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TEMA 1: BIOLOGÍA DE LA CÉLULA EN CULTIVO. PARECIDOS Y
DIFERENCIAS CON LA CÉLULA EN EL TEJIDO
HISTORIA
Los primeros cultivos establecidos fueron a finales del siglo XIX-inicios del siglo XX y éstos eran de tipo tisular, es decir, fragmentos no disgregados de tejido con crecimiento únicamente basado en migración de las células desde el tejido que experimentan esporádicas mitosis. La gran expansión en esta área fue el inicio de los cultivos de células disgregadas.
Roux (1885) - embrión de pollo en solución salina consiguió mantenerlo durante varios días Harrison (1907) - médula espinal embrionaria de anfibios consiguió explantarla en gotas de linfa, las células sobrevivieron y crecieron, estableciendo el primer cultivo y la primera técnica oficial de cultivos, aun utilizada en cultivos muy raros sistema de la gota pendiente Burrows y Carrel (1910) - plasma de pollo para explantes Rous y Jones (1916) - tripsina en disociación tisular
Pero había un problema muy importante con las contaminaciones de bacterias, ya que tienen un ciclo de división mucho más rápido que el de las células eucariotas y ganarán a las células cultivadas ocupando la placa. En los años 40 aparecieron los antibióticos y permitieron controlar el número de bacterias. Aunque el antibiótico en sí no mata a las bacterias, éstas al final acabaran desapareciendo (son citostáticos pero no citolíticos).
1948 Sanford y col.- línea celular L929 fue la primera línea celular clonada a partir de células L de ratón 1950 Dulbecco – tripsina como agente disgregador 1952 Gry y col. - primera linea celular continua (HeLa) procediente de una señora que murió de un tumor 1954 Levi-Montalcini -factor de crecimiento nervioso 1955 Eagle - definición de requerimientos nutricionales 1961 Hayflick - empleo de antibióticos anti-microbianos 1965 Ham - medio libre de suero fue un hecho muy importante, aunque es determinado para tipos específicos de líneas celulares y tiene un coste elevado
1969 Augusti / Sacco - linea neuroblastoma, lineas diferenc. 1975 Kohler /Milstein - anticuerpos monoclonales 1976 Sato - requerimientos hormonales de los cultivo...
Dulbecco y Eagle definieron medios de cultivo y los requerimientos nutricionales de las células. Ejemplos: DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium), MEM,
RPMS, M19S.
Los tres grandes retos actuales del cultivo celular y la ingeniería tisular son: Cultivos primarios y/o especializados (diferenciados) los cultivos de células diferenciadas son muy complicados. Biotecnología de tejidos consistiría en montar órganos a partir de diferentes tipos celulares. Tiene el problema de la necesidad de células especializadas. La biotecnología de tejidos está basada en el reduccionismo: si sabemos cómo funciona cada parte por separado (p. ej. cada orgánulo), sabremos cómo funciona el global.
Células madre como precursores indiferenciados falta conocimiento del proceso de diferenciación de las células madre para poder crear tejidos.
APLICACIONES DE LOS CULTIVOS CELULARES
- Probar fármacos antes de ser probados en sistemas se pueden probar interacciones celulares en respuesta a los fármacos, etc. se ha observado que muchas interacciones típicas del organismo vivo se mantienen in vitro. Todas las conclusiones que se extraigan a partir de cultivos deben ser validadas posteriormente en modelos animales.
VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS CULTIVOS CELULARES: ¿Por qué cultivo celular y no animales?
VENTAJAS
- Control preciso y fino del medio ambiente con animales el medio ambiente no es totalmente uniforme, en cambio, con cultivos celulares es más fácil hacer que sea parecido a lo deseado para el experimento. (pH, temperatura, presión osmótica, tensión de O 2 yCO 2 ). Aún y así, la necesidad del uso de suero y/o matriz extracelular implica que haya compuestos no definidos en el cultivo.
- Caracterización y homogeneidad de la muestra en los cultivos el contenido genómico es muy homogéneo mientras que los tejidos son siempre heterogéneos. Normalmente la homogeneización es debida a una presión selectiva de las condiciones de cultivo.
- Economía (de producto, de tejido,…) hacer cultivos es muy caro, pero es un sistema a escala que nos permite tener muestras pequeñas y con ellas poder hacer ensayos de fármacos para comprobar la efectividad del producto, ya que a veces las compañías proporcionan muestras de cantidad muy pequeña que en un sistema no podrían detectarse los efectos que producen. Además, en las inyecciones con modelos animales el 90% del reagente inyectado se pierde en la excreción o distribución a otros tejidos diferentes a los que se quieren estudiar.
- Motivaciones éticas el número de animales utilizado es el mínimo (hay que usar animales para sacar las células pero menos que en el cultivo de animales). Es positivo porque el uso de animales para testar cosméticos o actividades similares no sería del todo justificable.
DESVENTAJAS
- Técnica sensible Un cultivo celular responde a condiciones ambientales y de cualquier tipo de manera sensible y rápida. No obstante, no se manifiestan cambios morfológicos. No se puede saber si un cultivo se ha modificado o no errores de manipulación llevan a errores de conclusiones de experimentos.
- Cantidad de material / coste económico muy elevado. Hay un elevado gasto en materiales y esfuerzo que resulta en la producción de relativamente poco tejido. Ensayos a una escala menor son más rápidos a causa de volúmenes menores, menor tiempo de manipulación, etc. y normalmente son más fácilmente automatizables.
