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Elementos transponibles (ET)
■ Son secuencias que se desplazan por el genoma.
■ (^) Sinónimos: transposones, elementos genéticos móviles, genes saltarines, …
■ Están en los genomas de todos los organismos.
■ Suelen ser muy abundantes (en humanos, cerca del 50% del genoma y en maíz cerca del 90%).
■ Los elementos transponilbes se pueden insertar en diferentes localizaciones mediante un mecanismo distinto a la recombinación homóloga.
Historia
■ Los ET se identificaron por primera vez por Barbara McClintock del Cold Spring Harbor Laboratory in New York (entre 1948 y 1959)
■ Los Biólogos fueron inicialmente muy escépticos
■ ¡¡¡Le concedieron el Premio Nobel en 1983 (con 81 años)!!!
Características generales de los ET
Cuando un elemento transponible se inserta en el DNA, se generan repeticiones directas flanqueantes.
Hay muchos tipos diferentes de elementos transponibles: algunos tienen estructuras simples y solo cuentan con las secuencias necesarias para su propia transposición (movimiento), mientras que otros poseen estructuras complejas y codifican varias funciones que no se relacionan con la transposición de manera directa. A pesar de estas variaciones muchos elementos transponibles tienen ciertas características en común.
Las repeticiones directas flanqueantes cortas, que miden entre 3 y 12 pares de bases de longitud, pueden hallarse a ambos lados de la mayoría de los elementos transponibles. Estas secuencias no forman parte del elemento transponible y no se mueven con él. En cambio, se producen durante el proceso de transposición en el sitio en el que se inserta el elemento. Las secuencias de estas repeticiones son variables pero su longitud es constante para cada tipo de elemento transponible.
La presencia de repeticiones directas flanqueantes indica que cuando el elemento transponible se inserta a sí mismo produce cortes escalonados en el DNA en el que se inserta, como se ilustra en la figura. Los cortes escalonados dejan fragmentos cortos de DNA de cadena simple a cada lado del elemento transponible. Luego la replicación del DNA de cadena simple produce las repeticiones directas flanqueantes.
En los extremos de muchos elementos transponibles (aunque no de todos) hay repeticiones terminales invertidas, que son secuencias que miden entre 9 y 40 pb de longitud y se complementan entre sí en forma invertida. Por ejemplo, las siguientes secuencias son repeticiones invertidas:
5’ -ACAGTTCAG...CTGAACTGT -3’
3’ -TGTCAAGTC...GACTTGACA -5’
En la misma cadena las dos secuencias no son inversiones simples (como podría pensarse a partir de su nombre) sino secuencias tanto invertidas como complementarias. (Obsérvese que la secuencia de izquierda a derecha en la cadena superior es la misma que la secuencia de derecha a izquierda en la cadena inferior.) Las enzimas que catalizan la transposición reconocen las repeticiones terminales invertidas y estas secuencias son necesarias para que se produzca la transposición. En la figura de abajo se resumen las características generales de los elementos transponibles.
(a) La mayoría de los elementos transponibles generan repeticiones directas flanqueantes a cada lado del punto de inserción en el DNA diana. Muchos elementos transponibles también poseen repeticiones invertidas terminales. (b) Estas representaciones de repeticiones directas e indirectas se utilizan en ilustraciones de todo este capítulo.
Clases de elementos transponibles
Tipos de ET (clase I) en procariotas según su
contenido
1. Transposón simple, secuencia de inserción o elemento de inserción (IS)
Contienen una secuencia central con información para la transposasa, una enzima necesaria para la transposición, y en los extremos una secuencia repetida en orden inverso.
Esta secuencia repetida en orden inverso no es necesariamente idéntica, aunque muy parecida. Cuando un transposón simple se integra en un determinado punto del ADN aparece una repetición directa de la secuencia diana (5-12 pb).
Un elemento IS termina en repeticiones terminales invertidas cortas; por lo general, las dos copias de la repetición están estrechamente relacionadas en lugar de idénticas.
