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CELULAS MADRE
1.- INTRODUCCIÓN
De manera natural, los tejidos del cuerpo a lo largo de la vida sufren un desgaste, del que se defienden desarrollando su propia capacidad intrínseca de regeneración y reparación. De no existir esta renovación, se reduciría considerablemente la esperanza de vida de los seres vivos. Por ello gran parte del amplio repertorio de enfermedades, que afectan al ser humano, se basan en degeneración y muerte de los distintos tejidos que conforman nuestro cuerpo. Ya sea de manera aguda (infartos) o crónica (degeneración-envejecimiento). El avance de la medicina ha desarrollado técnicas que consiguen reparar los tejidos, como son los trasplantes. Pero estos no están exentos de complicaciones y limitaciones importantes como son el rechazo inmunológico, la escasez de órganos y la imposibilidad técnica de obtener determinados órganos. Las terapias para resolver estos problemas pasan, hoy en día, por la medicina regenerativa que se basa en la utilización de las células madre. Con esta medicina se abren nuevas posibilidades ya que se encarga de reparar los tejidos dañados utilizando los mismos mecanismos que, de forma natural, usa el organismo. Estos mecanismos del organismo para regenerar, reparar y renovar tejidos son limitados y dependen de la rapidez de instauración del daño o degeneración. De esta forma, la muerte de grandes cantidades de tejido de manera aguda (p.e. en infarto de miocardio o cerebrales) no son susceptibles de ser reparados por los mecanismos naturales del organismo. Para dar solución entran en escena las nuevas terapias con cultivo y trasplante de células madre. La medicina reparadora, basada en el uso terapéutico de las células madre, sale al paso del gran aumento de incidencia que están protagonizando enfermedades de tipo degenerativo asociadas al envejecimiento de la población. El origen de esta medicina podría situarse hacia 1665 cuando R.Lower, médico inglés de Luis XIV, experimentó con transfusiones de sangre en perros. En 1667, J.B Denis hizo lo propio en Paris desde corderos a humanos. (C.M y T.R 29). En 1885 se descubrió que algunas células podían generar otros tipos. A principio del siglo XX las primeras células madre reales fueron descubiertas cuando se encontró que algunas células podían generar células sanguíneas.
En 1958, un descubrimiento en el sistema inmunológico humano originó el descubrimiento de nuevos métodos para trasplantar médula ósea y la utilización de células madre. Estas células han demostrado su potencial para formar muchas clases diferentes de células y tejidos que podrían ser útiles en la reparación de órganos devastados por enfermedades o accidentes. En 1964 se demuestra que células, procedentes del bazo o del hígado embrionario o fetal, podían ser utilizadas para recuperar la médula en ratones irradiados que habían perdido las células hematopoyéticas de la médula ósea. (E.D. Thomas, Nobel 1990). La primera vez que se obtuvieron células madre embrionarias humanas fue en
- Se aislaron a partir de un blastocito (embrión de entre una o dos semanas antes de implantarse en el útero materno) procedente de fecundación in vitro (FIV). Pero no fue hasta finales del año 1998 cuando un grupo de investigadores de la Universidad de Wisconsin (EEUU) consiguió el primer cultivo en el laboratorio de células madre embrionarias humanas a partir de blastocitos.
2.- CONCEPTO
Una célula madre, o “stemcell” (es común que en documentos especializados se traduzca por células troncales) es, básicamente, una célula dotada de la capacidad de producir más células madre (auto renovación) y células hijas comprometidas en determinadas rutas de desarrollo. Estas últimas se convertirán finalmente, por diferenciación, en tipos de células especializadas. Por tanto, cada célula generada por división de una célula madre puede permanecer como célula madre o convertirse en un tipo de célula especializada (diferenciada). En muchos casos, la célula hija se dividirá varias veces antes de convertirse en una célula completamente diferenciada. Una tercera característica es que pueden acabar colonizando y originando nuevos tejidos y órganos.