- Inestabilidad es un problema en las líneas celulares continuas y resulta de la disposición cromosómica aneuploide de las células. Las células en cultivo son inestables. De un cultivo puede que una célula crezca más que otra. Así pues se ha de entender el cultivo como un ente
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Explantes primarios diseccionar un cultivo en trozos de menos de medio mm y se pueden dipositar en placa de cultivo. Cada trocito se mantiene vivo y son pequeños porque el oxigeno no difunde bien. Si se aplica una digestión enzimática se pueden disgregar las células. La enzima será de un tipo proteasa cuyo sustrato sea proteínas de la matriz celular como cadherinas. La colagenasa es muy utilizada porque es muy presente en la matriz extracelular. No siempre es necesaria la disgregación mecánica enzimática, por ejemplo en la sangre la matriz es liquida y no hay que degradarla. Células se pueden obtener a partir de cultivos de explantes, células como fibroblastos o musculares a partir de tejido se escapan y se pueden aislar (son células muy mobiles). Tambien a partir de la disgregación enzimática. Cultivo histotípico células que han sido reagregadas para recrear una estructura tridimensional con masa celular similar a la de un tejido. Cultivo organotípico implica los mismos procesos que para crear un cultivo histotípico, pero contiene células de diferentes linajes para intentar crear un equivalente de tejido. Un ejemplo seria el cultivo de queratinocitos epidérmicos cultivados junto con fibroblastos dérmicos.
A lo largo de los primeros días disminuye el numero de células, ya que las células son muy delicadas. Las células antes unidas las hemos disgregado y al ser cortadas y ser tratadas con proteasas, como la tripsina (degrada todos los receptores proteicos), muchas están comprometidas y son inviables durante el proceso y el medio de cultivo.
En condiciones normales ocurre este descenso pero el numero puede recuperarse si el cultivo tiene capacidad de proliferación. Si no la hay el numero de células ira disminuyendo con el tiempo cultivo primario. Inhibición por contacto: células que dejan de dividirse porque no hay
espacio. El primer subcultivo es pasar células (pocas) a otra placa porque está llena y hay inhibición de la proliferación por contacto. Split ratio es la tasa de replaqueo y es baja del orden de 1:2 o 1:4 en el caso del grafico, en cada generación la población se puede
multiplicar como máximo por 2 (tendré 2 placas en la siguiente generación) o por 4 (tendré 4 placas). En líneas continuas se pueden realizar Split ratios de 1:50 (no hay límite de Split ratio), la producción del sistema es mucho mayor y se permite porque requiere menos interacción celular, menos densidad. Se pueden amplificar mucho más. Cultivo primario cultivo que no prolifera. Línea primaria cultivo que prolifera, su Split ratio es de valores bajos, 1:2, 1:3 o 1:4. Esto es porque las células necesitan contacto para proliferar. Es de donde se replaqueará. Generación (o pase) en línea celular es el número de placas por las que una célula ha pasado. La línea tiene un máximo donde hay una ralentización del crecimiento y posterior muerte (mayor muerte que proliferación) es la fase de senescencia y muerte y todas las líneas primarias la presentan. El número de replaqueos hasta que una línea comienza la senescencia es el límite o numero de Hayflick, cada tipo celular tiene un numero concreto. Dependiendo de la edad este límite también varía. Según el número de generaciones que han sufrido los precursores para ir dando lugares a las células del cuerpo (la edad de las células depende del número de generación de los precursores). En nuestro gráfico el número de hayflick es 9 y puede pasar a 90 si se incrementa la actividad telomerasa añadiendo la enzima (solo en fase S del ciclo celular), permite recuperar los telómeros a su longitud original y los cromosomas son más estables
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porque hay menos mutaciones. Por lo tanto este número es alterable. Número de Hayflick de restos de cirugía estética: 12-13. Número de Hayflick de fimosis de niños: >30. Hay un tipo de líneas primarias que no experimentan la senescencia, son líneas secundarias o estables y el numero de generaciones supera las 100. Puede ser por la presencia de células muy proliferantes (se produce tumoración) o con actividad telomerasa elevada. No se conoce la base molecular de la transformación línea primaria da lugar a una secundaria.
Cuando se observan células gliales de líneas continuas hay 60 cromosomas y mucha más dispersión, por lo tanto las células no tienen los mismos números cromosómicos (aneuploides no todos los cromosomas y heteroploides diferentes cromosomas). Es un cultivo genéticamente heterogéneo. En las líneas primarias las células son euploides y diploides (2 dotaciones cromosomicas correctas). Los cultivos primarios no están transformados mientras que los secundarios sí. Un cultivo primario no es tumorogénico mientras un cultivo secundario sí lo es. Tumorogénico se puede comprobar introduciéndolas en un organismo inmunodeprimido y observando si se forman tumores (el tumor no se forma en la placa). Tiene que ser un organismo inmunodeprimido porque sino el sistema inmune reconocería y se comería las células extrañas recién introducidas. Es un resultado experimental de un modelo in vivo, aunque se puede intuir si las células forman montañas en la placa de cultivo. Las líneas primarias se proliferan si las células están correctamente adheridas, mientras que las secundarias son bastante independientes aunque no completamente. No se aplica para células en suspensión. Inhibición por contacto dejan de proliferar cuando no tienen espacio Las primarias necesitan una cierta densidad celular para proliferar y muchos mas factores de crecimiento aplicados en un suero. Aunque las continuas no son completamente independientes del suero. Pocas células bajan de 24 horas en el ciclo celular. En las líneas continuas desaparecen los marcadores específicos, mientras que en las líneas primarias están presentes porque se parecen más al tejido de origen. Desadaptación mecanismos implicados en la rediferenciación (desdiferenciación que se que se puede volver a diferenciar).