Como se ilustra en la figura de la siguiente página, la presencia de las repeticiones terminales invertidas significa que se encuentra la misma secuencia que avanza hacia el elemento desde el ADN de flanqueo a cada lado de la misma. Cuando un elemento IS se transpone, se duplica una secuencia de ADN del huésped en el sitio de inserción. La naturaleza de la duplicación se revela comparando la secuencia del sitio objetivo antes y
después de que se haya producido una inserción.
La figura muestra que, en el sitio de inserción, el ADN IS siempre está flanqueado por repeticiones directas muy cortas. (En este contexto, "directo" indica que dos copias de una secuencia se repiten en la misma orientación, no que las repeticiones son adyacentes). Sin embargo, en el gen original (antes de la inserción), el sitio objetivo tiene la secuencia de solo una de estas repeticiones.
Después de la transposición, una copia de esta secuencia está presente a cada lado del transposón. La secuencia de la repetición directa varía entre los eventos de transposición individuales realizados por un transposón, pero la longitud es constante para cualquier elemento IS particular (un reflejo del mecanismo de transposición).
Por lo tanto, un elemento IS muestra una estructura característica en la que sus extremos se identifican por las repeticiones terminales invertidas, mientras que los extremos adyacentes del ADN huésped flanqueante se
identifican por las repeticiones directas cortas. Cuando se observa en una secuencia de ADN, este tipo de organización se toma como un diagnóstico de un transposón, y sugiere que la secuencia se originó en un evento de transposición.
Las repeticiones invertidas definen los extremos de un transposón. El reconocimiento de los extremos es común a los eventos de transposición patrocinados por todos los tipos de transposones de tipo ADN. Las mutaciones que actúan en cis que evitan la transposición se localizan en los extremos, que son reconocidas por una proteína(s) responsable de la transposición. La proteína se llama transposasa.
Inserción de elementos IS
La inserción de un transposón en un nuevo sitio se ilustra en la figura de la página siguiente. Consiste en hacer descansos escalonados en el ADN objetivo, unir el transposón a los extremos sobresalientes monocatenarios y rellenar los huecos. La generación y el llenado de los extremos escalonados explican la ocurrencia de las repeticiones directas del ADN objetivo en el sitio de inserción.
El escalonamiento entre los cortes en los dos filamentos determina la longitud de las repeticiones directas; por lo tanto, la característica de repetición objetivo de cada transposón refleja la geometría de la enzima implicada en el corte del ADN diana.
Características de las secuencias IS de procariotas
Los transposones bacterianos más simples se llaman secuencias de inserción (IS) (que reflejan la forma en que se detectaron). Cada tipo tiene el prefijo "IS" seguido de un número que identifica el tipo. (Las clases originales se numeraron de IS1 a IS4; las clases posteriores tienen números que reflejan la historia de su aislamiento, pero no corresponden a los más de 700 elementos identificados hasta el momento).
Los elementos IS son constituyentes normales de cromosomas y plásmidos bacterianos. Es probable que una cepa estándar de E. coli contenga varias (<10) copias de cualquiera de los elementos IS más comunes.
Para describir una inserción en un sitio particular, se usa un doble colon; por lo tanto, I::IS1 describe un elemento IS1 insertado en el fago lambda. La mayoría de los elementos IS se insertan en una variedad de sitios dentro del ADN del anfitrión. Algunos, sin embargo, muestran diversos grados de preferencia por puntos de acceso específicos. Los elementos IS son unidades autónomas, cada una de las cuales codifica solo las proteínas necesarias para patrocinar su propia transposición. Cada elemento IS es diferente en secuencia, pero hay algunas características comunes en la organización.
Si una de las IS está rota, el transposón no va a saltar jamás.
Transposones complejos
Un transposón complejo está formado por un par de transposones sencillos que saltan a la par. En ellos hay, en principio, cuatro secuencias de inserción: dos en los extremos y otras dos más en el interior. A diferencia de los transposones sencillos, solo necesitan las IS de los extremos para saltar; lo que pase con las secuencias de inserción de en medio da igual.
Esto ha hecho que en algunos casos se hayan degenerados las secuencias y elementos dentro de un transposón, porque solo se necesita uno de los genes de las transposasa. De ahí la capacidad de los transposones complejos para funcionar en trans.
