) a través de la expresión de células T reguladoras (Treg) CD4+, CD25+ que modulan el equilibrio de las respuestas Th1/Th2 (Pearce et al ., 2002; Wynn et al ., 2004; Wilson et al ., 2007). Cabe destacar que las lesiones granulomatosas inducidas por los huevos pueden encontrarse en varios órganos, incluyendo el hígado, intestino, pulmones, vejiga, cerebro, médula espinal, piel, glándula suprarrenal, músculo esquelético, glándulas linfáticas, bazo, riñones y el estómago. El sitio principal de la formación de los granulomas es alrededor de los huevos que se alojan en la vénulas capilares perisinusoidales del hígado, provocando fibrosis severa que interrumpe el flujo de sangre a través del hígado, causando la hipertensión portal y la derivación porto- cava, lo que puede llegar a un sangrado esofágico potencialmente fatal (Chuah et al ., 2014). Así mismo, los intestinos, otro sitio de deposición de huevos, se caracteriza por desarrollar una respuesta granulomatosa de la mucosa, lo cual puede ocasionar seudopólipos, microulceración y sangrado superficial (Gryseels et al ., 2006; Bogistsh et al ., 2013). En la patología granulomatosa los productos de excreción- secreción de huevos y adultos de S. mansoni , son importantes inductores de la acción de las citoquinas y quimioquinas, que a su vez controlan la migración de las células inmunes inflamatorias (neutrófilos, eosinófilos, monocitos y linfocitos) al sitio de la infección. En
estudiado de manera no concluyente. En cuanto a Schistosoma , se conoce que están presentes en su estado activado (miofibroblastos), en el borde fibrótico del granuloma hepático, ocasionado por S. mansoni, y que los huevos pueden interactuar con estas células activadas (Chang et al., 2006; Burke et al., 2010; Ramm, 2009; Ramm, 2011; Anthony et al., 2012). En contraste, en otras patologías se ha demostrado que la expresión y activación de estas células conduce a la progresión de la fibrogénesis, pudiendo esto provocar cáncer hepático. Asimismo, su baja expresión y activación, está asociado a la disminución de la fibrogénesis y la posible limitación de la patología (Mikula e t al., 2006; Bandapalli et al., 2006; Friedman, 2008; Amann et al., 2009; Zhao et al., 2012; Zhao et al., 2014; Carloni et al., 2014). Por tanto, estudios más amplios precisan examinar como las células inmunes inflamatorias (neutrófilos, eosinófilos, monocitos, linfocitos); conjuntamente con los macrófagos, fibroblastos y las células estrelladas hepáticas, interactúan con los distintos estadios de S. mansoni (Huevos, gusanos jóvenes y gusanos adultos). Por ende, estudios en el modelo experimental murino podrían contribuir con el establecimiento de la patogénesis asociada a la esquistosomiasis. Además, nos permitirá analizar la dinámica de la respuesta inmune inflamatoria granulomatosa fibrogénica en el tejido hepático e intestinal murino. Esto podría contribuir al diseño de estrategias terapéuticas innovadoras que no solo aborden a la esquistosomiasis. Es por ello que en la presente investigación se plantea como objetivo general, caracterizar la inmunidad celular inflamatoria granulomatosa fibrogénica
hepática e intestinal en un modelo experimental murino durante las etapas tempranas de la infección por S. mansoni. OBJETIVO GENERAL: Caracterizar la inmunidad celular inflamatoria granulomatosa fibrogénica hepática e intestinal en un modelo experimental murino en etapas tempranas de la infección por Schistosoma mansoni.