3.- TIPOS
Los científicos trabajan, sobretodo, con dos clases de células madre de animales y de seres humanos: células madre embrionarias (ES) y células madre adultas (AS). Las células madre embrionarias proceden de los embriones que se obtienen de los huevos que han sido fertilizados in vitro (en clínicas) y después donados para propósitos de investigación con el consentimiento informado de los padres. Las C.M también pueden clasificarse en:
Además, se trata de células que admiten con facilidad la incorporación de genes foráneos, lo que las convierte en un vehículo idóneo para la terapia génica paliativa al poder emplearse C.M. transformadas. Las C.M.E. sólo son totipotentes en estadios muy tempranos de la embriogénesis. De hecho solo hasta estadios embrionarios de ocho blastómeros podemos considerarlas totipotentes. En estadios posteriores, y sobre todo en el estado de blastocito, un grupo de células se acumulan en uno de los polos y pierden esta condición considerándose a esta masa de células como pluripotentes. El acumulo celular en el blastocito se denomina “masa interna celular” (I.C.M. inter cellmass), y constituye el preembrión, generando todos los tejidos del futuro individuo a partir de las tres capas embrionarias: endodermo, ectodermo y mesodermo. Así, existe un gradiente de actividad pluripotentes y de actividad de autorrenovación que se asocia a estados muy tempranos del desarrollo, y que las células van perdiendo según se van diferenciando hasta llegar a ser una célula completamente madura. Cada una de estas células embrionarias de la ICM será la responsable de la generación de las futuras células madre específicas de tejido. Es de la ICM de donde se obtienen las líneas estables embrionarias o células ES que permiten mantener en cultivo in vitro, y a lo largo de muchas generaciones, células con capacidad embrionaria. Es muy importante poder obtener líneas de células ES estables, ya que estas tendrían la capacidad de convertirse en cualquier célula de un individuo adulto. El control adecuado de la correcta diferenciación de estas células ES hacia células específicas de tejido, o en sus células diferenciadas, generaría una fuente ilimitada de las células de cada tejido que podrían ser utilizadas en medicina regenerativa. Sin embargo, aunque las células de la ICM son pluripotentes, no son en sí mismas C.M. dentro del embrión, porque estas no se mantienen indefinidamente como tales en condiciones “in vivo” sino que se diferencian sucesivamente en los diversos tipos celulares durante la fase intrauterina. Lo que ocurre es que cuando se extraen del embrión, y se cultivan bajo ciertas condiciones “in vitro”, estas se convierten en células “inmortales” dotadas de las dos características: autorrenovación y pluripotencia. La situación dista mucho de estar controlada y, así, las líneas celulares embrionarias que se han derivado, cuando se trasplantan “in vivo” en animales de experimentación, generan con alta frecuencia masas celulares indiferenciadas (teratomas) que, en algunos casos, tienen una alta capacidad metastática, produciendo los teracarcinomas. En seres humanos se han utilizado con fines curativos. Los mecanismos de cómo se generan estas masas tumorales a partir de células ES no están aún bien definidos, pero esta situación nos ha puesto en guardia
sobre la capacidad de generar tumores de muchas de las células que consideramos C.M. Para la producción de células madre embrionarias es necesario obtener embriones “in vitro”, mediante fecundación de un óvulo por un espermatozoide (embriones gaméticos), cultivar el embrión hasta la fase de blastocito (día cinco posfecundación), separar las células madre contenidas en la ICM y cultivarlas hasta obtener células madre. Tras muchas divisiones celulares surgirán las células madre que forman parte del tejido especializado. Otros tipos de células madre embrionarias pluripotentes, capaces de derivar en cualquier célula del cuerpo (a excepción de las membranas extraembrionarias), son:
- Células embrionarias germinales (EG): pueden ser aisladas del precursor de los órganos sexuales en fetos abortados. Se localizan en la cresta germinal de los fetos, lugar donde se produce la diferenciación de la línea germinal.
- Células embrionarias cancerosas: se aíslan de teratocarcinomas, es decir, de tumores ocurridos en el feto. Se localizan en las gónadas en forma de tumoración. Las células diferenciadas del tumor se forman a partir de células madre pluripotentes de carcinoma embrionario que derivan, a su vez, de células primordiales germinales del embrión (pos implantación). Son tumores que contienen una gran variedad de tipos celulares que incluyen desde células de musculo, cartílago, hueso, epitelio,… es decir, derivan de las tres capas embrionarias. Las células diferenciadas del tumor se han cultivado y se ha comprobado que mantienen la capacidad pluripotencial. Uno de los experimentos más espectaculares fue que, tras el tratamiento de una línea celular de un tumor testicular con ácido retinoico, las células se diferenciaron a células nerviosas.