ET en plásmidos
Transposición replicativa y conservativa
Algunos elementos transponibles se movilizan en forma de DNA (en lugar de transcribirse primero a RNA como transposones) y se denominan transposones de DNA (conocidos también como elementos transponibles de clase I). Otros elementos transponibles se movilizan en forma de un RNA intermediario. En este caso el elemento transponible (DNA) se transcribe a RNA y luego se vuelve a copiar a DNA usando una enzima especial denominada transcriptasa inversa. Los elementos que se transponen a través de un RNA intermediario se denominan retrotransposones (o transposones de clase II). La mayoría de los elementos transponibles hallados en las bacterias son transposones de DNA.
En los eucariontes se detectan tanto transposones de DNA como retrotransposones, aunque estos últimos son más frecuentes.
Los transposones de DNA pueden sufrir una transposición replicativa o no replicativa. La transposición replicativa consiste en la introducción de una copia nueva del elemento transponible en un sitio nuevo mientras que la copia vieja permanece en el sitio original, lo que determina el aumento del número de copias del elemento transponible como consecuencia de la transposición. La transposición no replicativa consiste en la escisión del elemento transponible del sitio donde se hallaba y su inserción en un sitio nuevo sin aumentar la cantidad de copias. La transposición no replicativa requiere la replicación de los pocos nucleótidos que constituyen las repeticiones directas. Los retrotransposones emplean solo la transposición replicativa.
Transposición conservativa (cortar y pegar)
En la transposición no replicativa el elemento transponible se mueve de un sitio a otro sin replicarse en su totalidad, aunque sí se replican secuencias cortas en el DNA en el que se produce la inserción que determinan la producción de repeticiones directas flanqueantes. A menudo denominada transposición de corte y pegado, la transposición no replicativa solo requiere el corte y la readhesión del elemento transponible en el DNA en el que se producirá la inserción.
¿Cómo se desarrollan los pasos de la transposición replicativa (formación y resolución de la cointegración)? La formación requiere que se produzcan cuatro fenómenos.
- En primer lugar, una enzima transposasa (con frecuencia codificada por el elemento transponible) produce rupturas de una sola cadena en cada extremo del elemento transponible y a cada lado de la secuencia donde se desea insertar este elemento (fig. 11-17 a y b).
- (^) En segundo lugar, los extremos libres del elemento transponible se unen a los extremos libres de la secuencia en cuestión (fig. 11-17c).
- En tercer lugar, se produce la replicación sobre los moldes de cadena simple a partir de los extremos 3’ de las cadenas simples y a través de los elementos transponibles (fig. 11-17 d y e).
Esta replicación genera la estructura de cointegración, con sus dos copias del elemento transponible y de la secuencia donde se va a realizar la inserción, que en este momento se ubican al lado de cada copia (fig. 11-17f). Las enzimas que desempeñan las funciones de replicación y de ligadura son enzimas celulares que actúan en la replicación y la reparación del DNA.
- En cuarto lugar, después de la formación de la estructura de cointegración ésta es sometida al proceso de resolución, que requiere el entrecruzamiento de sitios localizados dentro del transposón. La resolución origina las dos copias del elemento transponible (fig. 11-17g). El paso de resolución depende de las enzimas resolvasas (en algunos casos codificadas por el elemento transponible y en otros por un gen celular) que actúan en la recombinación homóloga.
Barbara McClintock fue la primera en descubrir los elementos
transponibles. Lo hizo trabajando con el color del maíz.
En este momento contamos con un examen detallado de los elementos Ac y Ds del maíz y sabemos que su estructura y su función son similares a las de los elementos transponibles hallados en las bacterias: son transposones de DNA que poseen repeticiones terminales invertidas y producen repeticiones directas flanqueantes en los sitios en los que se insertan.
Cada elemento Ac contiene un solo gen que codifica una enzima transposasa. Esto significa que los elementos Ac son autónomos, o sea que son capaces de transponerse. Los elementos Ds son elementos Ac con una o varias deleciones que inactivaron el gen que codifica la transposasa. Al no poder transponerse a sí mismos (no son autónomos) los elementos Ds solo pueden trasladarse en presencia de los elementos Ac que conservan las repeticiones terminales invertidas reconocidas por la Ac transposasa.