2.1. Bases teóricas 2.1.1. Agente etiológico Schistosoma mansoni es un trematodo sanguíneo digenético que pertenece a la familia Schistosomatidae. Este parásito sanguíneo es conocido por ser el agente etiológico de la esquistosomiasis hepática e intestinal, una enfermedad que afecta a millones de personas en todo el mundo, especialmente en regiones tropicales y subtropicales. Los adultos de S. mansoni son gusanos cilíndricos, blancos o grisáceos con una longitud que varía entre 7 y 20 mm que presentan dos ventosas terminales, un tegumento complejo, un tracto digestivo ciego (incompleto) y órganos reproductivos. Presentan dimorfismo sexual: el macho es más corto y robusto, mide de 10 a 12 mm, posee un canal ginecóforo donde sostiene a la hembra, la cual es más delgada y larga, hasta 16 mm de longitud. Viven en el plexo venoso mesentérico, depositan sus huevos a nivel del intestino y se alimentan de sangre. (Barrios et al ., 2006; Gryseels et al ., 2006; Lawrence y Thomas, 2010). 2.1.2. Ciclo de transmisión de Schistosoma mansoni El parasito sanguíneo Schistosoma mansoni , tiene un ciclo de vida complejo que involucra dos hospedadores: un caracol de agua dulce del género Biomphalaria glabrata como hospedador intermediario y un mamífero, principalmente humanos, como hospedador definitivo (Gryseels et al ., 2006; McManus et al ., 2018). La temperatura del agua es un factor crucial para la supervivencia y desarrollo del parásito. Las temperaturas óptimas para la eclosión de los huevos y el desarrollo de los miracidios que favorecen la
actividad metabólica tanto del caracol intermediario como del parásito (20°C y 30°C). Esto permite una rápida replicación asexual dentro del caracol, lo que resulta en la producción de un gran número de cercarias (Gryseels et al ., 2006; McManus et al ., 2018; Schwartz y Fallon et al ., 2018; Zheng et al ., 2020). Mientras que la luz solar juega un papel importante en la liberación de cercarias desde el caracol. Estas larvas son atraídas por la luz, lo que aumenta su actividad y probabilidad de contacto con humanos en cuerpos de agua. La actividad de las cercarias es mayor durante el día, lo que significa que los períodos de luz solar son cruciales para su liberación y, por ende, para la transmisión a los humanos (Chang et al ., 2006; Gryseels et al., 2006; McManus et al., 2018). El ciclo de vida de Schistosoma mansoni requiere agua dulce, donde los huevos pueden eclosionar y los miracidios puedan infectar a los caracoles. Cuerpos de agua estancada o con flujo lento son preferibles, ya que proporcionan un ambiente adecuado para el desarrollo del caracol (McManus et al ., 2018). Cuando estas larvas (miracidios) infectan al caracol, dentro del mismo se desarrollan en esporocitos y experimentan replicación asexual, produciendo miles de cercarias infectantes. De 4 a 6 semanas después de la infección del caracol, las cercarias son liberadas al agua, donde nadan activamente durante aproximadamente 72 horas, buscando la piel de un hospedador definitivo (Gryseels et al ., 2006; McManus et al ., 2018; Schwartz y Fallon et al ., 2018). Este proceso ocurre principalmente durante el día, ya que las cercarias son atraídas por la luz. Al entrar en contacto con la piel del hospedador, penetran en pocos minutos, transformándose en esquistosómulos. Estas migran a
Figura 1. Ciclo de transmisión de Schistosoma mansoni. 2.1.3. Patología hepática e intestinal en la esquistosomiasis La esquistosomiasis es una enfermedad parasitaria provocada principalmente por Schistosoma mansoni , que afecta tanto al hígado como al intestino. Durante la fase temprana de la infección, la deposición de huevos en estos órganos desencadena significativas reacciones patológicas. (Burke et al ., 2009; Miranda et al ., 2022). Patología Hepática: La esquistosomiasis hepática comienza con el depósito de huevos de Schistosoma mansoni en los sinusoides hepáticos, lo que provoca una grave respuesta inflamatoria. Este proceso desencadena la formación de granulomas, grupos de células inflamatorias que intentan aislar los huevos. (Gryseels et al ., 2006; Chuah et al ., 2014). La inflamación crónica causada por este fenómeno lleva a la fibrosis hepática en donde se produce un exceso de colágeno y otros componentes de la matriz extracelular (MEC), resultando en fibrosis periportal y oclusión venosa, en donde la fibrosis contribuye a la oclusión progresiva de las venas porta, que culmina en hipertensión portal. (Barrios et al ., 2006; Gryseels et al ., 2006 ; Burke et al ., 2009; Chuah et al ., 2014). Los síntomas asociados son hepatomegalia en donde aumenta el tamaño del hígado. Esplenomegalia, donde hay un agrandamiento del bazo. Ascitis, acumulación de líquido en la cavidad abdominal. Várices gastrointestinales, aumento del riesgo de sangrado y hemorragia gastrointestinal que puede ser potencialmente fatal si no se trata. La gravedad de las manifestaciones hepáticas está relacionada directamente con la carga parasitaria del hospedador; un mayor número
