cuaderno prácticas botánica, Apuntes de Botánica y Agronomía

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CUADERNO DE PRÁCTICAS

MICROBIOLOGÍA

GRUPO D

ALBA GARAY ÁLVAREZ

PROFESORES: MARIBEL DE SILÓNIZ JIMÉNEZ

JUAN CARLOS GUTIÉRREZ FERNÁNDEZ

PRÁCTICA I: MEDIOS DE CULTIVO

- Preparación de medios de cultivo Los medios pueden ser líquidos, sólidos o semisólidos. A su vez podemos conocer exactamente su composición, como sería el caso de los medios definidos, o encontrar diferencias en los sintéticos. Hay diferentes usos, en esta práctica nos hemos centrado en el uso general, para el crecimiento de microorganismos poco exigentes. El objetivo de esta parte de la práctica es proporcionar medios a los microorganismos que les den nutrientes suficientes para su crecimiento.

Las soluciones que hemos hecho han sido 300 ml de suero salino (9 ml/tubo), 150 ml de TSB, que es un medio líquido (7 ml /tubo), 150 ml de TSA ( ml/tubo de forma inclinada) y finalmente 2 botellas de TSA (500 ml cada una). Mi equipo se encargó de las 2 botellas de TSA (Agar Tripticasa Soja). Es un medio sólido, general y definido. Mediante las indicaciones del bote del fabricante, calculamos la cantidad que debíamos añadir. Teniendo en cuenta que la concentración era 40 g/L: 5001000 ml (^) ml •40 g = 20 gramos de TSA

Pesamos 20 gramos y los vertemos en 500 ml de agua destilada (medida con una probeta), mezclamos con ayuda de una varilla de vidrio. Posteriormente ambas botellas las llevamos al autoclave para esterilizar, a 121ºC durante 20 minutos. Cuando se complete, la mezcla quedará totalmente homogeneizada.

PRÁCTICA III: OBSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS

TINCIÓN SIMPLE

Su objetivo es estudiar la morfología de las bacterias. Los pasos seguidos han sido a) Realizar un frotis con la muestra (Kocuria rhizophila) en una gota de agua. Fijar a la llama b) Añadir colorante. En nuestro caso hicimos dos muestras para comparar resultados con Safranina y Cristal Violeta. Lo dejamos actuar durante 1 minuto. c) Lavar con agua destilada y secar al aire. Examinar con objetivo de inmersión Observamos cocos en tétradas, es la morfología típica de la Kokuria. En la muestra con Safranina de un color rojizo, y en Cristal Violeta de un color morado. En ambas muestras observamos la morfología correctamente.

3.1. Tinción K. rhizophila con Safranina 3.2. Tinción K. rhizophila con Cristal Violeta Otras muestras observadas:

3.3 Tinción E. coli con Cristal Violeta 3.4 Tinción Staphylococcus con Cristal Violeta

TINCIÓN NEGATIVA Esta tinción se utiliza también para el estudio de la morfología de los microorganismos, pero en este caso coloreamos el campo. La diferencia es que en este caso no se necesita fijar las células, de manera que la estructura observada es mucho más semejante a la de aquellas bacterias vivas. Los pasos seguidos son: a) Colocar una gota de Nigrosina. Realizar un frotis con la muestra (Kocuria rhizophila). Dejar secar al aire. b) Observar con el objetivo de inmersión.

3.3. Tinción K rhizophila con Nigrosina 3.5 Tinción Bacillus con Nigrosina

TINCIÓN DE GRAM Se trata de una tinción de tipo diferencial, la utilizamos para clasificar las bacterias en gram + y gram -, dependiendo del color que adquieren al realizar la tinción. Se tiñen de cada color acorde a la composición de la pared celular. Utilizamos un colorante principal y uno colorante contraste, además de 1 o 2 agentes diferenciales. Por lo que, en condiciones asépticas hemos seguido estos pasos: a) Realizamos un frotis y fijamos la muestra a la llama. b) Añadimos el colorante principal (Cristal violeta) y dejamos actuar 1 minuto. c) Añadimos lugol, es un mordiente formado por yoduro potásico que refuerza las uniones del colorante principal con las cargas negativas del microorganismo. Lo dejamos actuar un minuto d) Con el cubre en posición inclinada agregamos alcohol desde la parte superior, no lo hacemos directamente donde se encuentra la muestra. Lavamos abundantemente con agua. e) Añadimos el colorante de contraste (Safranina). Dejamos actuar 1 minuto y lavamos. Secamos al aire y observamos con el objetivo de inmersión.

Realizamos esta tinción en 4 bacterias diferentes: Kocuria, E. coli, Bacillus y Staphylococcus saprophyticus. Observamos que las preparaciones de las bacterias gram positivo se teñían con el colorante Cristal violeta (principal), debido a que tienen una pared más gruesa, es el caso de la Kocuria, Bacillus y Staphylococcus. La gram negativo se teñía de color rosa debido a la Safranina, estas bacterias al contacto con el alcohol pierden el colorante principal debido al contenido lipídico de su pared, como pasa con la E.Coli.