TEMA 2: EL LABORATORIO DE CULTIVO CELULAR (capítulos 8, 9, 10, 4 y 5)
EL MEDIO DE CULTIVO
EL SUSTRATO
Contenedor donde se coloca el medio de cultivo, el más típico son las placas de Petri superficie muy limitada Frasco de roux o T-Flask las células crecen adheridas a la superficie, existen con diversos pisos dentro Opticell marca que tiene en el medio membranas porosas a los gases, se inyecta la solución de células y quedan entre las dos membranas. Muy caro pero caben muchísimos en un incubador, se pueden mantener muchas células en producción
Existen medios sin glutamina que contienen un dipéptido de glutamina mas otro aminoácido (alanina o glicina) estable que luego la célula puede romper este dipéptido (Glutamax®) y utilizar la glutamina. También se añade antibiótico.
Condiciones fisicoquímicas del medio de cultivo: el medio comercial determina el pH (aprox. 7,2), las osmolaridad y la viscosidad. La temperatura la determina el incubador (células de insecto 20-26ºC, peces 4ºC).
Condiciones fisiológicas del medio de cultivo: BSS, AA, vitaminas, glúcidos, sustancias orgánicas de bajo peso molecular, hormonas, factores de crecimiento, suerto, antibióticos, antifúngicos. Sales inorgánicas aportan los iones necesarios para los procesos metabólicos. Las soluciones salinas equilibradas son la mezcla de sales que forman el núcleo del medio. Sistemas tampón control de un pH neutro con valores pK entorno a 7,2-7,4. Los medios suelen tener rojo fenol, que es un indicador de pH amarillo ácido (contaminado: secreción de ácido láctico por anaerobiosis), violeta básico y rosado a pH neutro. Carbohidratos casi siempre se utiliza glucosa, aunque también puede ser galactosa o fructosa. Vitaminas, proteínas, elementos traza (Zn, Cu, Se) y lípidos se añaden con el suero. Agua se utiliza la ultrapura, de la cual hay distintos tipos. Se necesita desionizada, sin lipopolisacáridos (pueden señalizar a las células que hay bacterias y entran en apoptosis). Hay dos rutas de material con tapones de color distinto para que no se crucen y no se contaminen las dos. Tiene que estar libre de endotoxinas como los lipopolisacáridos (en un frasco de cristal bien esterilizado siempre queda LPS). BSS (soluciones salinas equilibradas): formadas por un conjunto de sales que aportan diferentes iones necesarios.
Se escoge un medio de cultivo en función de la experiencia previa: Basales relativamente baja complejidad (ej: MEM, DMEM) Complejos con más componentes y requisitos nutricionales para células concretas (ej: RPMI 1640 para células derivadas de leucemia humana). Para cada línea celular existen medios más adecuados y esta información se busca en artículos de personas que ya han cultivado una línea concreta. PubMed es la base de datos más potente en ámbito biomédico y biotecnológico, en el apartado de materiales y métodos de los artículos se podrían consultar. Los bancos de células son organizaciones sin ánimo de lucro que recogen células almacenadas en un sistema criogénico, en la web de estos bancos se pueden encontrar fichas de las líneas celulares que disponen:
- Nivel de bioseguridad
- Medio y suero adecuados
- Temperatura de crecimiento
- Método para subcultivar Para cada línea también debe seleccionarse un suero adecuado, hay bovinos, equinos, humanos, ovinos y porcinos. Los más usados son los provenientes de vacas adultas o fetos bovinos. El suero aporta hormonas, factores de crecimiento, proteínas de adhesión y de matriz, transportadores, iones poco comunes como Fe Zn Mo, etc. Es una fracción líquida sin células sanguíneas y sin proteínas de coagulación. El plasma se recoge sobre un tubo con agentes anticoagulantes y después de la centrifugación en la suspensión quedan las proteínas de coagulación. Tienen una
composición extremadamente compleja y desconocida, ya que se conoce solo a cierto nivel. Su coste es elevado. Todas estas desventajas comportan problemas en los cultivos celulares. Hay problemas éticos, sobretodo con la obtención del suero bovino fetal. También con la homogeneización entre lotes, ya que cada lote es distinto y para los laboratorios comporta muchos problemas si se quedan sin uno y tienen que comprar otro, ya que el cultivo se comporta de manera diferente. Antes de comenzar un experimento de larga duración, se piden muestras de diferentes lotes de suero y se quedan con el que reproduce exactamente los resultados que se desean, entonces se comprometen con la casa comercial a gastar todo el lote. Cuando se termina el lote, se vuelve a hacer otro screening de lotes para ver cuál de ellos da un resultado más parecido al lote anterior. Para localizar colonias que producen muchos factores de crecimiento, se hace un experimento de formación de colonias (ensayo clonogénico). Cuantas más haya con un suero determinado, mejor será y se decidirá para utilizar este lote. En este momento solo se compran sueros de vacas de un lugar aislado geográficamente, Nueva Zelanda. Esto es debido a que se pueden controlar las enfermedades y además es un riesgo trabajar con sueros de africa donde hay muchas transmisiones de enfermedades. Sueros: Bovino es el más utilizado, equino, humano (AB para no tener problemas de anticuerpos), etc.