de huevos depositados resulta en un daño hepático más severo (Barrios et al ., 2006; Gryseels et al ., 2006; Burke et al ., 2009; Chuah et al ., 2014). Patología Intestinal: Por otro lado, la esquistosomiasis intestinal se produce cuando los trematodos migran a través de la pared intestinal, provocando alteraciones en la mucosa (Chuah et al ., 2014). La presencia de los huevos de Schistosoma mansoni induce inflamación granulomatosa que se manifiesta en la formación de seudopólipos, microulceraciones y sangrado superficial, afectando principalmente el intestino grueso y el recto. (Gryseels et al ., 2006; Burke et al ., 2009). Los síntomas asociados son dolor abdominal, el cual puede ser crónico o intermitente, malestar general, puede haber sensación de debilidad o incomodidad, pérdida de apetito y diarrea que puede presentarse con o sin sangre (Gryseels et al ., 2006 Burke et al., 2009; Barrios et al ., 2017; Schwartz y Fallon et al ., 2018). En la fase aguda de la infección, la migración de los parásitos y la producción de huevos desencadenan una respuesta inmunitaria que inicialmente se manifiesta como una respuesta tipo Th1 que son células CD4+. Esta respuesta inmune, orientada a combatir las infecciones, posteriormente se desplaza hacia una respuesta tipo Th2, la cual está asociada con un predominio de mastocitos y fibroblastos en la lesión inflamatoria (Burke et al ., 2009; Barrios et al ., 2017). Sin embargo, este cambio en la respuesta inmunitaria parece ser menos marcado en comparación con la respuesta observada en la patología hepática. Esto puede explicar por qué la migración del huevo induce una respuesta inflamatoria que, aunque significativa, parece insuficiente para generar
extracelular y fibras de colágeno, convirtiéndose eventualmente en la característica predominante del granuloma, mientras que los linfocitos y eosinófilos forman una zona adicional en la periferia a medida que otro tipo de células disminuyen en número. Durante las etapas finales, el granuloma se reduce significativamente de tamaño observándose solo macrófagos, sin embargo, la deposición continua de huevos en esta etapa posterior desencadena la formación de nuevos granulomas. Los granulomas intestinales se observan con menos fibras de colágeno, eosinófilos, células T y B, sin embargo suelen tener características de lo que se observa en los granulomas hepáticos en etapas tempranas (Burke et al ., 2009; Chuah et al ., 2014; Schwartz y Fallon, 2018; Barrios et al ., 2017; Costain et al ., 2022). 2.1.5. Células inmunes inflamatorias fibrogénicas. Las células inmunes inflamatorias fibrogénicas son esenciales en la formación de granulomas, los cuales ayudan a contener la infección mediante distintos mecanismos. El reclutamiento de estas células inmunes inflamatorias fibrogénicas como neutrófilos, eosinófilos, linfocitos y monocitos esta mediado por una respuesta inmune dada por los linfocitos T CD4+ Th1/Th2, por citoquinas y quimioquinas que serán las responsables de atraerlas hacia el estimulo antigénico. Incluyendo a las células de kupffer, macrófagos y a las células hepáticas estrelladas, las cuales también tienen una participación en la respuesta inmunitaria. En conjunto, estas células participan en el desarrollo de granulomas y fibrosis, promoviendo la inflamación, estimulando la activación de los macrófagos, produciendo factores de crecimiento que promueven la proliferación de fibroblastos y de colágeno, además de inducir la deposición de matriz extracelular lo que contribuye a la estructura y rigidez del granuloma y que contribuye al proceso de fibrosis en los tejidos (Burke et al ., 2009; Chuah et al ., 2014).
2.1.5.1. Neutrófilos Los neutrófilos son células que se encuentran escasas en los granulomas formados en la infección por S. mansoni. Se ha documentado que los huevos de S. mansoni secretan una proteína de unión a quimiocina que actúa como inhibidor de la inmigración de neutrófilos hacia los granulomas. Esta proteína se une específicamente a una quimiocina encargada de atraer a los neutrófilos al sitio de infección bloqueando su función, lo que resulta en una menor cantidad de neutrófilos en los granulomas, sin embargo esta proteína no afecta la actividad de otras quimiocinas, como la que atrae a los eosinofilos, esto explica porque los granulomas inducidos por S. mansoni, tienen una mayor proporción de eosinófilos y una menor proporción de neutrófilos (Burke et al ., 2009; Chuah et al ., 2014; Barrios et al ., 2017; Schwartz y Fallon., 2018). 2.1.5.2. Eosinófilos La eosinofilia es una característica común incluso en las etapas agudas de la infección, antes de que se formen los granulomas. Los granulomas inducidos por los huevos de S. mansoni contienen una gran cantidad de eosinófilos, a menudo representando hasta el 70% de la población celular total. La respuesta inmune es de tipo Th2, lo que significa que hay una producción elevada de ciertas citoquinas como la IL-5 y el factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos, que promueven la producción y activación de los eosinófilos, así como de quimiocinas que los atraen hacia el sitio de infección facilitando su acumulación en los granulomas (Chuah et al ., 2014; Costain et al ., 2022).