Cada grano de una espiga de maíz es un individuo separado que se origina como un óvulo fertilizado por un grano de polen. El patrón de pigmentación de un grano depende de la información presente en varios loci. Uno de los alelos codificadores de pigmento presente en uno de estos loci puede denominarse C y un alelo en el mismo locus que no confiere pigmento puede denominarse c. Cuando el grano tiene el genotipo cc es incoloro, es decir, amarillo o blanco (fig. 11-27a); un grano con genotipo CC o Cc producirá pigmento y será de color púrpura (fig. 11-27b).
Cuando un elemento Ds recibe la influencia de un elemento Ac aledaño y se transpone puede insertarse en el alelo C e inhibir su capacidad de producir pigmento (fig. 11-27c). Cuando el alelo se inactiva debido a la acción de un elemento transponible se le agrega una letra “t”; por consiguiente, en este caso se denominaría Ct. Después de la transposición de Ds en el alelo C , la célula del grano presenta el genotipo C (^) t. Este grano será incoloro (amarillo o blanco) porque ni el alelo ni el c le conferirán pigmento.
A medida que el organismo crece y el embrión unicelular del maíz se divide por mitosis pueden producirse transposiciones adicionales en algunas células. En cualquier célula en la que el elemento transponible se separe del alelo y se traslade a una localización nueva el alelo C volverá a ser funcional: todas las células derivadas de la célula en la que se produjo este evento tendrán el genotipo Ce y serán de color púrpura. La presencia de estas células pigmentadas rodeadas por células incoloras ( C (^) t ) determina la presencia de una
mancha o una raya púrpura (denominada sector) en un grano que de lo contrario habría sido amarillo (fig. 11-27d). El tamaño del sector varía de acuerdo con el momento en que se produce la escisión entre el elemento transponible y el alelo Ct. Si la escisión se produjo en un momento temprano del desarrollo muchas células conservarán el alelo C funcional y el sector pigmentado será grande; si la escisión se produjo en un
momento tardío del desarrollo pocas células conservarán el alelo C funcional y el sector pigmentado será pequeño.
represora se incorpora al citoplasma del óvulo y esto impide el desarrollo de transposiciones en el embrión y, por ende, la aparición de mutaciones. La descendencia resultante es fértil durante su adultez (fig. 11-29a). En cambio, una mosca hembra P- no produce el represor y no almacena este compuesto en el citoplasma de sus óvulos. Cuando se produce la fertilización de los óvulos con espermatozoides pertenecientes a moscas macho P+ la ausencia de represión permite que los elementos P aportados por los espermatozoides desarrollen una transposición rápida en el embrión y determinen la producción de disgenesia híbrida (fig. 11-29b).
Los elementos P se activan en la línea
germinal
La activación de los elementos P es específica del tejido. Ocurre solo en la línea germinal. Sin embargo, los elementos P se transcriben tanto en la línea germinal como en los tejidos somáticos. La especificidad tisular es conferida por un cambio en el patrón de empalme.
La figura de la derecha muestra la organización del elemento y sus transcripciones. La transcripción primaria se extiende por 2.5 o 3.0 kb, la diferencia probablemente refleje simplemente la filtración del sitio de terminación. Se pueden producir dos productos proteicos:
■ En los tejidos somáticos, solo se escinden los dos primeros intrones, creando una región de codificación de ORFO-ORF1-ORF2. La traducción de este ARN produce una proteína de 66 kD. Esta proteína es un represor de la actividad del transposón.
En los tejidos germinales, se produce un evento de corte y empalme adicional para eliminar el intrón 3. Esto conecta los cuatro marcos de lectura abiertos en un mRNA que se traduce para generar una proteína de 87 kD. Esta proteína es la transposasa.
La transposasa se produce en las células de la línea germinal por una maduración del mRNA en la que se elimina el intrón 3.
Si se mantiene el intrón 3 en el mRNA se obtiene una proteína represora.
Transposones clase II (retrotransposones)
Los retrotransposones se movilizan a través de RNA intermediarios. El retrotransposón es una molécula de DNA (fig. 11-18a) que primero se transcribe a una secuencia de RNA (fig. 11-18b), que puede sufrir algún tipo de procesamiento.