5.- CÉLULAS MADRE ADULTAS
La mayoría de tejidos de un individuo adulto poseen una población específica propia de células madre que permiten su autorrenovación periódica o su regeneración cuando se produce algún daño tisular. Algunas células madre adultas son capaces de diferenciarse en más de un tipo celular como las células madre mesenquimales y las células madre hematopoyéticas, mientras que otras son precursoras directas de las células del tejido en el que se encuentran, como por ejemplo las células madre de la piel o las células madre gonadales (C.M. germinales). Las células madre tienen dos propiedades generales:
- Son capaces de autorreplicarse por largos periodos de tiempo y permanecer como células no especializadas. Se está investigando cómo son y actúan los
autorrenovación o la diferenciación y juega también un papel importante en la regulación del envejecimiento. La activación de las AS está, normalmente, mediada por señales recibidas que promueven una secuencia de eventos estrictamente regulados. Esta regulación se realiza a niveles genéticos y epigenéticos y por el microambiente circundante. Cada vez que una célula madre se divide genera dos células hijas. Una de ellas es una nueva célula madre y la otra es una célula comprometida, con asimetría sobre una población base. La asimetría de la población facilita la respuesta a las necesidades fisiológicas variables, por ejemplo, en el caso de la cicatrización de las heridas. Las células, en cada nivel de jerarquía, responden de manera diferente a señales extrínsecas. Cada tipo celular requiere diferentes señales específicas para progresar al nivel siguiente. Esto demuestra la importancia del microambiente en la regulación de la supervivencia de la célula madre y en la protección de su composición genética. Esta última es la que imparte la diversidad funcional de las células en el órgano. La bilogía de las células madre implica muchos procesos celulares diferentes, necesarios para mantener el reservorio de C.M. y su funcionalidad durante las condiciones ambientales variables a lo largo de la vida. La dotación de C.M se mantiene cuidadosamente estable mediante el estricto equilibrio proliferación versus quiescencia, autorrenovación versus diferenciación. Defectos en cualquiera de estos procesos supone una situación de estrés que las conducirá a la senescencia o a la apoptosis. La disminución del número de C.M., y de sus funciones, que implica la pérdida del potencial renovador es una de las características del envejecimiento que afecta a la longevidad. El número de células madre de un tejido es muy bajo. En muchos casos aún se desconocen cuáles son los posibles marcadores que permiten obtener información necesaria para su identificación y localización. La gran ventaja de las AS es que pueden ampliarse en cultivos y después reintroducirlas en el paciente. No habría rechazo por el sistema inmunológico. No se necesitarían los fármacos inmunosupresores.
6.- CELULAS PLURIPOTENTES INDUCIDAS
Las células troncales pluripotentes inducidas iPS (introduced pluripotent cells) han revolucionado la biología de las células troncales y sus posibles aplicaciones terapéuticas en medicina regenerativa. Los experimentos pioneros de Takahashi y Yamanaka, realizados inicialmente con células de ratón, en 2006, y posteriormente refrendados, un año más tarde, por ellos mismos y otros laboratorios en células humanas, describieron una tercera vía para obtener células troncales pluripotentes. Hasta ese momento conocíamos esencialmente dos alternativas para obtener células
troncales pluripotentes. Una era a partir de embriones (blastocitos), las denominadas células troncales pluripotentes “embrionarias” y otra a partir de células somáticas presentes en tejidos de fetos recién nacidos o adultos, las denominadas células troncales pluripotentes “adultas”. Los investigadores japoneses demostraron que la adición de un reducido número de genes posibilitaba la transformación, la inducción de células somáticas a células troncales pluripotentes. Por ello, a las células troncales obtenidas por este tercer procedimiento se las denominó pluripotentes “inducidas” o iPS. Estos dos investigadores habían estudiado, de forma pormenorizada, la combinación mínima de genes necesaria para transformar una célula somática cualquiera, por ejemplo un fibroblasto, en una célula troncal, indistinguible de las células pluripotentes troncales embrionarias. Su hipótesis experimental era que debía existir un reducido número de funciones génicas que, al reactivarlas, fueran capaces de reprogramar cualquier célula y retornarla, transformarla, en célula pluripotente. El artículo de Takahashi y Yamanaka, publicado en 2006, no tuvo la repercusión social que le correspondía, al tratarse de experimentos realizados con ratones. Cuando los resultados fueron obtenidos con células humanas al año siguiente, por ellos mismos y otros equipos, fue cuando la comunidad científica, y la sociedad en general, reconoció que se había puesto a punto una tecnología capaz de convertir células somáticas en células pluripotentes inducidas. En la actualidad el estudio de las células iPS es uno de los campos de mayor interés en biología de células troncales y en medicina regenerativa. Los primeros genes utilizados para la inducción de la pluripotencia han ido reduciéndose paulatinamente, de la misma manera que los protocolos de inducción han sido cada vez más imaginativos evitando la utilización de vectores virales de integración en el genoma.. Cada vez son más los tipos celulares somáticos de los que es posible obtener células iPS, con procedimientos similares aunque no idénticos.
