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TRABAJO PRÁCTICO
CEPARIO DE MICROORGANISMOS LABORATORIO UTN FRSFco
Introducción:
El laboratorio de microbiología de la UTN Facultad Regional San Francisco posee un cepario de microorganismos que se utiliza para fines académicos y de investigación. Algunos de los microorganismos del cepario son:
- Enterococcus faecalis
- Escherichia coli
- Bacillus subtillis
- Staphylococcus aureus
- Candida albicans
- Saccharomyces cerevisiae
- Rhizopus sp
Actividades:
Se debe indicar para cada uno de los microorganismos las siguientes características:
- Taxonomía y clasificación de cada microorganismo.
- Observación macroscópica a. Caracteres morfológicos: a partir de los datos recopilados del crecimiento de cultivos en medio sólido. Tamaño Elevación Forma Borde Pigmentación b. Caracteres fisiológicos: tipo de metabolismo respiratorio teniendo en cuenta la prueba de la catalasa. Indicar para cada caso si es catalasa (+) o (-), y por que se dan estos resultados. c. Graficar todo lo investigado, mostrando como se vería cada uno macroscópicamente.
- Observación microscópica: a. Procedimiento para la observación en el microscopio: Uso de cubreobjeto o no Aumento utilizado Uso de tinciones o no b. Caracteres morfológicos que se observan microscópicamente: Forma y agrupación Color: dependiendo si las bacterias son gran negativas o positivas, su color va a ser diferente. Explicar en cada caso, de qué color se observarían y por qué se logra esta tinción de las células. Fundamentar uso de reactivos. c. Graficar todo lo investigado, mostrando como se vería cada microorganismo microscópicamente, indicando en cada caso de ser posible las estructuras observadas y funciones de cada una de ellas.
ENTEROCOCCUS FAECALIS
Taxonomía: Dominio: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Lactobacillales Familia: Enterococcaceae Género: Enterococcus Especie: E. faecalis Observación macroscópica: La E. faecalis es una bacteria inmóvil, anaerobia facultativa, y no presenta una reacción con la catalasa en presencia de peróxido de oxígeno, por lo tanto, son catalasa negativos (para fundamentos ver anexo) Tras un periodo de incubación de 24 horas crecen como colonias pequeñas de color crema o blanco, redondas, lisas y borde entero. Estas tienen un tamaño entre 0,5 y 1 mm. Observación microscópica: Para su observación en el microscopio se utiliza un aumento de 1000. La muestra suele teñirse, para ello existen muchos procedimientos, pero el mas utilizado es la denominada tinción de Gram. La cual nos permite apreciar mejor la forma de la bacteria y nos permite dividirlas en dos grupos: bacterias Gram positivas y Gram negativas. Son cocos de tamaño 0,6-2,0 x 0,6-2,5 μm, que se distribuyen en cadenas cortas o en parejas (diplococos). Son Gram (+), por lo que se observan de color violeta (para fundamentos y reactivos ver anexo).
ESCHERICHIA COLI:
Taxonomía: Dominio: Bacteria Filo: Proteobacteria Clase: Gammaproteobacteria Orden: Enterobacterales
STAPHYLOCOCCUS AUREUS
Taxonomía: Dominio: Bacteria Filo: Firmicutes Clase: Bacilli Orden: Bacillales Familia: Staphylococcaceae Género: Staphylococcus Especie: S. aureus Observación macroscópica: Son bacterias inmóviles, catalasa positivas (para fundamentos ver anexo), aerobias y anaerobias facultativas por lo que puede crecer tanto en atmosfera con o sin oxígeno. A las 18-24 horas de incubación se observan colonias de 1 – 3 mm de diámetro. Son grandes, lisas, cremosas, convexas y de bordes lisos. Poseen un endopigmento color amarillo-naranja a blanco porcelana color dorado al cual se le conoce como aureus. Observación microscópica: Para su observación en el microscopio se utilizan 1000 aumentos, y tinción de Gram, de la cual se obtiene que son Gram (+), y se las observa de color violeta (para fundamentos y reactivos ver anexo) Son cocos de diámetro 0,5 – 1,5 μm, agrupados en racimos irregulares (similar a un racimo de uvas).