Se hacen pools de suero de unos 500 animales, se alicuotan y congelan. El suero se administra congelado a -80ºC. En el laboratorio se descongela y se inactiva el complemento (proteasas del sistema inmunitario), ya que si se activasen destruirían las células. Para ello se incuba el medio de cultivo 30 minutos a 56ºC. Luego se vuelve a alicuotar y congelar. El suero se vuelve a descongelar antes de añadir el medio. Los factores de crecimiento son termolábiles y la inactivación del
complemento es otro problema que comporta el suero (perdemos propiedades del suero). Hay casas comerciales que tienen columnas que retienen las proteínas del complemento antes de ser vendidas, tienen un comportamiento excelente pero cuestan cinco veces más que los sueros que deben ser inactivados. En función de los requerimientos celulares se necesita más o menos suero. Las líneas primarias necesitan una cantidad de suero mayor (20-25%), las líneas secundarias necesitan menos factores (5-10%). Los cultivos de células especializadas requieren más suero que los de células más indiferenciadas. Se están desarrollando medios con componentes del suero pero sin él, para así tener 200 o 300 componentes diferentes. Se obtienen proteínas recombinantes en reactores y luego se purifican pero el precio aumenta mucho. Se tienen menos riesgos de contaminación, aumenta la reproducibilidad entre cultivos, facilita la purificación de los productos de cultivos celulares (proceso downstream, después del reactor), evita la citotoxicidad del suero. El medio libre de suero es poco fisiológico, no es posible tener unas células con suero y luego pasarlas a uno libre de suero. Para que sobrevivan se deben ir adaptando pasándolas progresivamente a medio libre de suero con
concentración mas elevada. Los medios libres de suero son específicos de una línea celular, así que se han desarrollado solamente para líneas celulares con interés de
producción industrial (HeLa, hibridomas…). Se añaden antibióticos y antifúngicos (en el medio) en laboratorios donde haya un peligro de contaminación y los que se hace es inhibir el crecimiento, así que son para contaminaciones basales. En cultivos donde no se puede tolerar contaminación no se añaden antibióticos. Una sustancia farmacológicamente es muy peligrosa cuando la concentración de efectividad y la de toxicidad son muy similares, un ejemplo es la
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-Microscopio (invertido)---Contraste de fases -Contadores celulares---Coulter/automático -Citómetros de flujo -Microscopios especiales (fluorescencia, incubadores, microinyectores…)
PROTECCIÓN DEL CULTIVO Y DEL OPERADOR Proteger al usuario, sobretodo las cabinas
Cabinas Hay de tres tipos y todas ellas basan su seguridad en filtros HEPA Tienen un diámetro de hasta 0,12 μm å∫∂y protegen de microorganismos hasta esporas, pero no de virus. Hay que seguir protocolos de revisión para saber que están funcionando bien, ya que puede estropearse el filtro a lo largo del tiempo.
Cabinas de clase I Recuerdan a una cabina de extracción de gases. Cabina ventilada con presión negativa que opera normalmente con el frontal abierto. Zona de poyata donde se extrae el aire que pasa por un filtro esterilizando el aire antes de que pase al exterior. Es bueno para proteger al operario los elementos tóxicos no pueden llegar al operario ya que todo el aire va hacia arriba Como protege al operario incluso de virus, es de seguridad biológica (no todas las cabinas lo son) pero no protege al producto y, por lo tanto, no asegura su pureza. Cuando el material es de riesgo, en el sistema de salida hay filtros HEPA, filtros húmedos y radiación UV. Estas cabinas se diseñan para trabajar con agentes de riesgo bajo o moderado. Adecuada para la protección del usuario y el medio al manipular agentes biológicos e clase 2-3.
Cabinas de clase II Sistema estanco de filtración de aire que delimita una zona de poyata en el cual el aire recircula. El aire entra por donde ponemos las manos, pasa por un filtro HEPA y recirula genera flujo laminar asegura que la zona y el producto sean estériles Una parte del aire se expulsa (trabajo en presión negativa para protección del personal) se pierde Patm que se recupera con la entrada de aire por la zona donde trabajamos con las manos No todas las cabinas son de seguridad biológica las que no tienen expulsión no lo serán, porque puede entrar aire por un lado Vertical filtro en el techo. Protege al producto y al operador. Horizontal filtro en la pared frontal flujo laminar horizontal, no puede ser de seguridad biológica porque tira el aire contaminado al operario (tampoco protege al medio ambiente). No obstante, sí protege al producto. Un ejemplo de uso es para poner un microscopio invertido y realizar fecundación in Vitro (no comporta problemas para el usuario).
CABINAS DE CLASE III Cabinas estancas Ventana central cerrada y se manipula con guantes. El aire entra por un filtro HEPA y sale por otro. Es la que más proporciona seguridad biológica.
CABINA CITOSTÁTICA
Es más grande y debajo de la zona de trabajo hay otro filtro HEPA. Protege al producto, al operador y al medio ambiente.