7.- CELULAS INDUCIBLES PLURIPOTENTES DE RATON
Takahashi y Yamanaka estudiaron un grupo de 24 genes cuya expresión estaba asociada de forma específica a células troncales embrionarias (ES). Mediante experimentos de transferencia en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF), en los que se iban eliminando uno a uno, llegaron a reducir el listado a diez y, finalmente, a cuatro. Los cuatro genes que permitían inducir células troncales pluripotentes a partir de células somáticas eran; Oct ¾, Sox2, Kfl4 y C-Myc. La transformación celular se hacía a través de vectores virales, retrovirus (lentivirus) portadores, de forma individual o combinada, de las secuencias génicas de los cuatro genes. Gran parte de su éxito fue el ingenioso, y elegante, sistema de cribado que diseñaron. Utilizaron unos MEF obtenidos de ratones mutantes (Knockout) para el gen
células iPS (p.e. usando el locus Fbx15, o el locus Oct3/4 o el locus Nanog, todos ellos de fuerte expresión específica en células ES), era posible obtener células iPS reprogramadas a partir de fibroblastos de ratón. Finalmente se concluyó que la explicación del mecanismo tenía que ver, fundamentalmente, con los genes transferidos y no con los sitios de integración de los vectores virales utilizados. Actualmente se ha demostrado que el protocolo general puede requerir modificaciones en función del tipo celular de partida. Por ejemplo, linfocitos B maduros necesitan un quinto gen, C/Ebpα, y la supresión o inactivación de uno adicional (Pax5). Células troncales adultas neuronales, con elevados niveles de expresión endógena de los genes C-Myc y Sox2, son transformadas sólo con oct3/4 y Kfl4. Para obtener células iPS el mismo equipo, dirigido por Shöler, ha llevado el experimento al límite. Ha demostrado que, en esencia, hace falta solamente un gen, el oct3/4, para convertir a una célula trocal neuronal adulta en célula iPS. Los otros tres genes son dispensables en este contexto, al expresarse ya de forma natural en dichas células troncales. La inclusión del gen C-Myc en el grupo de cuatro genes destinados a inducir pluripotencia es problemática. Este gen es un protooncogen implicado en muchas funciones celulares, incluyendo el control del ciclo celular. El grupo de Yamanaka decidió explorar si era posible obtener células iPS con la inducción genética provocada por Kfl4, oct3/4 y Sox2. Lograron células iPS igual de robustas que las anteriores pero con una menor eficiencia y, lo que era mucho más importante, ninguno de los ratones derivados a partir de esas células iPS desarrolló tumores. La utilización de vectores retrovirales, lentivirales, también es problemática. Los lentivirus (y retrovirus en general) son integrativos y, por tanto, pueden causar mutagénesis por inserción en el genoma ya que el proceso es al azar. Es obvio que en la práctica clínica con humanos no pueden utilizarse estos vectores. Se están empezando a usar vectores adenovirales no integrativos. El propio Yamanaka lo está intentando con plásmidos portadores de los cuatro genes. Espera derivar células iPS a pesar de la extinción y no integración de los plásmidos, gracias a la expresión transitoria conseguida de los cuatro genes.