CANDIDA ALBICANS
Taxonomía: Dominio: Fungi División: Ascomycota Clase: Saccharomycetes Orden: Saccharomycetales Familia: Saccharomycetaceae Género: Candida Especie: C. albicans Observación macroscópica: Candida albicans es un hongo unicelular, levadura, anaerobia facultativa cuyo metabolismo es fermentativo. Sus colonias son blancas por completo pero adquieren un color crema al continuar envejeciendo. Son lisas, suaves, húmedas y de color y aspecto cremoso, de borde enetero, elevadas, y opacas, cuyo tamaño oscila entre 1,5 y 2 mm de diámetro. Observación microscópica: Para su observación en el microscopio se utilizan 400 aumentos. No se realizan tinciones ya que se puede apreciar bien su forma sin ellas. Y se puede observar que son de forma ovoide a elongada o esférica de un tamaño entre 2 a 4 μm.
SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Taxonomía: Dominio: Fungi División: Ascomycota Clase: Saccharomycetes Orden: Saccharomycetales Familia: Saccharomycetaceae Género: Saccharomyces Especie: S. cerevisiae Observación macroscópica: La S. cerevisiae es un hongo celular, un tipo de levadura utilizado industrialmente en la fabricación de pan, cerveza y vino. Es anaerobio facultativo y es capaz de utilizar diferentes azucares, siendo la glucosa la fuente de carbono preferida. Sus colonias son de crecimiento rápido, húmedas, cremosas, convexas lisas, opacas y de borde entero, con colores que van desde blanco a color crema de tamaño entre 1 a 2 cm.
ANEXOS
TINCIÓN DE GRAM
Fundamentos: Los principios de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias. La pared celular de las bacterias Gram negativas está constituida por una capa fina de peptidoglicano y una membrana celular externa, mientras que las bacterias Gram positivas poseen una pared celular gruesa constituida por peptidoglicano, pero no cuenta con una membrana celular externa. La tinción de Gram se basa en colocar como colorante primario el cristal violeta, el cual tiene afinidad con el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca Lugol, el cual sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un complejo cristal violeta – yodo, que satura los espacios del peptidoglicano de la pared bacteriana. Luego, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual deshidrata la pared bacteriana la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que esta es soluble a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona. Las bacterias Gram positivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza el complejo, mientras que las Gram negativas no lo pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contratinción y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-yodo. Reactivos: Cristal violeta: es un colorante catiónico que penetra en todas las células bacterianas, tanto Gram (+) como Gram (-) a través de la pared bacteriana. Lugol: compuesto formado por yodo en equilibrio con yoduro de potasio y siulterio, los cuales están presentes para solubilizar el yodo y actúan de mordiente. Suele añadirse después del colorante haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. Alcohol-acetona: sirve para realizar la decoloración, ya que es soluble al complejo yodo-cristal violeta. Los organismos Gram (+) no se decoloran mientras que los Gram (-) si lo hacen. Safranina: para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Después de esta las células Gram (-) son rojas o fucsias y las Gram (+) permanecen violetas.
PRUEBA DE LA CATALASA
Fundamentos: La prueba de la catalasa es una metodología utilizada en los laboratorios de bacteriología para poner en evidencia la presencia de la enzima catalasa en aquellas bacterias que la posean. Esta enzima es capaz de descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno, con la consiguiente aparición de burbujas. Por lo general, las bacterias que contienen citocromo poseen la enzima catalasa, es decir, las bacterias aerobias y anaerobias facultativas deberían poseerla. Sin embargo, existen excepciones. Se puede decir que la catalasa es una enzima desintoxicante, su función es eliminar sustancias que se producen durante el metabolismo bacteriano que son tóxicas para las bacterias. Entre estas sustancias se encuentra el peróxido de hidrógeno. Procedimiento: Tomar suficiente cantidad de colonia a estudiar sin tocar el agar de donde proviene. Colocarla sobre el portaobjeto seco y sobre ella agregar una gota de peróxido de hidrógeno. Observar inmediatamente si se desprenden burbujas o no. Interpretación: Catalasa positivo: se produce la aparición de burbujas, que corresponde a la liberación de oxígeno lo que indica que la bacteria tiene la enzima catalasa. Catalasa negativo: no se producen burbujas por lo tanto la bacteria no posee dicha enzima. Ejecución de la Prueba de la catalasa, mostrando una reacción positiva.
