Prácticas de Bioquímica Mgr. Soledad Bornás Acosta
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PRACTICA 13
CINÉTICA ENZIMÁTICA
1. INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas que tienen capacidad de acelerar la transformación de un
sustrato en su correspondiente producto sin modificar la constante de equilibrio de la
reacción. Actúan a condiciones compatibles con la vida y su acción específica es disminuir
la energía de activación necesaria para que ocurra el cambio. Algunas enzimas dependen
solo de su estructura proteica para su actividad, en cambio otras necesitan además de
componentes no proteicos o cofactores, los cuales deben estar presentes en el medio
donde actúan.
La actividad de una enzima se puede medir cuantificando el sustrato consumido, la
concentración del producto formado o la transformación que sufre el cofactor. La
concentración de sustrato utilizada para estudios cinéticos debe ser como mínimo igual a
10 km para garantizar que el proceso se lleve a cabo en condiciones de velocidad inicial.
Parámetros usados para medir actividad:
• Unidad internacional de enzima: es la cantidad de enzima que cataliza la formación de
un umol de producto por minuto bajo condiciones definidas.
• Unidad de actividad: parámetros más prácticos para efectos de cálculo, corresponden
a los umoles de sustrato transformado por minuto bajo condiciones definidas. Cuando
una enzima se encuentra en una solución impura puede expresarse su actividad como
unidades de actividad por mililitro.
• Actividad específica: es el número de unidades de actividad enzimática por mg de
proteínas; este parámetro es utilizado en procesos de purificación.
En la presente práctica estudiaremos el efecto de algunos factores sobre la actividad de la
enzima ureasa (C.E. 3.5.1.2) que cataliza la siguiente reacción:
La enzima a utilizarse fue purificada comercialmente por los laboratorios Merck a partir de
fuentes vegetales.
Para la evaluación de la actividad enzimática se determinará el amoniaco producido
utilizando el reactivo de Nessler (K2HgI4), el cual en medio alcalino forma un producto de
color anaranjado castaño cuya intensidad se mide colorimétricamente. Se piensa que el
complejo de color formado es el siguiente: HgONH2I.
2. OBJETIVOS
• Conocer un método para medir en forma exacta la actividad enzimática.
• Elegir una curva de calibración
• Verificar el efecto del PH, temperatura, concentración de sustrato y enzima.
• Realizar gráficos de Michaelis-Menten y Lineweaver-Burk, encontrando los valores de
Km y velocidad máxima.
• Comprobar experimentalmente la acción de los inhibidores sobre el km y/o la velocidad
máxima.