ESTERILIZACIÓN
El material en la cabina debe estar limpio y estéril y para ello debe esterilizarse. El calor es el mejor método para esterilizar (autoclave). Los microorganismos termolábiles no son resistentes al calor. Instrumentación relacionada con la esterilización: a) Basados en la filtración
- Aire (filtros HEPA) cabinas de flujo laminar, incubadores…
- Líquidos poro de 0,22 microm y hay que usar filtros de naturaleza adecuada para el solvente
- Filtros de profundidad (adsorción/retención en la malla)
- Membranas filtrantes (estructura continua, diámetro de poro uniforme, retención electrostática)
- Filtros de huella de nucleación b) Basados en calor
- Autoclave 1 atm de sobrepresión, es decir, 2 atm, 121ºC, 20-30 min. -Estufas calor seco 200ºC, el o/n referido son unas 14-15 horas El autoclave y el calor húmedo son más eficientes que el calor seco -Baños de ebullición calor húmedo El autoclave y el calor húmedo son más eficientes que el calor seco
Métodos calor húmedo (^) esteriliza proteínas bacterianas
- Pasteurización
- Autoclavado
- Ebullición menos eficiente que el autoclave porque usa temperatura más bajas pero a veces es más adecuado este método porque puede verse el material perjudicado por una temperatura demasiado elevada
- Tindalización calentamiento de al menos 100ºC durante períodos cortos. Por ejemplo las esporas son termoresistentes pero el calor les hace germinar y al hacerlo se vuelven sensibles al calor, así que con una siguiente aplicación al calor puede morir. Si no se consigue su muerte se hará de una forma progresiva. Métodos calor seco Incineración es el más importante y es utilizado para eliminar residuos. Por ejemplo con la llama del bunsen incineramos lo que se encuentra en los instrumentos de siembra
En las cabinas de flujo nunca o casi nunca se utiliza un bunsen, solo si el filtro está únicamente arriba y el aire viene de la zona de trabajo o si el filtro esta en la pared frontal. Se cambia de flujo laminar a turbulento cuando hay filtro en la pared y arriba. En las cabinas verticales no se usa un bunsen convencional, sino que se utiliza un bunsen piezoeléctrico se activa por un pedal con una llama baja para que el flujo no se modifique a turbulento. c) Radiación ultravioleta -Lámparas UV procede de fluorescentes que tienen emisión en el espectro invisible. Esteriliza las superficies expuestas directamente a estas luz. Tienen una emisión de luz azul producida por un germicida (bactericida). Debe cuidarse la higiene de estas lámparas. Las lámparas pierden antes la emisión de luz uv que la de luz azul, por lo tanto, que una luz sea azul no indica que esté funcionando. Encender la luz UV del laboratorio toda la noche sí puede realizarse, pero encender la luz UV de la cabina de flujo toda la noche no porque puede generar fisuras en el filtro. Nunca trabajaremos con luz UV en el filtro porque nos quemaríamos las manos. Esta
- De contraste de fases suele estar invertido. El material a observar suele ser grueso, por lo tanto, los objetivos están por debajo de la platina y la luz (condensador) arriba. El diafragma de fase (dentro del objetivo) y el anillo de fase (dentro del condensador) permiten observar células sin teñir. Los fotones que llegan a la preparación y no son iluminados son desviados. Permite observar objetos con poco color como las células, con poco contraste. Las muestras tienen que estar en sentido inverso al normal, en una botella se puede girar aunque en una placa de Petri no se puede.
- Fluorescencia
CONTADORES DE CÉLULAS
- Cámara de Neubauer
- Citómetro de flujo
- Tipo Culter establece una relación del número de partículas que atraviesan un orificio, aunque las células deben estar en suspensión. La diferencia de potencial permite contar las partículas y determinar su tamaño.
MICROINYECTORES
Dejar caer una pequeña cantidad de volumen sin que la célula se rompa o estalle. Tiene una cámara, como un incubador de CO2, que delimita un área con una platina termoestabilizada. Es un brazo con una aguja automatizada quien hace unos movimientos para inyectar.
TEMA 3: BIOSEGURIDAD
Riesgo biológico es distinto a otros riegos como el riesgo químico, en el que se produce el vertido y con dejarlo contenido en un sitio no se propaga. Con el biológico, entre que se infecta la persona y se enferma puede pasar un tiempo y puede ir infectando a mucha gente, debido a que los agentes biológicos se replican y pueden propagarse. Hay que contener, aislar y si se propaga eliminarlo. Barreras primarias ropa, equipos de protección personal, entre la persona y el operario, cabinas de seguridad biológica. Barreras secundarias como está diseñado el laboratorio y como vamos a prevenir problemas de fugas cuando se envía material entre laboratorios y como se eliminan los residuos Barreras terciarias en que lugar del edificio se sitúa un laboratorio Barreras cuaternarias en qué lugar vamos a poner un edificio con laboratorios
Identificación del riesgo observar qué patógenos han ido causando problemas a partir del material que se quiere manipular en el laboratorio. IAL (infecciones asociadas al laboratorio), fáciles de detectar en enfermedades raras. Debe entenderse su epidemiología y su transmisión para saber como protegernos ante ellos. Evaluación del riesgo se clasifican los microorganismos en grupos de riesgo. Control del riesgo mediante barreras primarias y secundarias
Hay leyes que regulan las condiciones de trabajo. En Europa hay un Real Decreto sobre la exposición a agentes biológicos. Si es un microorganismo que está en todas partes es complicado de determinar si se ha infectado alguien en el laboratorio o fuera. Hay una tendencia a ocultar cuando ha habido vertidos en el laboratorio y esto complica el poder tomar medidas.