El RNA procesado es sometido a transcripción inversa mediante la acción de una enzima transcriptasa inversa para producir una copia del RNA en forma de DNA de doble cadena (fig. 11-18c).
El DNA en el que se va a producir la inserción se corta con extremos escalonados (fig. 11-18d) y la copia del retrotransposón en forma de DNA se inserta en el genoma (fig. 11-18e). La replicación llena los espacios cortos producidos por los cortes escalonados y genera repeticiones directas flanqueantes a ambos lados del retrotransposón.
La transcripción inversa de los retrotransposones (cis
y trans)
Tipos de retrotransposones
Los retroelementos se definen por el uso de mecanismos para la transposición que implican la transcripción inversa del ARN en el ADN. En el cuadro se distinguen tres clases de retroelementos: retrotransposones LTR, retroposones no-LTR y los SINE no autónomos.
Los retrotransposones LTR, o simplemente retrotransposones, tienen LTR y código para actividades de transcriptasa inversa e integrasa. Se reproducen de la misma manera que los retrovirus, pero difieren de ellos en no pasar por una forma infecciosa independiente.
Los retrotransposones no LTR, o retroposones, también tienen actividad de transcriptasa inversa pero constituyen una familia filogenéticamente distinta de elementos que emplean un mecanismo de transposición distinto. A diferencia de retrotransposones y retrovirus, los retroposones carecen de LTR y utilizan un mecanismo diferente de retrovirus para cebar la reacción de transcripción inversa. Se derivan de transcripciones de ARN polimerasa II. Una minoría de los elementos en un genoma dado es completamente funcional y puede transponerse de forma autónoma; otros tienen mutaciones y, por lo tanto, solo pueden transponerse como resultado de la acción de un elemento autónomo que actúa en trans. Los elementos más comunes de esta clase en el genoma humano son los LINEs.
Además de retrotransposones LTR y retroposones no LTR, muchos genomas contienen un gran número de secuencias cuyas características externas e internas sugieren que se originaron en secuencias de ARN. En estos casos, sin embargo, solo podemos especular sobre cómo se generó una copia de ADN. Suponemos que fueron objetivos para un evento de transposición mediante un sistema enzimático codificado en otro lugar, es decir, que siempre son no autónomos, y que se originaron en transcripciones celulares. No codifican las proteínas que tienen funciones de transposición. Los componentes más prominentes de esta familia se llaman elementos nucleares cortos intercalados (SINE). Estos elementos se derivan de transcripciones de ARN polimerasa III, habitualmente ARNs 7SL, 55 ARNr y ARNt. Muchos de estos elementos también incluyen partes de una LINE afín, lo que lleva a la hipótesis de que los SINE pueden usar la maquinaria enzimática de LINE para la replicación.
Características estructurales de retrovirus y
retrotransposones
Estructura del genoma de retrovirus:
■ Los genes gag ( group specific antigen ) codifican la matriz viral (MA), la cápsida (CA) y las nucleoproteínas (NC)
■ Los genes pol codifican la transcriptase inversa (RT) y otras polimerasas
■ Los genes env codifican la envoltura lipídica protectora
■ LTRs: long terminal repeats
Los elementos Ty se parecen a los retrovirus
■ Los transposones Ty tienen una organización similar a los retrovirus endógenos.
■ Los transposones Ty son retrotransposones (con actividad de transcriptasa inversa) que se transponen a través de un intermedio de ARN.
Los elementos Ty (sigla que corresponde a transposón de la levadura [ yeast en inglés]) constituyen una familia de elementos transponibles comunes en las levaduras; muchas células de levadura tienen 30 copias de los elementos Ty. Estos elementos son retrotransposones que poseen alrededor de 6 300 pb de longitud y producen repeticiones directas flanqueantes de 5 pb cuando se insertan en el DNA. En cada extremo de un elemento Ty hay repeticiones directas denominadas secuencias delta que miden 334 pb de longitud. Las secuencias delta son análogas a las repeticiones terminales largas halladas en los retrovirus. Estas secuencias delta contienen promotores necesarios para la transcripción de los genes Ty y los promotores también pueden estimular la transcripción de genes localizados en dirección 3’ con respecto al elemento Ty. Entre las