3.6 Tinción Gram en Kocuria 3.7 Tinción Gram en Bacillus

OBSERVACIÓN DE CIANOBACTERIAS

Las cianobacterias realizan una fotosíntesis anaerobia. Cuando aparece algún factor estresante aparecen los acinetos, que son endosporas que producen las cianobacterias. Se diferencian del heterocisto porque este es más pequeño y redondeado. La función de los heterocistos es fijar nitrógeno atmosférico

Hemos observado la estructura de Anabaena sp en dos muestras diferentes: BG Y BG10. El BG11 es un medio con fuente de nitrógeno de manera que en esta muestra no pudimos ver heterocistos, esto es debido a que la bacteria no tiene la necesidad de gastar energía en formar esta estructura fijadora de nitrógeno. Por el contrario, la muestra BG10 no presentaba fuente de nitrógeno de manera que la bacteria forma heterocistes para fijar nitrógeno, los cuales podemos observar:

3.11 Muestra con BG11 (sin heterocisto) 3.12 Muestra con BG10 (con heterocisto)

OBSERVACIÓN DE MOVILIDAD BACTERIANA

Mediante la técnica de la gota pendiente, vamos a valorar si las bacterias de la muestra en medio líquido se desplazan. Para ello con ayuda de un asa de siembra colocamos una gota de las bacterias cultivadas en TSB en un cubre. Este cubre se coloca sobre un porta excavado y se observa al microscopio con el objetivo de inmersión. Gracias a esta técnica hemos observado que las bacterias son móviles.

PRÁCTICA IV: CULTIVO DE MICROORGANISMOS

En esta práctica hemos realizado diferentes métodos de aislamiento de microorganismos. La finalidad de estos procedimientos es permitir que los microorganismos se multipliquen proporcionando unas condiciones favorables.

BANCO DE DILUCIONES Realizamos diluciones de manera que la concentración de microorganismos disminuye, esto nos permite realizar un recuento de las UFC (unidades formadoras de colonias) por cada ml. Hicimos 6 diluciones, en cada una añadimos 1 ml del tubo anterior. Para luego poder realizar el recuento inoculamos 0,1 ml de los últimos 4 tubos diluidos, cada uno en una placa de Petri, utilizamos estas diluciones ya que tendrán una menor concentración de microorganismos y necesitamos una cantidad entre 30 y 300 UFC.

4.1 Esquema de procedimiento de banco de diluciones y posterior siembra en placas

Una vez añadido con una pipeta automática el 0,1 ml, extendemos la gota mediante el asa de Drigalski (en medio aséptico). Dejamos incubar las 4 placas en el horno Pasteur. Al día siguiente realizamos el recuento de las UFC:

• En el tercer tubo nos salieron colonias incontables, debido a que había mucha cantidad de microorganismos.
• En el cuarto tubo contamos un total de 47 colonias (UFC)
• En el quinto tubo contamos 6 colonias (UFC), por lo que no nos servían para el recuento ya que no es estadísticamente significativo (no se encuentra entre 30-300)
• En el sexto tubo, pasó igual que en el quinto, nos salió 1 colonia (UFC), por lo que no lo añadimos en el recuento.

la jarra un sobre de vitamina C que se oxida en contacto con el oxígeno consumiéndolo.

Al día siguiente observamos que en la placa cultivada en condiciones aerobias todas las bacterias han crecido correcto. Sin embargo en condiciones anaerobias la Pseudomonas fluorescentes no ha crecido, la muestra problema y la Escherichia coli han crecido pero en menor proporción que en condiciones aerobias. Hemos concluído que nuestra muestra problema se trata de un microorganismo aerobio facultativo.

4.3 Placa cultivada en condiciones aerobias 4.4 Placa cultivada en condiciones anaerobias

Nuestra bacteria problema estudiada con las técnicas anteriormente mencionadas resulta ser una bacteria bacilo gram negativo (color rosado con tinción Gram), aerobio facultativo. Formadora de colonias pequeñas y grandes de color blanco amarillento.

Muestra Problema

UFC/mL colonias especie movilidad requerimiento de oxígeno 9 4,7 • 106 pequeñas y grandes (blancas amarillentas)

bacilo gram negativo

sí aerobio facultativo

PREGUNTAS ADICIONALES A PRÁCTICA IV:

1) Tenemos un banco de diluciones. 10^ −4^ tenemos 30 UFC, 10 −3 tenemos 300 UFC y en 10^ −2 es incontable (no se encuentra en el rango )

U F C mL = n º de colonias •10 =

d

volumen de la muestra

= 3 10 UFC/mL

= 3 10 UFC/mL

2) Banco de diluciones. 10^ −5 tenemos dos tubos, uno con 32 UFC y otro con 40 UFC, 10^ −6 tenemos otros dos tubos, uno con 4 UFC y otro con 0 UFC (no significativos). Inoculamos 0,1 mL.

U F C mL = n º de colonias •10 =

d

volumen de la muestra

= 3,2 10 UFC/mL y = 40 10 UFC/mL por lo que la

media es 3,6 • 10 7 UFC/mL

3) Realizamos una investigación de presencia de Salmonella en una tortilla de patata. Añadimos 25 gramos en 225 mL, con un volumen total de 250 mL. El banco de diluciones en el cuarto tubo tenemos 38 colonias. Según la normativa vigente el recuento permitido es la ausencia de colonias. Calcula las UFC/g y indica si se puede consumir. No se puede consumir ya que nos han salido colonias y tendría que ser nulo para ser consumido.

U F C mL = n º de colonias •10 =

d

volumen de la muestra

38•10 1 mL = 3,8 10 UFC/g

5

• 6

Consideramos la adicción de la tortilla como la primera dilución, por lo que serían cinco diluciones.