IDENTIFICACIÓN DEL RIESGO
Chemo-box cajas específicas para agujas utilizadas y otros materiales similares. La vía parenteral puede controlarse. Vías de transmisión Vía parenteral el agente entra en contacto con fluidos como la sangre. Prevención: precaución con agujas. La vía parenteral puede controlarse. Vía digestiva el patógeno entra en contacto con el tubo digestivo. La forma más común es por mala praxis, por ejemplo utilizando lápices contaminados. En general se transmiten enteropatógenos. Lavarse las manos tantas veces como haga falta es muy importante. Vía respiratoria transmisión por aerosol, se controla mal la formación de éstos, así que son patógenos peligrosos. También se debe evitar que se formen estos patógenos (evitar que se formen aerosoles) con cabinas de flujo, en suspensión siempre etc. Evitar la formación de aerosoles. Vía dérmica las fisuras de la piel son vías de entrada, evitar salpicaduras, utilizar guantes.
EVALUACIÓN DEL RIESGO Riesgo de agentes biológicos hay de las clases 1, 2, 3 o 4 a medida que la peligrosidad va aumentando. Esta clasificación se hace en Europa. En EEUU hay una diferencia porque la clase 3 puede causar enfermedad y se transmite por vía respiratoria. En el BOE se han publicado listas de especies especificando la clase de los tipos de microorganismos. Es una clasificación para individuos sanos, pero para una persona inmunodeprimida sube un nivel de riesgo de los patógenos. La no inclusión de un patógeno en la lista oficial implica actuar con él con las máximas precauciones. Los virus son como mínimo del grupo 2. Otra medida que aumenta mucho los riesgos hace la modificación genética de los microorganismos, que pasan a nivel 4 hasta que no se clasifiquen adecuadamente. Se debe intentar siempre utilizar los patógenos con menor riesgo posible cuando sea posible el uso de más de uno. Hay cuatro niveles de bioseguridad en el laboratorio de seguridad biológica (LSB).
NIVEL 1 Agente: Agentes biológicos bien caracterizados no causantes de enfermedades en adultos y con un riesgo mínimo para el personal del laboratorio y el medio ambiente, por ejemplo Bacillus subtilis, Eschericha coli, Naegleria gruberi, virus de la hepatitis infecciosa canina. Son los laboratorios de prácticas para los estudiantes. No se exige ni siquiera llevar bata, aunque es recomendable por higiene. Tampoco se requiere la utilización de guantes. Un elemento de riesgo es el uso de Bunsen, que además no se puede utilizar en todas las cabinas de flujo laminar. La boquilla de pipetas puede contaminarse por utilizarse por muchas personas. NIVEL 2 Agente: Agentes biológicos que pueden provocar enfermedades y constituir un peligro serio para los trabajadores, pero para las que existe un tratamiento preventivo y paliativo (numerosos agentes biológicos, fluidos corporales y sangre). Manipulación de agentes que no pueden transmitirse por aerosol. Se pueden ver ejemplos en la tabla de la diapositiva. Procedimientos de nivel 1 más trabajo en cabina de seguridad. Se exige el uso de bata y se recomiendo el uso de guantes y mascarilla en caso que pueda haber infección dérmica o por aerosol.
Cultivar células supone un cierto riesgo. En el laboratorio compraron discos de epitelio bronquial EpiAirWay, en el prospecto indica que no hay test para saber seguro si están libres de patógenos las células de estos epitelios. Por lo tanto, se recomiendo utilizarlas como mínimo en un nivel de bioseguridad 2. El riesgo en la manipulación de líneas es la carga patogénica y no las células en sí bacterias, micoplasmas (son bacterias), hongos y virus. Otras causas más minoritarias son alérgenos, toxinas, capacidad oncogénica (muy relacionada a organismos genéticamente modificados, ya que se pueden estar activando virus), capacidad tóxica intrínseca (una línea celular puede ser tóxica por ella misma, solamente se produce cuando un operario se contamina con un cultivo de sus propias células). De una población normal de células se van seleccionando los clones más tumorales y si un científico entra en contacto sanguíneo con las suyas cultivadas podrá tener problemas porque su sistema inmunológico no diferenciará entre las células cultivadas y las propias del organismo. La mayoría de problemas vienen por la carga patogénica debe controlarse en un cultivo. A nivel de bacterias y de hongos se aplican antibióticos y antifúngicos. Si un medio se necesita para un experimento, se produce días antes y se hace un control de esterilidad y se ve si hay un crecimiento bacteriano. También se hacen controles de esterilidad de los cultivos, si hay bacterias o hongos debe tirarse, pero si es importante el cultivo puede variarse los antibióticos y antifúngicos utilizados. Los micoplasmas provienen de infecciones oportunistas (ej. constipados) y producen
pequeñas pneumonías, se estornuda y con las manos se puede infectar el cultivo. También es frecuente que algún compañero de laboratorio te pase un cultivo contaminado con micoplasmas. Los micoplasmas tienen efecto sobre el metabolismo celular y únicamente se detecta su presencia cuando hay un gran nombre. Es una bacteria sin paredes que se adhiere a las células y como un parásito va chupando nutrientes, dejando las células vivas. Forman como unas escamas en las células. Pueden inducir a errores experimentales si, por ejemplo, hay micoplasmas en un cultivo y se analizan los receptores de membrana. Cuando se reciben muestras del exterior, ésta entra en un incubador en cuarentena para verificar que no está infectado. DAPI es una técnica que permite observar núcleos de células mediante colorante fluorescente, pero no se detecta bien y además se debe diferenciar de las mitocondrias, que dan también una señal punteada. Cada quince días se dan muestras de los cultivos utilizados con ocho cebadores y se hace una PCR para ver si hay micoplasmas en la muestra. Virus: Suponen un enorme problema para el cultivo y para los
operarios, ya que no se retienen el los filtros HEPA y salen de las cabinas, excepto de las de tipo III porque son estancas. Hay muchos virus, hay que hacer tests específicos para cada uno y son muy difíciles de eliminar. El riesgo de manifestación de virus latentes se incrementa con las modificaciones génicas (GMO) y los cambios en las condiciones de cultivo.
