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CINÉTICA ENZIMÁTICA
Uno de los factores clave que afectan la velocidad de una reacción catalizada por un enzima es la concentración de sustrato presente, [S]. La concentración de sustrato cambia durante el transcurso de una reacción in vitro a medida que el sustrato se convierte en producto. El efecto de las variaciones de [S] sobre V₀ cuando se mantiene constante la concentración de enzima se muestra en la figura anterior. A concentraciones de sustrato relativamente bajas, V₀ aumenta casi linealmente con el incremento de [S]. A mayores concentraciones de sustrato, V₀ aumenta a incrementos cada vez menores en respuesta a incrementos de [S]. Finalmente, se alcanza un punto más allá del cual se dan incrementos muy pequeños de V₀ a medida que aumenta [S]. Esta meseta se conoce como velocidad máxima, Vmáx. Michaelis y Menten postularon que el enzima se combina en primer lugar de forma reversible con sus sustrato formando un complejo enziima-sustrato en un paso reversible relativamente rápido:
El complejo ES se descompone seguidamente en un segundo paso más lento dando el enzima libre y el producto de la reacción P. Puesto que la segunda reacción es la más lenta y limita la velocidad de la reacción global, dicha velocidad global ha de ser proporcional a la concentración de la especie que reacciona en el segundo paso, es decir, ES. En cualquier momento de una reacción catalizada por un enzima, éste existe en dos formas, la forma libre o sin combinar E y la forma combinada ES. A baja [S], la mayor parte del enzima estará en la forma sin combinar E. A medida que aumenta la [S] aumenta, el equilibrio será empujado hacia la formación de ES. La velocidad máxima será observada cuando todo el enzima esté en forma de complejo ES y la concentración de E sea extremadamente pequeña. En éstas condiciones, el enzima está “saturado” con sus sustrato de modo que le aumento adicional de [S] no tendrá efecto sobre la velocidad. Cuando el complejo ES se descompone dando el producto P, el enzima queda libre para catalizar la reacción con otra molécula de sustrato. V₀= Vmáx [S] ECUACIÓN DE MICHAELIS-MENTEN Km+ [S] Km= constante de Michaelis. En los primeros momentos de la reacción, la concentración del producto, es despreciable y se contempla la simplificación de que puede ignorarse la reacción inversa P S (descrita por k-2). La reacción global se reduce a: Vo viene determinada por la descomposición de ES para dar producto: vo = k2 [ES] [Et] representa la concentración total de enzima (la suma de enzima libre y enzima unido al sustrato). El enzima libre, se puede representar como [Et]-[ES].
DOBLES RECÍPROCOS
V0= Vmáx. [S] Km+[S] 1 = Km + [S] V0 Vmáx [S] Se simplifica a: 1/V0= Km/Vmáx [S] + 1/Vmáx Km y Vmáx Km y Vmáx son característicos para cada pareja enzima sustrato. A veces el término Km se utiliza como una indicación de la afinidad del enzima por su sustrato. Para reacciones de dos pasos : Km= k2+ k-1/k
Cuando k2 es limitante de la velocidad, k2 es proporcionalmente menor a k-1 entonces Km= k-1/k1, también se llama kd (constante de disociación del complejo ES). En éstas condiciones, Km representa una medida de la afinidad del enzima por su sustrato en el complejo ES. Sin embargo, ésta situación no es válida para la mayoría de los enzimas. A veces k2 es proporcionalmente mayor que k-1 por lo que Km= k2/k1. Vmáx varía mucho de un enzima a otro. Si un enzima reacciona según el mecanismo de Michaelis-Menten de dos pasos, Vmáx= k2[Et], en donde k2 es el paso limitante de la velocidad. Kcat es una constante de velocidad mpas general que sirve para describir la velocidad limitante de cualquier reacción enzimática en condiciones de saturación. Si hay varios pasos en la reacción y uno de ellos es limitante, Kcat es equivalente a la constante de velocidad del paso limitante: Kcat=Vmáx/[Et]. Kcat es una medida directa de la producción catalítica de producto. Cuanto más grande es Kcat, más rápidos son los eventos catalíticos en el sitio activo. Kcat es una constante de primer orden y también es llamada número de recambio, ya que es equivalente al número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y a cargo de una sola molécula de enzima cuando el enzima está saturado con el sustrato. Cada enzima tiene valores de Kcat y Km que reflejan el ambiente celular, la concentración de sustrato encontrada normalmente in vivo por el enzima y la química de la reacción catalizada. Dos enzimas que catalizan reacciones diferentes pueden tener la misma Kcat. A menor Km mayor afinidad. La afinidad es la capacidad de unión entre el enzima y el sustrato. Ks es una constante de saturación: Ks=k-1/k Un enzima de Kcat alta y Km baja es un enzima de gran deficiencia. K1 mide la facilidad de que la enzima y el sustrato se unan. k-1 mide la facilidad de que el complejo ES pierda el sustrato. Tanto k1 como k-1 miden la afinidad, cuanto mayor sea la afinidad, k1 es más grande y k-1 es más chica. K2 no está en relación con la afinidad sino que tiene que ver con las propiedades catalíticas de la enzima ya que mide la velocidad individual de un enzima, es decir, mide cuantas veces por minuto la enzima da producto. Decir k2 y Kcat es lo mismo, y es la velocidad a la que trabaja un enzima. Eficiencia catalítica= Kcat/Km Ciclo catalítico= 1/Kcat INHIBICIÓN ENZIMÁTICA
Km aumenta. Inhibición no competitiva (mixta): Un inhibidor no competitivo se fija a un sitio distinto al sustrato, pero se fija tanto a E como a ES. KM aparente es igual que KM real Vmáx disminuye
Km queda igual. Inhibición incompetitiva o acompetitiva: Un inhibidor de este tipo es el que se fija a un sitio distinto del que se fija el sustrato en el sitio activo y que, a diferencia del inhibidor competitivo, sólo se une al complejo ES.