La población de la cual provienen las células es muy peligrosa y también el tipo de tejido (ej: sanguíneo más peligroso que epidérmico). Además si son líneas continuas es mucho más peligroso que con líneas primarias. La caracterización de las células sirve para patentarlas, mantenerlas durante un largo tiempo, etc. La mala identificación de las células es un hecho bastante común y se debe en gran parte a la contaminación cruzada. Cuando se tienen muchas líneas en el laboratorio
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como HeLa (crecen muy rápido) o endoteliales (crecen muy despacio). Las células de cultivos rápidos pueden quedarse en la pipeta y si luego se utiliza una línea lenta, estas células poblarán el cultivo. Tratar las líneas en consonancia con un factor de duda porque no estamos seguros de si está contaminada. Sólo deben manipularse las líneas una vez y siempre las rápidas serán las últimas. Si se trabaja con una línea que tiene una morfología concreta, hay que ir revisando periódicamente que no haya perdido sus propiedades. A partir de un cultivo del banco, se realiza un cultivo semilla (Seed Stock) y son completamente seguras. El laboratorio debe asegurarse del mantenimiento del stock y cada investigador por los tubos de sus experimentos (su propio Using Stock). Cuando una persona deja de trabajar elimina su Using Stock. Si alguien quiere las células con las que trabajaba no las coge de algún Using Stock, sino que las coge del Seed Stock y crea su propio Using Stock. Debe registrarse los pasos que las alícuotas van siguiendo y así se puede trazar el histórico de las líneas hacia atrás asegurar la trazabilidad: saber por qué algo ha dejado de funcionar.
TEMA 4: TÉCNICAS BÁSICAS : OBTENCIÓN, MANTENIMIENTO,
PROPAGACIÓN Y CONSERVACIÓN
Las líneas primarias reproducen mucho el sistema fisiológico, pero deben irse reaislando y caracterizando. Para aspectos intracelulares como el tráfico de proteínas intracelular se suelen utilizar líneas celulares continuas (no hay que reaislarlas). En la desaptación se conocen los mecanismos de diferenciación. El tamaño del tejido cortado debe ser pequeño para permitir la difusión del oxígeno, 0, mm cada trozo cultivo de explantes primarios Las células a veces pueden disgregarse migrando del explante, pero muchas veces es necesaria una digestión enzimática, la tripsina suele ser muy utilizada. En todos los tejidos no es necesaria una disgregación mecánica (cortando de manera cizalla con bisturí), por ejemplo si se quiere un cultivo de linfocitos.
DISGREGACIÓN ENZIMÁTICA
COLAGENASA
Procede de una bacteria y no es una proteína pura. Se cultiva Clostridium hystoliticum en un bioreactor, se aísla y se purifica, aunque hay diversos niveles de pureza. Para cada tipo tisular hay un nivel de pureza más adecuado. Entre lote y lote suele haber diferencias, igual que ocurre con el suero. La mayor parte de los tejidos contienen colágeno en la matriz extracelular.
TRIPSINA
Es una serina proteasa pancreática. Se purifica a partir de páncreas de cerdo, por lo tanto no se obtiene pura del todo.
ELASTASA
Es una serina proteasa pancreática. Proteasa de elastina, que está presente en múltiples tejidos. Empleada en la disociación de tejidos conectivos, usualmente junto con tripsina o colagenasa.
HIALURANASA Este enzima rompe ácido hialurónico es un hidrato de carbono y no proteína.
Bolas magnéticas se utilizan anticuerpos que se unen a células concretas y estos anticuerpos son reconocidos por anticuerpos secundarios que se unen a bolas magnéticas, aplicar un imán permite que no se eluyan las células de interés. Pueden hacerse selecciones positivas (anticuerpos contra las deseadas) o negativas (anticuerpos contra marcadores de superficie de la población no deseada muerte selectiva). También existen enzimas que eliminan las bolas y permiten clasificar posteriormente según un segundo criterio. En referencia al aislamiento, la separación con bolas magnéticas da más rendimiento que el FACS. La gráfica muestra el eje X la intensidad de fluorescencia y el Y el numero de células que corresponden a esa fluorescencia. Además, podemos separar las células en función de si se han unido o no a nuestro anticuerpo. Citómetro de flujo Forward scatter da el tamaño Side scatter da la rugosidad Después de clasificar las células, se enriquece la población pero no hay homogeneidad total. El citómetro de flujo da información cuantitativa de las células. El clonaje es otro método de separación de células para conseguir una población homogénea.
EJEMPLO 1: Aislamiento de fibroblastos esclerales humanos la esclera es la capa de conjuntivo que delimita el ojo. Uno de los tipos celulares presentes son los fibroblastos. EJEMPLO 2: Aislamiento de epitelio de la conjuntiva de humano las células epiteliales tienen forma de mosaico, planas o cúbicas y recubren interfases. EJEMPLO 3: Aislamiento de células del epitelio pigmentario de la retina humana (cultivo primario). Los conos y bastones son células fotosensibles. El ojo no presenta vasos sanguíneos en el epitelio pigmentado de la retina está situada la barrera hematoretina que decide que sustancias llegan o no. Las células obtenidas son pequeñas y aparecen en color negro (melanina es la responsable). El fondo verde es utilizado porque nuestro ojo detecta mejor tonos verdosos que grises. La vimentina y el ck 8.13/19 son marcadores de células epiteliales. EJEMPLO 4: Aislamiento de células endoteliales de aorta bovina. Se quiere aislar la capa de células del interior del vaso y para ello se rellena el vaso con una solución de PBS+antibióticos. Se ligan las intercostales (vasos que irrigan la aorta) para que no se escape líquido. Se rellena con colagenasa y se hace un masaje para que la solución se distribuya. Cuando hay demasiada colagenasa saltan las células que se encuentran más abajo y son células de la musculatura lisa. Esto es debido a que las células musculares crecen antes que las endoteliales. Se resuspende en un medio DMEM con 20% de suero (cantidad elevada porque se trata de un cultivo celular primario), endotelial cell growth supplement y fibroblast growth factor. A las tres horas se forman unos grumos (placas de células endoteliales que saltan durante el masaje y así se evita tener células musculares), es una señal de que el proceso se está desarrollando adecuadamente y a los tres días se forma una monocapa. Cuando no se forman grumos significa que el tratamiento ha sido demasiado agresivo. A los 4 o 5 días se pueden formar una especie de grumos y son debidos a la aparición de levaduras, ya que por la propia contaminación del matadero han aparecido (aún habiendo antibióticos y antifúngicos). El límite de Hayflick de las células endoteliales es 6, por lo tanto, hay que aislarlas con frecuencia. Son líneas que proliferan y primarias. EJEMPLO 5: (^) Aislamiento de células endoteliales de cordón umbilical humano
(HUVEC).
La sangre del interior del vaso coagula cuando se recibe en el laboratorio. Se cierra un extremo y se añade PBS. Se abre, se quita la sangre y se añade colagenasa, el tiempo la cual estará dependerá del lote. Se recoge la solución de colagenasa, se rellena con medio de cultivo, se masajea y se recoge el medio. A continuación, se recubre con gelatina (colágeno desnaturalizado) y ésta actúa con sustrato de adhesión específico para células endoteliales. Las células endoteliales expresan un marcador denominado factor de von Willebrand. Además de a partir de arteria aorta humana y bovina, también se pueden aislar células endoteliales de la arteria del cordón umbilical, células endoteliales coronarias y microvasculatura (piel cerebro, órganos sólidos, etc). No existen líneas estables de células endoteliales, todas son primarias. Se creyó haber encontrado la línea ECV-304 pero posteriormente se descubrió que era epitelial. Si se dan los factores necesarios, por ejemplo VEGF, las células endoteliales se alinean y forman un vaso al cabo de 2 horas. Una estrategia alternativa para tratar los tumores es la inhibición de la angiogénesis (formación de vasos sanguíneos) así el tumor no estará irrigado y no le llegará ni el oxígeno ni nutrientes necesarios. Por lo tanto, junto a las células endoteliales y al VEGF se puede añadir una molécula que se cree que inhiben la angiogénesis e ir comparando la muestra con la control. Con este expermiento se podrían encontrar moléculas inhibidoras de la angiogénesis. EJEMPLO 6: Aislamiento de células de la piel y de diferentes mucosas. Obtención de piel a partir de cirugías programadas, lavado con PBS y antibióticos (la piel es un tejido muy sucio), incubación con colagenasa, separación de la dermis y epidermis e incubación con tripsina. Los fibroblastos se obtienen por digestión y se siembran. De los queratinocitos, en cambio, se obtienen precursores determinados y se siembran sobre una feeder layer 3T3-SA (fibroblastos de ratón) se siembran los fibroblastos y se tratan con mitomicina C para que no puedan crecer. Una vez se tienen los fibroblastos y los queratinocitos, se puede realizar un cultivo histotípico a partir de estos dos tipos celulares. Para ello, se mezcla colágeno, fibroblastos y NaOH formación de un coágulo de colágeno, el cual contiene los fibroblastos (banda rosa clara). Sobre esta estructura se coloca un anillo metálico para que sedimenten y además delimita cuál es la sección sobre la que crecerán los queratinocitos. Toda esta estructura se coloca sobre una malla de manera que los queratinocitos queden en contacto con el aire, de esta manera formarán capas hacia arriba y se queratinizarán (igual que en la piel). Es un modelo de piel reconstruida pero no verdadera porque le faltan células sebáceas, dendríticas, pelos, nervios, etc. Los queratinocitos también se pueden obtener de mucosa bucal humana y así no es necesaria la biopsia. La piel se separa en dos cultivos a partir de la dermis se cultivan fibroblastos y a partir de la epidermis células epiteliales. Estos dos cultivos pueden unirse y formar una piel humana reconstituida (le faltan muchos elementos).
EJEMPLO 7: Aislamiento de hepatocitos de rata los hepatocitos se distribuyen entre tríadas hepáticas (se usa para hacer llegar una solución salina y la sangre se elimina con facilidad si el organismo hace poco que ha muerto, no se han formado coágulos), después se perfusa con colagenasa, se rompe el tejido conjuntivo que está en forma de bolsa y ya se tiene el órgano deshecho. Los hígados se utilizan siempre como trasplante y no para experimentos, esto se hace con el de rata. A partir de un tumor en el hígado se busca el trozo de tejido sano (tamaño muy pequeño) y cada uno de los vasos se observan en el microscopio y se difunde una solución. Se obtiene una disgregación celular de células muy valiosas.
